Calorespirometry: Een krachtige, Noninvasive benadering onderzoeken van cellulaire energiemetabolisme

De algemene doelen van deze procedure zijn om de metabolische activiteit van een biologisch monster te analyseren en om te bepalen in welke mate anaërobe routes bijdragen aan de cellulaire energieproductie binnen het monster. Deze methode kan helpen om belangrijke vragen in het farmaceutische veld te beantwoorden over de mate van mitochondriale toxiciteit tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de gelijktijdige meting van zuurstofverbruik en warmteproductie in een celmonster van belang mogelijk maakt.

Deze methode kan dus inzicht bieden in de behandelingsplanning tijdens de farmaceutische ontwikkeling. Het kan ook worden toegepast op andere gebieden, zoals cryobiologie waarin de effecten van metabolische preconditioning op cryopresevering kunnen worden beoordeeld. Om het respirometer voor te bereiden, voegt u eerst twee-punt-twee milliliter DMEM toe aan elke respirometerkamer en brengt u de stoppen volledig in.

Stel de stoppen met een stop-afstandsstuk af om optimale zuurstofdiffusie naar het medium mogelijk te maken, en stel de kamers in om de monsters continu te roeren bij 750 rpm bij 37 graden Celsius totdat de zuurstofconcentratie en de zuurstofflux stabiel zijn. Bevestig dat de respirometersoftware is geprogrammeerd om rekening te houden met de zuurstofoplosbaarheid van het medium dat in het experiment wordt gebruikt. Selecteer vervolgens een stabiele sectie van de zuurstofconcentratiecurve en kalibreer deze sectie voor 100% luchtverzadiging.

Sluit nu de stoppen, zorg ervoor dat er geen bubbels in de kamers aanwezig zijn. Na ongeveer 10 minuten zou een stabiele zuurstofflux moeten worden waargenomen. Om voor te bereiden op calorimetrie, voegt u eerst twee-punt-vijf milliliter gedeïoniseerd water toe aan de referentie-ampul en draait u vervolgens de dop vast.

Verwijder met behulp van een luchtpomp extern puin uit de ampul en laat de ampul langzaam zakken naar positie één in het referentiekanon van de calorimeter. De ampul blijft op positie één staan totdat de ampul met het cellenmonster is voorbereid. DMEM, dat voor calorimetrie wordt gebruikt, moet worden geëquilibreerd in een incubator van 37 graden Celsius met een bevochtigde atmosfeer en 5% CO2.

Begin het experiment door drie milliliter DMEM toe te voegen aan een 100-milliliter plaat voor elke calorimetrische ampul die zal worden gebruikt, en plaats de plaat in de incubator totdat het monster klaar is voor calorimetrie. Terwijl het medium in evenwicht is, gebruikt u een omgekeerde microscoop om een plaat met HepG2-cellen te selecteren die tussen de 60 en 80%confluent zijn en homogeen verdeeld zijn. Verwijder eerst het celkweekmedium en was de cellen twee keer met 10 milliliter PBS.

Voeg drie milliliter voorverwarmd trypsine toe bij 37 graden Celsius en incubeer de plaat bij 37 graden Celsius. Na zeven tot 10 minuten incubatie, neutraliseert u de enzymatische reactie met drie milliliter DMEM van 37 graden Celsius en gebruikt u een vijf-milliliter pipette om de cellen voorzichtig te dissociëren in een enkele celsuspensie. Breng de cellen over in een steriele 15-milliliter conische buis voor centrifugatie en suspendeer de pallet in ongeveer vijf milliliter verse DMEM.

Pipetter de cellen grondig om eventuele celclusters te dissociëren, en concentreer de cellen na het tellen tot ongeveer twee miljoen cellen per 50 microliter medium. De reproduceerbaarheid van deze methode is afhankelijk van consistente en nauwkeurige celtellingen. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat het monster homogeen is en dat cellen op geen enkel moment tijdens de analyse geclusterd zijn.

Bewaar vervolgens de cellen op ijs totdat u klaar bent om respirometrische en calorimetrische metingen uit te voeren. Bevestig voor de calorimetrische meting dat de calorimeter is aangesloten op de computer en dat het calorimetrische signaal stabiel is en in microwatts. Verdun de cellen tot 100.000 cellen per milliliter in het geëquilibreerde medium dat voorafgaand aan de monstervoorbereiding in de incubator is geplaatst.

Voeg vervolgens twee-punt-vijf milliliter celoplossing toe aan elke ampul en bevestig dat er een voldoende volume lucht wordt gehandhaafd tussen de deksels van de ampullen en het medium om gasdiffusie mogelijk te maken. Draai onmiddellijk de doppen vast en reinig de afgesloten ampullen met lucht om eventueel extern puin te verwijderen. Laat vervolgens de afgesloten ampul met het celmonster langzaam zakken naar positie één van de calorimeter.

Meng het monster grondig om een homogene oplossing te garanderen en injecteer twee miljoen cellen in elke gesloten kamer van de respirometer onder continue roering. Na 15 minuten op positie één in de calorimeter, laat u zowel de referentie-ampul als de ampul met de cellen langzaam zakken naar positie twee en noteert u het tijdstip van het zakken. 10 tot 15 minuten nadat de cellen in de respirometer zijn geïnjecteerd, moet een stabilisatie van de zuurstofflux en een gestage afname van de zuurstofconcentratie worden waargenomen.

Om de lekademhaling te bepalen, injecteert u één microliter van vier milligram per milliliter oligomycine in elke kamer en laat u de zuurstofflux gedurende ongeveer 10 minuten stabiliseren, waarbij u de stabiele lekademhalatiesnelheid vastlegt zoals zojuist is aangetoond. Om vervolgens de maximale flux te bepalen, injecteert u twee microliters van nul-punt-twee millimolair FCCP in de kamer, waarbij u de zuurstofflux laat stabiliseren na elke injectie en de titraties doorzet totdat de maximale flux is bereikt. Noteer de stabiele ademhalingssnelheid tijdens de maximale flux.

Wanneer de respirometerkamer voorafgaand aan de monstermeting werkt, moeten zowel de zuurstofconcentratie als de zuurstoffluxcurven stabiel zijn. Nadat de ampul naar positie twee is gezakt, kan een tijdsperiode worden geïdentificeerd waarin de warmteproductie stabiel is en kan een overeenkomstige tijd worden geïdentificeerd waarin de zuurstofflux stabiel is, om de berekening van de calorespirometrische verhouding mogelijk te maken. Als de HepG2-cellen worden gekweekt in afwezigheid van glucose en galactose wordt toegevoegd om de mitochondriale betrokkenheid te verhog