Name: Een stroom Cytometry gebaseerde Assay voor het meten van de Mitochondriale membraanpotentiaal in cardiale Myocytes na Hypoxia/heroxygenatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Leer hoe u de mitochondriale membraanpotentiaal in humane cardiale myocyten meet na hypoxie/heroxygenatie met JC-1-kleuring en flowcytometrie. Deze methode evalueert beschermende middelen tegen celbeschadiging.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Deze studie werd ondersteund door subsidies van de nationale sleutel Research en Development programma van China (nr. 2017YFC1700503), de National Basic Research Program (973 programma) van China (No.2012CB518602), de nationale Natural Science Foundation van China (nr. 81370223 en nr. 81573957), en de gediplomeerden innovatieve Research Foundation van Peking Unie Medical College (2016-1002-01-02).

1. bereiding van reagentia en oplossingen
<ol><li>Bereiden menselijk cardiale myocytes (HCMs) volledige medium door 25 mL van Myocyte groeimedium supplement mix toe te voegen aan 500 mL Myocyte groeimedium volgens de instructies van de fabrikant. Bewaren bij 4 ° C en warm tot 37 ° C alvorens het te gebruiken.</li>
	<li>Bereid Tongxinluo (TXL)-oplossing door het oplossen van TXL ultrafijn poeder in/glucose serumvrij Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) en de concentratie van TXL tot 400 µg/mL aanpassen door het toevoegen van DMEM (voor meer details, Zie11). Bewaren bij 4 ° C en warm tot 37 ° C alvorens het te gebruiken.</li>
	<li>Bereiden 5 mL van de werkoplossing JC-1 door toevoeging van 25 µL van JC-1 stockoplossing (200 x), ultrazuiver water 4 mL en 1 mL voorraad kleuring buffer (5 x) in een centrifugebuis 15 mL in het donker. Pipetteer van het mengsel op en neer meerdere malen en warm tot 37 ° C alvorens het te gebruiken.</li>
	<li>30 mL kleuring buffer te werken door 24 mL ultrazuiver water toe te voegen aan 6 mL voorraad kleuring buffer (5 x) in een centrifugebuis 50 mL voor te bereiden. Gebruik deze ijskoude oplossing.</li>
</ol>2. deinvoeringvan Hypoxia/heroxygenatie Model
<ol><li>Plaat 1.0 x 105 cellen per putje met HCM compleet medium in een 6 goed bord. Groeien tot een confluentie van ongeveer 70% in een incubator van de cel met 5% CO2 en 95% lucht bij 37 ° C.</li>
	<li>Wassen HCMs met fosfaat buffer zoutoplossing (PBS). Hen bloot te stellen aan verschillende behandelingen (400 µg/mL TXL of niet) in 2 mL zuiver/glucose serumvrij DMEM gedurende 30 minuten voorafgaand aan hypoxie in een incubator van de cel met 5% CO2 en 95% lucht bij 37 ° C.</li>
	<li>Incubeer HCMs in een luchtdicht en hypoxische pot (2,5 L) voorzien van een katalysator voor het opruimen van vrije zuurstof en induceren hypoxie voor 18u (figuur 1A), en een anaërobe indicator om te meten de zuurstof-spanning in de middelgrote11,-12, 13, in een cel incubator met 5% CO2 en 95% lucht bij 37 ° C. Opmerking: Het duurt ongeveer 1,5 uur voor de katalysator voor het opruimen van vrije zuurstof in de pot. Daarom worden de HCMs bewaard in de pot voor 19.5 h voordat de pot wordt geopend. De kleur van anaërobe indicator verandert van lichtblauw in normoxic omgeving bleke wit in hypoxische voorwaarde (figuur 1B).</li>
	<li>Reoxygenate HCMs door het bewegen van de 6 goed plaat in een incubator ingesteld bij 37 ° C met 5% CO2 en 95% lucht voor 2 h.</li>
</ol>3. bereiding van HCMs Stroom Cytometry
<ol><li>Warm de 0,25% trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing en PBS tot 37 ° C.</li>
	<li>Gecombineerd medium uit elk putje, spoel de cellen met 1 mL PBS en Voeg 0,5 mL van 0,25% trypsine langs de muur van de waterput.</li>
	<li>Incubeer bij 37 ° C, totdat alle HCMs bijna vrijstaand (ongeveer 1 minuut zijn).</li>
	<li>Voeg 1 mL van DMEM compleet medium (DMEM gemiddeld met 10% foetale runderserum) om de putten te neutraliseren de trypsine. De celsuspensie overbrengen in een centrifugebuis 15 mL- and -pellet HCMs door centrifugatie bij 500 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Zorgvuldig gecombineerd de bovendrijvende vloeistof zonder de pellet te verstoren.</li>
	<li>Voeg 0,5 mL van HCM compleet medium en 0,5 mL van de werkoplossing JC-1 aan elke buis. Resuspendeer de HCMs door pipetteren omhoog en omlaag.</li>
	<li>Betrekking hebben op de hele buizen met aluminiumfolie om te voorkomen dat bleken van de TL-indicator en incubeer HCMs in normale omstandigheden (bij 37 ° C met 5% CO2 en 95% lucht) gedurende 20 min.</li>
	<li>Pellet HCMs door centrifugatie bij 500 x g gedurende 3 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Spoel HCMs tweemaal met 2 mL ijskoud JC-1 kleuring buffer.</li>
	<li>Resuspendeer HCMs in een eindvolume van 300 µL van ijskoude kleuring buffer in het monsterbuisje (12 mm x 75 mm) en de cellen gebruiken voor de analyse binnen 30 min. Opmerking: Gebruik carbonyl cyanide m-chlorofenyl hydrazon (CCCP), een krachtige remmer van respiratoire elektronentransport keten, voor de behandeling van HCMs gedurende 1 uur bij een concentratie van 20 µM, voor de positieve controle.</li>
</ol>4. flow Cytometer Setup
<ol><li>Start de stroom cytometer en zorg ervoor dat de software is verbonden met het.</li>
	<li>Fluidics opstarten, start de stream en instellen van de breakoff.</li>
	<li>Geopende vensters door twee dot-perceel in de stroom cytometry software.<ol>
<li>Selecteer voorwaartse verstrooid licht (FSC) op de X-as en kant verstrooid licht (SSC) op de Y-as in de eerste stip plot te vertegenwoordigen de kenmerken van de cellen in termen van hun omvang en hun granulariteit, respectievelijk.</li>
		<li>Kies de PE (575 ± 26 nm) detectie zender voor de Y-as en de FITC (530 ± 30 nm) voor de X-as een logaritmische schaal met het tweede punt perceel, die wordt gebruikt voor het meten van de intensiteit van de fluorescentie van JC-1 kleurstof in de cellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Stroom Cytometry meting en analyse van gegevens
<ol><li>Klik op Laden ongedaan maken om te laten uit de buis steun arm en plaats de lege (HCMs die niet hebben zijn geverfd met JC-1) buis op het monster. Klik op Load om terug te keren van de slingerarm buis naar de positie van haar werken.</li>
	<li>Klik op Record om de deeltjes van de suspensie in het lege monsterbuisje verzamelen en vervolgens de celpopulatie (P1) poort voor verdere analyse in de eerste stip plot (Figuur 3).</li>
	<li>HCMs in andere buizen monster te verzamelen en optimaliseren van de meting door de spanningen van fluorescentie kanalen, om ervoor te zorgen dat de cel stip is gelegen in het centrale gedeelte van de tweede tekening van de dot aan te passen.</li>
	<li>De statistieken van elk monsterbuisje weergeven en berekenen de MMP van elk monster door te delen van de verhouding tussen de intensiteit van de rode fluorescentie door groene fluorescentie intensiteit.</li>
</ol>

<ol><li>Anderson, J. L., Morrow, D. A. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1606915">Acute Myocardial Infarction.</a> New England Journal of Medicine. 376 (21), 2053-2064 (2017).</li>
<li>Ibanez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ESC+Guidelines+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation%3A+The+Task+Force+for+the+management+of+acute+myocardial+infarction+in+patients+presenting+with+ST-segment+elevation+of+the+European+Society+of+Cardiology+%28ESC%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">ESC Guidelines for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation: The Task Force for the management of acute myocardial infarction in patients presenting with ST-segment elevation of the European Society of Cardiology (ESC).</a> European Heart Journal. 39 (2), 119-177 (2017).</li>
<li>Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Myocardial reperfusion injury.</a> New England Journal of Medicine. 357 (11), 1121-1135 (2007).</li>
<li>Ong, S. B., Samangouei, P., Kalkhoran, S. B., Hausenloy, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+pore+and+its+role+in+myocardial+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition pore and its role in myocardial ischemia reperfusion injury.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 78, 23-34 (2015).</li>
<li>Heusch, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+cardioprotection%3A+signal+transduction+in+ischemic+pre-%2C+post-%2C+and+remote+conditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of cardioprotection: signal transduction in ischemic pre-, post-, and remote conditioning.</a> Circulation Research. 116 (4), 674-699 (2015).</li>
<li>Cossarizza, A., Ceccarelli, D., Masini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heterogeneity+of+an+isolated+mitochondrial+population+revealed+by+cytofluorometric+analysis+at+the+single+organelle+level%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Functional heterogeneity of an isolated mitochondrial population revealed by cytofluorometric analysis at the single organelle level.</a> Experimental Cell Research. 222 (1), 84-94 (1996).</li>
<li>Ward, M. W., Rego, A. C., Frenguelli, B. G., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+and+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+cerebellar+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential and glutamate excitotoxicity in cultured cerebellar granule cells.</a> Journal of Neuroscience. 20 (19), 7208-7219 (2000).</li>
<li>Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+probes+and+the+proton+gradient%3A+a+practical+usage+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide.</a> Biotechniques. 50 (2), 98-115 (2011).</li>
<li>Cossarizza, A., Salvioli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+using+JC-1%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of mitochondrial membrane potential using JC-1.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9 Unit 9 14(2001).</li>
<li>Salvioli, S., Ardizzoni, A., Franceschi, C., Cossarizza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JC-1%2C+but+not+DiOC6%283%29+or+rhodamine+123%2C+is+a+reliable+fluorescent+probe+to+assess+delta+psi+changes+in+intact+cells%3A+implications+for+studies+on+mitochondrial+functionality+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">JC-1, but not DiOC6(3) or rhodamine 123, is a reliable fluorescent probe to assess delta psi changes in intact cells: implications for studies on mitochondrial functionality during apoptosis.</a> FEBS Letters. 411 (1), 77-82 (1997).</li>
<li>Chen, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+miR-128-3p+by+Tongxinluo+Protects+Human+Cardiomyocytes+from+Ischemia%2Freperfusion+Injury+via+Upregulation+of+p70s6k1%2Fp-p70s6k1%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of miR-128-3p by Tongxinluo Protects Human Cardiomyocytes from Ischemia/reperfusion Injury via Upregulation of p70s6k1/p-p70s6k1.</a> Frontiers in Pharmacology. 8, 775(2017).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+autophagy+by+Tongxinluo+through+the+MEK%2FERK+pathway+protects+human+cardiac+microvascular+endothelial+cells+from+hypoxia%2Freoxygenation+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cardiovascular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Induction of autophagy by Tongxinluo through the MEK/ERK pathway protects human cardiac microvascular endothelial cells from hypoxia/reoxygenation injury.</a> Journal of Cardiovascular Pharmacology. 64 (2), 180-190 (2014).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidic+acid+protects+mesenchymal+stem+cells+against+hypoxia+and+serum+deprivation-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidic acid protects mesenchymal stem cells against hypoxia and serum deprivation-induced apoptosis.</a> Stem Cells. 26 (1), 135-145 (2008).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/9/pdb.prot065490.short">Labeling mitochondria with JC-1.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (9), (2011).</li>
<li>Pravdic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetic-induced+preconditioning+delays+opening+of+mitochondrial+permeability+transition+pore+via+protein+Kinase+C-epsilon-mediated+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Anesthetic-induced preconditioning delays opening of mitochondrial permeability transition pore via protein Kinase C-epsilon-mediated pathway.</a> Anesthesiology. 111 (2), 267-274 (2009).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+Excessive+Histone+Deacetylases+Activity+in+Diabetic+Hearts+Attenuates+Myocardial+Ischemia%2FReperfusion+Injury+via+Mitochondria+Apoptosis+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Diabetes+Research%22%5BJournal%5D)">Suppression of Excessive Histone Deacetylases Activity in Diabetic Hearts Attenuates Myocardial Ischemia/Reperfusion Injury via Mitochondria Apoptosis Pathway.</a> Journal of Diabetes Research. 2017, 8208065(2017).</li>
<li>Qiu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Curcumin-induced+melanoma+cell+death+is+associated+with+mitochondrial+permeability+transition+pore+%28mPTP%29+opening%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Curcumin-induced melanoma cell death is associated with mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 448 (1), 15-21 (2014).</li>
<li>Zhen, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P53+dependent+mitochondrial+permeability+transition+pore+opening+is+required+for+dexamethasone-induced+death+of+osteoblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">P53 dependent mitochondrial permeability transition pore opening is required for dexamethasone-induced death of osteoblasts.</a> Journal of Cell Physiology. 229 (10), 1475-1483 (2014).</li>
<li>Nazarewicz, R. R., Dikalova, A. E., Bikineyeva, A., Dikalov, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nox2+as+a+potential+target+of+mitochondrial+superoxide+and+its+role+in+endothelial+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nox2 as a potential target of mitochondrial superoxide and its role in endothelial oxidative stress.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 305 (8), H1131-H1140 (2013).</li>
<li>Wang, T., Zhang, Z. X., Xu, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+mitochondrial+KATP+channel+on+voltage-gated+K%2B+channel+in+24+hour-hypoxic+human+pulmonary+artery+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Medical+Journal+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Effect of mitochondrial KATP channel on voltage-gated K+ channel in 24 hour-hypoxic human pulmonary artery smooth muscle cells.</a> Chinese Medical Journal (Engl). 118 (1), 12-19 (2005).</li>
<li>Kuter, N., Aysit-Altuncu, N., Ozturk, G., Ozek, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Neuroprotective+Effects+of+Hypothermia+on+Bilirubin-Induced+Neurotoxicity+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neonatology%22%5BJournal%5D)">The Neuroprotective Effects of Hypothermia on Bilirubin-Induced Neurotoxicity in vitro.</a> Neonatology. 113 (4), 360-365 (2018).</li>
<li>Zheng, Y. Y., Wang, M., Shu, X. B., Zheng, P. Y., Ji, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+activation+by+Jiang+Zhi+Granule+protects+against+metabolic+stress-induced+hepatocyte+injury%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Autophagy activation by Jiang Zhi Granule protects against metabolic stress-induced hepatocyte injury.</a> World Journal of Gastroenterology. 24 (9), 992-1003 (2018).</li>
<li>El Gamal, H., Eid, A. H., Munusamy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renoprotective+Effects+of+Aldose+Reductase+Inhibitor+Epalrestat+against+High+Glucose-Induced+Cellular+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Renoprotective Effects of Aldose Reductase Inhibitor Epalrestat against High Glucose-Induced Cellular Injury.</a> Biomed Research International. 2017, 5903105(2017).</li>
<li>Renault, T. T., Luna-Vargas, M. P., Chipuk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+Liver+Mitochondria+Isolation%2C+Size+Fractionation%2C+and+Real-time+MOMP+Measurement%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Mouse Liver Mitochondria Isolation, Size Fractionation, and Real-time MOMP Measurement.</a> Bio-Protocols. 6 (15), (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een protocol dat gebruikmaakt van JC-1 kleurstof te beoordelen van de MMP van cellen na wordt blootgesteld aan H/R. gedetecteerd door JC-1 test, de MMP van cellen is niet afhankelijk van factoren zoals de mitochondriale grootte, vorm en dichtheid die invloed op één-component fluorescentie hebben kan 14-signalen. Bijgevolg zijn de resultaten van JC-1 assay relatief betrouwbaar. Bovendien, het is handig en tijdbesparend voor het uitvoeren van de bepaling van de JC-1. Deze bepalin...

Coronaire hartziekte is de belangrijkste oorzaak van overlijden wereldwijd. De behandeling van keuze is voor vermindering van ischemische schade en de beperking van de grootte van het infarct in patiënten met ST-segment myocardiaal infarct verheven tijdige en effectieve myocardiale reperfusie via primaire percutane coronaire interventie (PCI)1, 2. Reperfusie veroorzaakt echter bijkomende schade, die kan goed zijn voor maximaal 30% van het laatste infarct grootte3. Het is algemeen erkend dat de mitochondriale permeabiliteit overgang porie (mPTP) niet alleen centraal in mitochondriale schade en cel dood tijdens ischemie/reperfusie is (Ik / R), maar is ook een convergerende doel van bescherming signalering4 , 5. als de mPTP-opening over depolarisatie van de innerlijke mitochondriale membraan potentiële (MMP)4 brengen zou, we ontdekt mPTP openen met behulp van de 5, 5 ', 6, 6 '-Tetrachloro-1, 1, 3, 3 '-tetraethyl-imidacarbocyanineiodide (JC-1) assay.
De bepaling van de JC-1 is een cytofluorimetric methode die zowel kwalitatief als kwantitatief, en het verder is gevalideerd door het analyseren van de MMP op het niveau van een enkele mitochondriën6. JC-1 bestaat als een geaggregeerde vorm, de opbrengst van een rood tot oranje gekleurde emissie (590 ± 17,5 nm) in de matrix van mitochondriën met normale MMP; met het verlies van MMP, wordt JC-1 geconverteerd naar de monomere vorm die groene fluorescentie met een uitstoot van 530 ± 15 nm levert. Dus een daling in de verhouding rood/groen fluorescentie intensiteit kan duiden op de verlaging van MMP in omstandigheden zoals ischemie/reperfusie (Ik / R).
Naast JC-1, is MMP ook bestudeerd met membraan-permeabele lipofiele kationen zoals Rhodamine 123 en 3, 3 '-dihexyloxadicarbocyanine jodide [DiOC6(3)]. Echter, vergeleken met deze twee sondes, JC-1 is meer betrouwbaar voor het analyseren van MMP. Rhodamine 123 heeft relatief arme gevoeligheid (vooral in het blussen van mode7,8) en slechte specificiteit. De verschuiving in rhodamine 123 is soms zo klein dat het is moeilijk voor onderzoekers of apparatuur om te observeren/detecteren. Bovendien, in een enkele cel, er zijn verschillende mitochondrion bandplaatsen voor rhodamine 123 en dus dat het verschillende fluorescentie emissies9kan hebben. DiOC6(3) wordt niet aanbevolen voor het opsporen van MMP hetzij als het gevoelig op de depolarisatie van plasmamembraan10 reageert.
Daarom hier gebruiken we de JC-1-test om te beoordelen de MMP van HCMs na wordt blootgesteld aan hypoxie/heroxygenatie met of zonder een beschermende agent.

<table><tbody><tr><td>Mitochondrial membrane potential assay kit with JC-1</td><td>Beyodtime, China</td><td>C2006</td><td>In de kit zijn er JC-1 stockoplossing (200&times;), stock kleuringsbuffer (5&times;) en CCCP(10mM)</td></tr><tr><td>Tongxinluo ultrafijn poeder</td><td>Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical Co., China</td><td>071201</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-FITC/PI Kit</td><td>Becton-Dickinson, USA</td><td>556547</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies, Grand Island Biological Company, USA</td><td>11966-025</td><td></td></tr><tr><td>Menselijke hartmyocyt</td><td>Promocell, Duitsland</td><td>C-12810</td><td></td></tr><tr><td>Myocyt Groei Medium (SupplementMix)</td><td>Promocell, Duitsland</td><td>C-39275</td><td></td></tr><tr><td>Myocyt Groei Medium (Klaar-voor-gebruik)</td><td>Promocell, Duitsland</td><td>C-22070</td><td>gebruikt met Myocyt Groei Medium SupplementMix</td></tr><tr><td>GENbox</td><td>BioM&eacute;rieux, Marcy l&rsquo;Etoile, Frankrijk</td><td>96127</td><td>2.5L</td></tr><tr><td>Katalysator (AnaeroPack)</td><td>MITSUBISHI GAS CHEMICAL&nbsp;COMPANY, INC.&nbsp;, Japan</td><td>&nbsp;C-1</td><td></td></tr><tr><td>Anaërobe indicator</td><td>BioM&eacute;rieux, Marcy l&rsquo;Etoile, Frankrijk</td><td>96118</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>Becton-Dickinson, USA</td><td>FACSAria 2</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>Becton-Dickinson, USA</td><td></td><td>Versie8.0.1</td></tr><tr><td>Sample tube</td><td>Corning science, USA</td><td>352054</td><td>12*75mm</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone, USA</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr></tbody></table>

een stroom cytometry gebaseerde assay voor het meten van de mitochondriale membraanpotentiaal in cardiale myocytes na hypoxia/heroxygenatie

A Flow Cytometry-based Assay for Measuring Mitochondrial Membrane Potential in Cardiac Myocytes After Hypoxia/Reoxygenation

Tijdige en efficiënte reperfusie van de afgesloten kransslagader is de beste strategie voor het verkleinen van het myocard infarct bij patiënten met een ST-segment verheven myocardiaal infarct. Echter kan reperfusie per se resulteren in verdere cardiomyocyte dood, een fenomeen dat bekend staat als reperfusie letsel. De opening van de mitochondriale permeabiliteit overgang porie (mPTP), met een daling van de Mitochondriale membraanpotentiaal (MMP) of een mitochondriale depolarisatie, is algemeen erkend als de laatste stap van reperfusie letsel en is verantwoordelijk voor mitochondriale en dood van de cardiomyocyte. JC-1 is een lipofiele kationogene kleurstof dat zich in de mitochondriën afhankelijk van de waarde van MMP ophoopt. Hoe hoger de MMP is, hoe meer JC-1 hoopt zich op in de mitochondriën. De stijgende hoeveelheden voor JC-1 in de mitochondriën kunnen worden weergegeven door een verschuiving van de emissie fluorescentie van groen (~ 530 nm) tot rood (~ 590 nm). Dus, de vermindering van de fluorescentie van de rood/groen intensiteit verhouding kunt aangeven de depolarisatie van de mitochondriën. Hier, nemen wij voordeel van JC-1 voor het meten van MMP, of de opening van mPTP in menselijke cardiale myocytes na hypoxia/heroxygenatie, ontdekt door stroom cytometry.

Voordat u de JC-1 bepaling ter evaluatie van de veranderingen van MMP uitvoert, is het sterk aanbevolen dat proeven worden verricht om te bevestigen met succes de voorwaarden vastgesteld door de onderzoekers. Zoals blijkt uit de stroom cytometry resultaten (Figuur 2), in vergelijking met de normale groep, hypoxie/heroxygenatie (H/R) aanzienlijk geïnduceerde de apoptosis van HCMs (Annexine V + /PI±), die aangeeft dat wij een cel-gebaseerde model van I had geve...

Hier presenteren we een protocol dat gebruikmaakt van JC-1 kleurstof te beoordelen van de Mitochondriale membraanpotentiaal van cellen na wordt blootgesteld aan hypoxie/heroxygenatie met of zonder een beschermende agent.

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay voor het meten van de Mitochondriale membraanpotentiaal in cardiale Myocytes na Hypoxia/heroxygenatie

Timely and efficient reperfusion of the occluded coronary artery is the best strategy for decreasing myocardial infarct size in patients with a ST-segment ...

Deze methode kan helpen om het effect van hypoxie/reoxygenatie op cellen in het mitochondriale membraanpotentieel te meten, en het kan worden gebruikt om te evalueren of een middel beschermend is tegen een verwonding. Het grote voordeel van deze test is dat het MMP dat erdoor wordt gedetecteerd, in het geval van factoren zoals mitochondriale grootte is. Bovendien heeft het een lage vereiste voor materialen en de helderheid.Begin met 70% confluente humane hartspiercellen in een zes-putsplaat. Na het wassen van de cellen met fosfaatbufferoplossing, voeg medicijn of voertuig toe in twee milliliter serum- en glucosevrij DMEM. Incubeer in een cellencultuurincubator met 5%CO2 en 95% lucht bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten voorafgaand aan hypoxie.Na 30 minuten plaats de schaal met humane hartspiercellen in een 2,5 liter luchtdichte anhypxische pot. Voorzien van een katalysator om vrij zuurstof af te vangen, en een anaërobe indicator om de zuurstofspanning in het medium te meten. Plaats de pot in de weefselkweekincubator.De kleur van de anaërobe indicator verandert van lichtblauw in een normoxische omgeving naar licht wit in hypoxische omstandigheden. Reoxygeneer de humane hartspiercellen door de zes-putsplaat uit de pot te verwijderen en deze twee uur op de incubator te plaatsen. Na de reoxygenatie, spoel de cellen met één milliliter voorverwarmd PBS en voeg 0,5 milliliter voorverwarmde 25% trypsine toe langs de wand van de put.Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende ongeveer een minuut totdat alle humane hartspiercellen bijna loskomen. Voeg vervolgens één milliliter DMEM compleet medium toe aan de putten om de trypsine te neutraliseren. Breng de celsuspensie over in een 15 milliliter centrifugeerbuis en pellet HCMs door centrifugatie gedurende drie minuten bij 500 keer G, bij kamertemperatuur.Na centrifugatie, zuigt voorzichtig het supernatant af zonder de pellets te verstoren. Voeg vervolgens 5 milliliter humane hartspiercel complete medium en 5 milliliter JC-1 werkoplossing toe aan elke buis. Resuspendeer de HCMs door op en neer te pipetteren.Dek de buizen af met aluminiumfolie om verbleking van de fluorescerende indicator te voorkomen, en incubeer de cellen onder normale omstandigheden gedurende 20 minuten. Na het pellen van de humane hartspiercellen door centrifugatie gedurende drie minuten in een centrifuge voorgekoeld tot vier graden Celsius, spoel de cellen twee keer met twee milliliter ijskoud JC-1-kleuringsbuffer. Na de tweede spoeling, resuspendeer de humane hartspiercellen in 300 microliter ijskoud kleuringsbuffer.En filter de monsters in de respectieve monsterbuizen. Analyseer de cellen binnen 30 minuten met doorstromingscytometrie. Start de flowcytometer en zorg ervoor dat de software is verbonden.Voer de vloeistofstart uit. Start de stroom en stel de break-off in. Open twee dotplot-vensters in de flowcytometriesoftware.Selecteer voorwaarts verstrooid licht op de X-as en zijwaarts verstrooid licht op de Y-as in de eerste dotplot. Om de kenmerken van de cellen in termen van hun grootte en korrelvorming te representeren. Selecteer het PE-detectiekanaal voor de Y-as.En FITC voor de X-as, met behulp van een logaritmische schaal in de tweede dotplot, die wordt gebruikt om de fluorescenditekracht van JC-1-kleurstof in de cellen te meten. Klik op ontladen om de buisondersteuningsarm te laten uitkomen en plaats de lege monsterbuis die humane hartspiercellen bevat die niet zijn gekleurd met JC-1. Klik op laden om de ondersteuningsarm terug te brengen naar zijn werkpositie.Klik op opnemen om deeltjes uit de suspensie in de lege monsterbuis te verzamelen. En pas de spanningen van de fluorescendiekanalen in de tweede dotplot aan. Gate de celpopulatie voor verdere analyse in de eerste dotplot.Analyseer vervolgens de humane hartspiercellen. Geef de statistieken van elke monsterbuis weer en bereken de MMP's van elk monster door de verhouding van de rode fluorescenditekracht te delen door die van de groene fluorescenditekracht. Hypoxie en reoxygenatie induceren significant apoptose van humane hartspiercellen, vergeleken met normale cellen zoals gemeten door de Annexin PI-verhouding.een Chinese traditionele geneeskunde met cardio-beschermende effecten, voorkwam de apoptose van HCM's na hypoxie/reoxygenatie. Zoals hier getoond, was de JC-1 rood/groen-verhouding na behandeling met de mitochondriale CCP bijna nul. Consistent met de resultaten van de apoptosetest.De H/R-behandelde groep vertoonde een significant lagere rood/groen-verhouding, vergeleken met de normale groep. En keerde zo'n verhoudingsverandering om. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de met JC-1 geladen cellen in ijskoud staand buffer moeten worden gestart, aangezien temperatuur een aanzienlijk effect heeft op de stabiliteit van het mitochondriale membraanpotentieel.Na dit proces kunnen andere methoden zoals genetische manipulatie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of de afname van MMP het resultaat is van de opening van MPTP.

a-flow-cytometry-based-assay-for-measuring-mitochondrial-membrane

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Saponine-gepermeabiliseerde vezels voorbereiding in combinatie met respirometrische oxidatieve fosforylering analyse geeft integratieve beoordeling van de mitochondriale functie. Mitochondriale ademhaling in fysiologische en pathologische toestanden kan weerspiegelen verschillende regelgevende invloeden waaronder mitochondriale interacties, morfologie en biochemie.

Respirometrische oxidatieve fosforylering Assessment in Saponin-gepermeabiliseerde Cardiac Vezels

Een spectrofluorimetrische protocol voor het meten van de mitochondriale permeabiliteit transitie porie opening in geïsoleerde muizenhart mitochondria wordt hier gepresenteerd. De bepaling omvat de gelijktijdige meting van Ca...

Multi-parameter meting van de doorlatendheid Transitie Pore Openen in Geïsoleerde Muis Heart Mitochondria

This video demonstrates the labeling of neuronal cells with antibodies for mitochondrial respiratory chain complexes, mitochondrial DNA-associated protein, and mitochondrial outer membrane protein, followed by flow cytometry to quantify their levels.

Measurement of Multiple Mitochondrial Parameters in Neurons using Flow Cytometry

Hier beschreven is een methode voor het opsporen en kwantificeren mitochondriale buitenmembraan eiwitten door immunokleuring van mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsel en analyseren door flowcytometrie. Deze werkwijze kan worden uitgebreid tot functionele aspecten mitochondriale subpopulaties beoordelen.

Immunodetectie van Outer membraaneiwitten door flowcytometrie van Geïsoleerde Mitochondriën

Het doel van dit protocol is te illustreren hoe gebruik van muis neonatale cardiomyocytes als een modelsysteem om te onderzoeken hoe de verschillende factoren kunnen wijzigen zuurstofverbruik in het hart.

Analyseren van zuurstof verbruik tarief in neonatale Cardiomyocytes primaire gekweekte muis met behulp van een extracellulaire Flux-Analyzer

Xenobiotic Efflux pompen zijn zeer actief in hematopoietische stam en voorlopercellen (Hspc's) en veroorzaken extrusie van TMRM, een mitochondriale membraan potentiële fluorescerende kleurstof. Hier presenteren we een protocol om het mitochondriale membraan potentieel in Hspc's met TMRM nauwkeurig te meten in aanwezigheid van verapamil, een effluxpomp remmer.

Verbetering van de nauwkeurigheid van de flowcytometrische beoordeling van het mitochondriale membraan potentieel in hematopoietische stam en voorlopercellen door remming van effluxpompen

Hier beschrijven we een betrouwbare methode voor het meten van de mitochondriale massa en membraan potentieel in ex vivo gekweekte hematopoietische stamcellen en T-cellen.

Meting van het mitochondriale massa-en membraanpotentiaal in hematopoietische stamcellen en T-cellen doorstroming Cytometrie

De verschillende effecten van verschillende graden van onderkoeling op myocardbescherming zijn niet grondig geëvalueerd. Het doel van deze studie was om de niveaus van celdood na verschillende hypothermiebehandelingen te kwantificeren in een op humane cardiomyocyten gebaseerd model, dat de basis legde voor toekomstig diepgaand moleculair onderzoek.

In vitro beoordeling van myocardbescherming na hypothermie-conditionering in een humaan cardiale myocytenmodel

Deze studie rapporteert een nieuwe benadering om meerdere mitochondriale functionele parameters te meten op basis van flowcytometrie en dubbele kleuring met twee fluorescerende melders of antilichamen om veranderingen in mitochondriaal volume, mitochondriaal membraanpotentiaal, reactief zuurstofsoortniveau, mitochondriale ademhalingsketensamenstelling en mitochondriaal DNA te detecteren.

Flowcytometrische analyse van meerdere mitochondriale parameters in door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen en hun neurale en gliaderivaten

Hier presenteren we een compilatie van testen om de mitochondriale functie in zoogdiercellen direct te meten, onafhankelijk van hun vermogen om moleculaire zuurstof te consumeren.

Zuurstofonafhankelijke assays om de mitochondriale functie bij zoogdieren te meten

Leer hoe u de mitochondriale membraanpotentiaal in humane cardiale myocyten meet na hypoxie/heroxygenatie met JC-1-kleuring en flowcytometrie. Deze methode evalueert beschermende middelen tegen celbeschadiging.

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay voor het meten van de Mitochondriale membraanpotentiaal in cardiale Myocytes na Hypoxia/heroxygenatie (Video) | JoVE Journal

Een stroom Cytometry gebaseerde Assay voor het meten van de Mitochondriale membraanpotentiaal in cardiale Myocytes na Hypoxia/heroxygenatie

Meer video's verkennen