Een stroom Cytometry gebaseerde Assay voor het meten van de Mitochondriale membraanpotentiaal in cardiale Myocytes na Hypoxia/heroxygenatie
13 juli 2018
Hier presenteren we een protocol dat gebruikmaakt van JC-1 kleurstof te beoordelen van de Mitochondriale membraanpotentiaal van cellen na wordt blootgesteld aan hypoxie/heroxygenatie met of zonder een beschermende agent.
Deze methode kan helpen om het effect van hypoxie/reoxygenatie op cellen in het mitochondriale membraanpotentieel te meten, en het kan worden gebruikt om te evalueren of een middel beschermend is tegen een verwonding. Het grote voordeel van deze test is dat het MMP dat erdoor wordt gedetecteerd, in het geval van factoren zoals mitochondriale grootte is. Bovendien heeft het een lage vereiste voor materialen en de helderheid.
Begin met 70% confluente humane hartspiercellen in een zes-putsplaat. Na het wassen van de cellen met fosfaatbufferoplossing, voeg medicijn of voertuig toe in twee milliliter serum- en glucosevrij DMEM. Incubeer in een cellencultuurincubator met 5%CO2 en 95% lucht bij 37 graden Celsius gedurende 30 minuten voorafgaand aan hypoxie.
Na 30 minuten plaats de schaal met humane hartspiercellen in een 2,5 liter luchtdichte anhypxische pot. Voorzien van een katalysator om vrij zuurstof af te vangen, en een anaërobe indicator om de zuurstofspanning in het medium te meten. Plaats de pot in de weefselkweekincubator.
De kleur van de anaërobe indicator verandert van lichtblauw in een normoxische omgeving naar licht wit in hypoxische omstandigheden. Reoxygeneer de humane hartspiercellen door de zes-putsplaat uit de pot te verwijderen en deze twee uur op de incubator te plaatsen. Na de reoxygenatie, spoel de cellen met één milliliter voorverwarmd PBS en voeg 0,5 milliliter voorverwarmde 25% trypsine toe langs de wand van de put.
Incubeer bij 37 graden Celsius gedurende ongeveer een minuut totdat alle humane hartspiercellen bijna loskomen. Voeg vervolgens één milliliter DMEM compleet medium toe aan de putten om de trypsine te neutraliseren. Breng de celsuspensie over in een 15 milliliter centrifugeerbuis en pellet HCMs door centrifugatie gedurende drie minuten bij 500 keer G, bij kamertemperatuur.
Na centrifugatie, zuigt voorzichtig het supernatant af zonder de pellets te verstoren. Voeg vervolgens 5 milliliter humane hartspiercel complete medium en 5 milliliter JC-1 werkoplossing toe aan elke buis. Resuspendeer de HCMs door op en neer te pipetteren.
Dek de buizen af met aluminiumfolie om verbleking van de fluorescerende indicator te voorkomen, en incubeer de cellen onder normale omstandigheden gedurende 20 minuten. Na het pellen van de humane hartspiercellen door centrifugatie gedurende drie minuten in een centrifuge voorgekoeld tot vier graden Celsius, spoel de cellen twee keer met twee milliliter ijskoud JC-1-kleuringsbuffer. Na de tweede spoeling, resuspendeer de humane hartspiercellen in 300 microliter ijskoud kleuringsbuffer.
En filter de monsters in de respectieve monsterbuizen. Analyseer de cellen binnen 30 minuten met doorstromingscytometrie. Start de flowcytometer en zorg ervoor dat de software is verbonden.
Voer de vloeistofstart uit. Start de stroom en stel de break-off in. Open twee dotplot-vensters in de flowcytometriesoftware.
Selecteer voorwaarts verstrooid licht op de X-as en zijwaarts verstrooid licht op de Y-as in de eerste dotplot. Om de kenmerken van de cellen in termen van hun grootte en korrelvorming te representeren. Selecteer het PE-detectiekanaal voor de Y-as.
En FITC voor de X-as, met behulp van een logaritmische schaal in de tweede dotplot, die wordt gebruikt om de fluorescenditekracht van JC-1-kleurstof in de cellen te meten. Klik op ontladen om de buisondersteuningsarm te laten uitkomen en plaats de lege monsterbuis die humane hartspiercellen bevat die niet zijn gekleurd met JC-1. Klik op laden om de ondersteuningsarm terug te brengen naar zijn werkpositie.
Klik op opnemen om deeltjes uit de suspensie in de lege monsterbuis te verzamelen. En pas de spanningen van de fluorescendiekanalen in de tweede dotplot aan. Gate de celpopulatie voor verdere analyse in de eerste dotplot.
Analyseer vervolgens de humane hartspiercellen. Geef de statistieken van elke monsterbuis weer en bereken de MMP's van elk monster door de verhouding van de rode fluorescenditekracht te delen door die van de groene fluorescenditekracht. Hypoxie en reoxygenatie induceren significant apoptose van humane hartspiercellen, vergeleken met normale cellen zoals gemeten door de Annexin PI-verhouding.
een Chinese traditionele geneeskunde met cardio-beschermende effecten, voorkwam de apoptose van HCM's na hypoxie/reoxygenatie. Zoals hier getoond, was de JC-1 rood/groen-verhouding na behandeling met de mitochondriale CCP bijna nul. Consistent met de resultaten van de apoptosetest.
De H/R-behandelde groep vertoonde een significant lagere rood/groen-verhouding, vergeleken met de normale groep. En keerde zo'n verhoudingsverandering om. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat de met JC-1 geladen cellen in ijskoud staand buffer moeten worden gestart, aangezien temperatuur een aanzienlijk effect heeft op de stabiliteit van het mitochondriale membraanpotentieel.
Na dit proces kunnen andere methoden zoals genetische manipulatie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals of de afname van MMP het resultaat is van de opening van MPTP.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit protocol gebruikt JC-1 kleurstof om het mitochondriale membraanpotentieel (MMP) van cellen die worden blootgesteld aan hypoxie/reoxygenatie te evalueren. Het beoordeelt ook de beschermende effecten van middelen tegen cellulaire schade.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Cellulaire biologie
- Mitochondriale functie
- Hypoxie-onderzoek
Achtergrond
- Het mitochondriale membraanpotentieel is cruciaal voor celoverleving.
- Hypoxie/reoxygenatie kan leiden tot cellulaire schade.
- Beschermende middelen kunnen deze effecten verminderen.
- JC-1 kleurstof is een betrouwbare indicator van MMP-veranderingen.
Doel van de studie
- Om de impact van hypoxie/reoxygenatie op MMP te meten.
- Om de beschermende effecten van specifieke middelen te evalueren.
- Om een laag-materialen assay te bieden voor MMP-beoordeling.
Gebruikte methoden
- Kweek menselijke hartmyocyten tot 70% confluentie.
- Was cellen met fosfaatbuffer zoutoplossing.
- Incubeer met geneesmiddel of drager in serum-vrij DMEM.
- Stel cellen bloot aan hypoxie-omstandigheden voor beoordeling.
Belangrijkste resultaten
- Demonstreerde veranderingen in MMP als gevolg van hypoxie/reoxygenatie.
- Identificeerde beschermende effecten van middelen op MMP.
- Toonde lage materiaalvereisten voor de assay.
- Benadrukte de invloed van mitochondriale grootte op MMP-detectie.
Conclusies
- De JC-1-assay is effectief voor het beoordelen van MMP-veranderingen.
- Beschermende middelen kunnen MMP-resultaten significant beïnvloeden.
- Deze methode is toegankelijk en efficiënt voor cellulaire studies.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Assessing mitochondrial membrane potential (MMP) is critical for evaluating cardioprotective strategies in ischemia-reperfusion injury models. This flow cytometry-based JC-1 assay provides a quantitative, high-throughput readout of mitochondrial depolarization in human cardiac myocytes, enabling mechanistic de-risking of therapeutic candidates targeting reperfusion injury. The method supports target validation by linking MMP changes to mitochondrial permeability transition pore (mPTP) opening, a key event in cardiomyocyte death.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Measures MMP as a functional readout of mitochondrial health and mPTP opening in disease-relevant human cardiac myocytes.
- Operational Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding cytoprotective agents under hypoxia/reoxygenation stress.
- Predictive Value: Supports target confidence by correlating MMP preservation with reduced apoptosis, as demonstrated by Annexin PI ratio.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: JC-1’s red/green fluorescence ratio provides a ratiometric, mitochondria-specific readout independent of cell size or granularity.
- Operational Value: Low material requirements and compatibility with standard flow cytometry platforms support assay scalability and reproducibility.
- Screening Readiness: Enables rapid evaluation of compound libraries for effects on MMP in a physiologically relevant human cell model.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses human cardiac myocytes to enhance translational relevance over rodent models in ischemia-reperfusion studies.
- Operational Value: Standardized hypoxia/reoxygenation protocol allows consistent induction of mitochondrial depolarization for compound testing.
- Predictive Value: Facilitates go/no-go decisions by linking MMP protection to functional outcomes like reduced apoptosis.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the early discovery continuum, supporting target validation and lead identification by providing mechanistic insights into mitochondrial dysfunction in cardiovascular disease models.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of MMP as a biomarker of mPTP activation and reperfusion injury severity.
- Screening: Delivers quantitative, normalized fluorescence ratio data suitable for hit selection and dose-response profiling.
- Analytics: Generates red/green intensity ratio metrics that allow statistical comparison across treatment groups.
- Translational Research: Uses human-derived cells to improve predictive confidence for preclinical advancement.
- Enterprise Reuse: Protocol can be adapted across cardiotoxicity and cardioprotection screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mitochondrial depolarization as a convergent point of reperfusion injury pathways.
- Operational Value: Minimizes variability by normalizing MMP readout to mitochondrial content via ratiometric JC-1 detection.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early identification of compounds that preserve MMP and reduce apoptotic commitment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates demonstrating MMP stabilization in human cardiac myocytes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary human cardiac myocyte culture and hypoxia/reoxygenation modeling.
- Dependent on flow cytometry with FITC and PE detection channels and logarithmic fluorescence scaling.
- Necessitates strict temperature control during JC-1 staining to preserve mitochondrial membrane potential integrity.
- Requires standardization of hypoxia duration and reoxygenation timing across experimental groups.
- Limited to adherent cell types amenable to trypsinization and washing without loss of viability.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:42
Establishment of Hypoxia/Reoxygenation Model
1:57
Preparation of HCMs for Flow Cytometry
3:49
Flow Cytometer Setup
4:43
Flow Cytometry Measurement and Data Analysis
5:40
Results: Validation of the Establishment of Hypoxia/Reoxygenation (H/R) Model by Flow Cytometry
6:34
Conclusion
