Een test van de Neurosphere voor de evaluatie van de activering van de endogene neurale stamcellen in een muismodel van minimale dwarslaesie

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen met betrekking tot de rol van neurale voorlopercellen in regeneratieve geneeskunde. Specifiek kunnen we vragen hoe letsel het gedrag van neurale voorlopercellen beïnvloedt. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een aanpak biedt om het effect van dwarslaesie op de kinetiek van endogene neurale voorlopercellen te bestuderen.

Visuele demonstratie van deze technieken is van cruciaal belang. Aangezien de chirurgische en dissectiestappen precisie vereisen en moeilijk te leren kunnen zijn, kunnen ze wel worden geperfectioneerd met oefening. Voordat u met de procedure begint, gebruikt u een haarclip om het haar van de rug van een verdoofde muis te verwijderen, van het midden van de rug tot de nek en oren.

Nadat de muis in een stereotactisch apparaat is vastgezet, plaatst u vier tot vijf stukken gerold gaas onder de buik, terwijl u lichtjes aan de basis van de staart trekt om het lichaam en de wervelkolom recht te trekken. Duwt de thoracale gaasrol rostrale vanaf de buik van de muis richting bovenste thorax om de thoracale wervelkolom te ondersteunen. En gebruik laboratoriumtape om de staart en ledematen in een stervormige oriëntatie vast te zetten.

Na het desinfecteren van de blootgestelde huid met sequentiële 70%ethanol en povidonjodiumdoekjes, gebruikt u een mesje nummer 10 om een verticale incisie te maken parallel aan de longitudinale as van het dier, vanaf het middenpunt van beide schouderbladen tot de kromming van de thoracale wervelkolom. Trek de huid terug om het zachte weefsel en de contouren van de wervelkolom bloot te leggen. En identificeer de onderste rand van de super scapulaire vetkussen.

Gebruik vervolgens het mes om voorzichtig maar krachtig langs beide zijden van de wervel T5 tot T8 en negen botten te snijden om de rugspierpezen los te maken van de wervelkolom. Verplaats de retractoren zodat de tanden van de retractoren in de incisieplaats aan weerszijden van de wervelkolom worden geplaatst. En breid elke retractor uit om de blootstelling aan te passen, totdat de wervelkolom voldoende is verhoogd zonder te veel spanning op de teruggetrokken spierlagen te zetten.

Onder een chirurgisch microscoop, reinigt u zorgvuldig het resterende spierweefsel en ander zacht weefsel boven de wervelkolom om het wervelbot bloot te leggen. Klauw de doornuitsteeksel van de wervels vast met getande forceps en beweeg de forceps lichtjes op en neer om de wervels te identificeren die zullen worden verwijderd. Plaats vervolgens een punt van een paar gebogen stompe scharen in een van beide zijden van het blootgestelde intervertebrale foramen, caudaal van de wervelboog die moet worden uitgezaagd.

En snij de verbindende intervertebrale gewrichten bilateraal door. Til vervolgens de lamina omhoog en snijd de bovenste aanhechting van de lamina af om het bot te isoleren en te verwijderen. Wanneer u de wervelboog wegsnijdt en verwijdert, zorg er dan voor dat u de scharen altijd naar boven richt om de onderliggende ruggenmerg niet te beschadigen.

Met de dorsale middenlijnaderen als oriëntatiepunt, steekt u de 45 graden gebogen schacht van een 30 gauge naaldtip, met de schuine kant omhoog, een millimeter diep in het dorsale laterale oppervlak van het ruggenmerg. En ongeveer 0,5 millimeter lateraal aan weerszijden van de middenlijn. Beweeg de naald ongeveer twee millimeter van de caudale naar rostrale richting, zodat de volledige lengte van de schuine kant in het ruggenmerg wordt geplaatst.

Volg vervolgens het pad van de ingang om de naald te verwijderen. Om de wond te sluiten, verwijdert u de retractor en gebruikt u een 6-0 absorbeerbare hechtdraad om de rugspieren aan weerszijden van de verwonding langs de middenlijn samen te voegen. En een 4-0 zijden hechtdraad om de overliggende huid te sluiten.

Om de neurosferen te isoleren, maakt u een middenlijn incisie in de huid langs de volledige lengte van de rug om het spierweefsel en de contouren van het wervelbot bloot te leggen. Til de mediale kant van elk schouderblad op en gebruik schaar om het zachte weefsel tussen het schouderblad en de wervels weg te snijden. Wanneer de onderliggende wervelkolom is blootgelegd, steekt u de schaar in de bovenste thoracale opening, volgend de kromming van de wervelkolom, en snijdt u de aangehechte ribben, spieren en inwendige organen weg om de wervelkolom te isoleren.

Steek de schaar in het caudale wervelforamen en snijd de intervertebrale gewrichten aan weerszijden van de laminae, zorg ervoor dat u het intacte ruggenmerg niet beschadigt. Wanneer de juiste lengte van het ruggenmerg is blootgelegd, snijdt u voorzichtig alle spinale zenuwen weg die lateraal van het ruggenmerg uitsteken, voordat u het ruggenmergweefsel overbrengt in een petrischaal met reguliere, kunstmatige hersenvocht op ijs. Onder een dissectiemicroscoop snijdt u het ruggenmergweefsel om ongeveer twee millimeter weefsel rostrale en caudale van de verwondingsplaats te omvatten, en gebruikt u twee paar fijne forceps om het ruggenmerg voorzichtig in twee longitudinale helften te scheiden, langs de dorsale en ventrale fissuren.

Gebruik de microschaar om het beschadigde dorsale laterale witte stof uit te snijden. En plaats het beschadigde weefsel in een conische buis van 15 milliliter. Houd een helft van het ruggenmerg vast met de forceps, en verwijder met twee paar forceps voorzichtig het onbeschadigde witte stof langs de rostrale caudale uitgestrektheid van het ruggenmerg om het geschikte periventriculaire gebied te isoleren.

Nadat u het beschadigde witte stof en de bijbehorende periventriculaire gebieden op dezelfde manier uit het andere helft van het ruggenmerg heeft geïsoleerd, plaatst u de stukken periventriculaire weefsel in afzonderlijke conische buizen van 15 milliliter. En gebruik de microschaar om het weefsel voorzichtig te snijden tegen de wanden van de buizen. Zodra de weefselverteringsprocedure is voltooid en de enkele celsuspensie is verkregen, zet u een neuro