Name: Imaging Ca2 + reacties tijdens Shigella besmetting van epitheliale cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Ontdek fluorescentiemicroscopie met chemische probes om lokale en globale calciumreacties te analyseren tijdens Shigella-infectie van HeLa-cellen. Deze methode optimaliseert visualisatie van pathogeen-geïnduceerde signalering.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Jenny-Lee Thomassin voor haar hulp bij het bewerken van het manuscript. Het werk werd gesteund door de ANR verleent MITOPATHO en PATHIMMUN, verleent de Labex Memolife en PSL IDEX Shigaforce. Chunhui Sun is een ontvanger van een subsidie van de Ph.D. van de China Scholarship Raad. Laurent Combettes en Guy Tran Van Nhieu zijn ontvangers van een beurs van WBI-France Tournesol programma N ° 31268YG (Wallonie-Bruxelles International, Fonds de la Recherche Scientifique, Ministère Français des Affaires étrangères et européennes, Ministère de l'Enseignement supérieur et de la Recherche dans le cadre des Partenariats Hubert Curien).

1. voorbereiding
<ol><li>
Voorbereiding van de bacteriën
	<ol>
<li>Plaat van de bacteriën —Shigella wild-type stam uiting geven aan de AfaE adhesine (M90T-AfaE) — op een trypticase (TCS) soja agar plaat met 0,01% Congo rood (CR) en hen Incubeer gedurende 18 uur bij 37 ° C. Opmerking: Het vergroten van hun reproduceerbaarheid, de Shigella platen verkregen in stap 1.1.1 bij 4 ° C worden opgeslagen en moeten worden gebruikt binnen een week, omdat alle kolonies op de drager van de CR uiteindelijk rood zal na verloop van tijd.</li>
		<li>Inoculeer TCS Bouillon pre cultuur door het plukken van 3 rode koloniën aan de streep platen. Opmerking: Een inenting met 3 kolonies uitgevoerd om het beperken van de kans van het kiezen van een enkele kloon waarvan virulentie plasmide heeft ondergaan een genetische recombinatie.</li>
		<li>Groeien vloeibare bacteriele kweken in een schudden incubator voor 16 h bij 37 ° C bij 200 omwentelingen per minuut. Ampicilline toevoegen om een eindconcentratie van 75 mg/mL. Antibiotica concentraties moeten niet meer bedragen dan 3 x de minimale remmende concentratie, omdat een overmaat aan antibioticum tot het verlies van de plasmide van grote virulentie leiden kan. Opmerking: De handhaving van de Shigella virulentie plasmide moet worden geverifieerd door de bacteriële culturen op CR platen aangevuld met de juiste antibiotica concentratie plating. De aanwezigheid van witte kolonies geeft plasmide verlies.</li>
		<li>Beënt de TCS cultuur met de pre bacteriecultuur bij een verdunning 1:100. Na het bebroeden bij 37 ° C in een schudden incubator voor 2 h bij 200 omwentelingen per minuut. Zorgen dat de optische dichtheid bij 600 nm (OD600nm) is 0,2 - 0,4.</li>
		<li>Centrifugeer de bacteriecultuur voor 2 min bij 13.000 x g bij 21 ° C en resuspendeer de pellet in een equivalent volume EM medium (120 mM NaCl, 7 mM KCl, 1,8 mM CaCl2, 0.8 mM MgCl2, 5 mM glucose en 25 mM HEPES pH = 7.3).</li>
		<li>Verdun de bacteriële suspensie in de buffer van een EM op een definitieve OD600nm 0.1 en gebruik het onmiddellijk of opslaan bij 21 ° C en het binnen de volgende 60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiding van de cel
	<ol>
<li>Cultuur HeLa cellen in DMEM met 1 g/L van glucose aangevuld met 10% foetaal kalfsserum (FCS) en ze groeien bij 37 ° C met 10% CO2. TC-7 gegroeid in DMEM met 4,5 g/L van glucose, met 10% FCS en niet-essentiële aminozuren in een incubator van de 37 ° C met 10% CO2groeien.</li>
		<li>Voor de cel onderhoud, splits de cellen regelmatig om te voorkomen dat een remming van de groei-contact gekoppeld aan confluente Staten; Dit is essentieel voor een Ca2 + sonde laden/transfectie hoogrenderende.</li>
		<li>Plaat HeLa cellen op steriele 25-mm diameter circulaire coverslips in 6-Wells-platen bij een dichtheid van 3 x 105 cellen/put de dag voordat het experiment voor de HeLa cellen.</li>
		<li>Voor TC-7 cellen, trypsinize en cellen tellen. Zaad hen bij 4 x 105 cellen/well en broeden ze 5-7 dagen bij 37 ° C in een 10% CO2-incubator voor de experimenten te voorzien van een polarisatie.<ol>
<li>Vernieuw het kweekmedium cel elke dag tot de dag van het experiment. Opmerking: Glazen-bodem 35-mm diameter wegwerp kamers kunnen ook worden gebruikt als alternatief voor de coverslips-bevattende putten. Als de laatste zijn gebruikt, temperatuurregeling door een verwarmde fase of doel niet voldoende is, en een thermostaat incubatie kamer gemonteerd op is het stadium van de Microscoop vereist.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>De dag van het experiment, verwijder het medium en wassen van de cellen 3 x met 1 mL EM medium bij 21 ° C.</li>
	<li>Laden van de cellen met 3 mM Fluo-4-AM14 in een buffer EM gedurende 30 minuten bij 21 ° C. Opmerking: Terwijl het laden van sub confluente HeLa cellen er geen grote problemen, het laden van gepolariseerde TC-7 cellen is vaak heterogene en slecht efficiënt. Voor deze cellen, vonden we dat het rendement van het laden wordt versterkt door de toevoeging van de verspreiden agent — pluronic zuur — op een eindconcentratie van 0,1% en het anion-transporter remmer bromosulfophtalein op een eindconcentratie van 20 µM naar de Fluo-4-AM-bevattende EM. Het gebruik van ratiometric chemische sondes of genetisch gecodeerd-FRET sondes die dual-overname niet compatibel met de snelheid van verwerving nodig is voor de beeldvorming van lokale Ca2 + reacties is.</li>
	<li>Wassen van de monsters 3 x met EM buffer en verder broeden ze in 1 mL EM buffer bij 21 ° C te voorzien in de hydrolyse van de AM-groep. Gebruik Fluo-4 geladen cellen onmiddellijk of binnen de komende 90 min (behouden bij 21 ° C).</li>
</ol>2. infectie en beeldacquisitie van lokale Ca2 + antwoorden
<ol><li>Plaats het dekglaasje aan met de Fluo-4 geladen cellen in een imaging kamer of een glazen-bodem cupje. Wassen van de monsters in de beeldvorming zaal of wegwerp glazen-bodem kamer 3 x met EM buffer om verbindingen mogelijk als gevolg van lysis van de cel. Voeg vervolgens 1 mL van EM buffer.</li>
	<li>Plaats van de kamer in een omgekeerde fluorescentie Microscoop werkgebied verhit tot 33 ° C. Opmerking: Deze temperatuur is geselecteerd als een compromis tussen de optimale temperaturen die compatibel is met het proces van Shigella invasie en de vertraging van Ca2 + reacties te visualiseren van lokale reacties. We gebruiken een 63 X onderdompeling olie doelstelling (NB = 1,25) uitgerust met fase contrast ringen.</li>
	<li>Selecteer een veld microscopie en overname parameters, met inbegrip van de blootstellingstijd en weggooien indien nodig te optimaliseren de Fluo-4 TL signaal instellen. Opmerking: De belangrijkste uitdagingen voor lokale Ca2 + imaging zijn de lage amplitude en de kleine duur van de reacties, waarvoor overname ten minste elke 30 ms. verschillende verkrijgbare achterzijde verlicht EM-CCD of C-Mnd camera's presenteren de vereiste gevoeligheid te detecteren lokale Ca2 + reacties met Fluo-4. Detectie gevoeligheid is ook een belangrijk aandachtspunt te beperken photodamage of artefacten zoals spontane reacties gekoppeld aan de fluorescerende excitatie van Fluo-4 op een hoge frequentie. Hier, een LED-gebaseerde verlichting van 470 nm, met een 480 ± 40 nm band pass excitatie filter, een 505-nm dichroïde filter en een 527 ± 30 nm band pass emissie gebruikt op 5% van de maximale intensiteit gecombineerd met een 1.0 neutrale-opaciteitsfilter werden gebruikt om deze problemen te minimaliseren onder een stroom van verwervingen van beperkte duur. Een analyse van lokale Ca2 + signalen door partijen van 120 s streams werd routinematig uitgevoerd. Onder deze omstandigheden laag verlichting werd fluorophore photobleaching niet waargenomen tijdens de 2 min-stream acquisities. Opeenvolgende overnames op hetzelfde monster kunnen worden uitgevoerd, mits de andere velden worden gebruikt. Als algemene regel, wordt een eerste acquisitie-stream uitgevoerd op een veld van het besturingselement in de afwezigheid van bacteriën stimulatie om ervoor te zorgen het ontbreken van spontane reacties. Als spontane reacties worden waargenomen, worden de monsters gewassen met EM buffer totdat geen reacties worden waargenomen.</li>
	<li>Te voegen bacteriën aan het monster, 500 µL van EM buffer verwijderen uit de zaal en voeg 500 µL van de bacteriële suspensie in stap 1.1.6 willen verkrijgen van een definitieve OD600nm van 0.05, met de juiste zorg om te voorkomen dat het verplaatsen van het veld geselecteerde microscopie; de volumes zorgen voor een goede menging van de bacteriën en een homogene verdeling van de bacteriën op de celsteekproeven.</li>
	<li>Het uitvoeren van een overname op de bacteriële toevoeging. U kunt ook uitvoeren een overname 10 min na de bacteriële toevoeging, die correspondeert met de tijd die nodig is voor bacteriën om sediment op cellen onder de voorwaarden gebruikt. Aan het einde van de stream van de verwerving, door een fase contrast-beeld van het geselecteerde veld naar het visualiseren van de bacteriën die contact met de cellen en het membraan ruches gekoppeld van de sites van de bacteriële invasie te verwerven.</li>
	<li>Herhaal de overname procedure zoals in stap 2.5, met tussenpozen die zich lenen voor de duur van de afbeelding acquisities, de besparingen van de bestanden en de selectie van een nieuw veld ter dekking van het hele proces. Opmerking: Voor Shigellavonden we dat verwerving stromen elke 5 min voor 20 min, na de 10 min bacteriële sedimentatie, toegestaan ter dekking van de meerderheid van de gebeurtenissen van de invasie.</li>
	<li>Toevoegen aan het einde van de aankoop procedure, een eindconcentratie van 2 µM van de Ca2 + ionophore ionomycin monsters om te bepalen van de maximale amplitude van de Ca2 + signalen. Verwerven van beelden elke 3-5 s tot signaal stabilisatie, meestal voor minder dan 10 min.</li>
	<li>Volg door toevoeging van Ca2 + complexvormer EGTA aan een eindconcentratie van 10 mM tot het bepalen van het signaal van de fluorescentie bij gebrek aan Ca2 +. Verwerven van beelden elke 3-5 s tot signaal stabilisatie, meestal voor minder dan 10 min. Opmerking: Vanwege de relatief trage dynamiek van de wereldwijde Ca2 + variaties, voeren deze acquisities elke 3-5-s (niet in streaming modus), waardoor voor Ca2 + imaging op hetzelfde microscopische veld tijdens de opeenvolgende behandelingen.</li>
</ol>3. analyse
<ol><li>Express cytosolische Ca2 + variaties na verloop van tijd als het percentage van ΔF/F0, waarbij ΔF staat voor de variatie van de intensiteit van de fluorescentie van de gemiddelde van de regio van belang (ROI) en F0 de basislijn fluorescentie in de dezelfde ROI, waaraan een niet-relevante regio van het veld verstoken van cellen wordt afgetrokken.<ol>
<li>Verwijderen van de basale fluorescentie-niveaus voor elke cel in verschillende velden, overeenkomt met de basislijn niveaus; deze niveaus ondubbelzinnig kunnen worden vastgesteld als gevolg van de lage frequentie en relatief korte duur van lokale Ca2 + reacties in de verwerving van een bepaalde stroom. Opmerking: Kwantificeren opvallende kenmerken van de antwoorden aan de vragen gerelateerde en de pathogene model studeerde. Klassiek, worden verschillende parameters in aanmerking genomen om te analyseren van Ca2 + signalen, met inbegrip van de frequentie van cellen met lokale of globale Ca2 + reacties, evenals de duur, amplitude en frequentie van deze antwoorden. In het geval van Shigella en lokale reacties is een ander belangrijk aspect van de analyse de ruimtelijke vereniging van de reacties met sites van de bacteriële invasie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tekenen om te kwantificeren het percentage responsieve cellen weergegeven: globale of lokale reacties, ROIs in cellen, in de tijd-serie overeenkomt met de variaties van Fluo-4 intensiteit.<ol>
<li>Stel strikte parameters te identificeren lokale Ca2 + reacties, zoals een amplitude van drievoudig bovenstaande verschillen in de achtergrond van de gemiddelde fluorescentie basislijn voor de cel van de intensiteit, of een duur van ten minste 200 ms, om te voorkomen dat het scoren van een vals positief. Opmerking: Als een algemene regel, zelfs kleine lokale Ca2 + reacties van elke achtergrondgeluiden kunnen worden onderscheiden door hun profiel. De ROI moet groot genoeg zijn om te integreren genoeg signalen van de fluorescentie te voorzien in de opsporing van lokale variaties. Afhankelijk van de intensiteit van de detectie van Fluo-4, kunnen deze ROIs overeen met cirkels met een diameter variërend van 2-5 mM.</li>
		<li>Het meten van de variaties van de gemiddelde Fluo-4 intensiteit van de fluorescentie in 2 regio's in een afzonderlijke ruimte van dezelfde cel, om te bepalen of de antwoorden lokaal of globaal zijn. Opmerking: De analyse van een groot aantal cellen wordt vergemakkelijkt door het gebruik van beeldbewerkingssoftware toelaat de on-line schermweergave van de variaties van de intensiteit van de gemiddelde fluorescentie na verloop van tijd voor de geselecteerde regio's. Commercieel verkrijgbare imagingsoftware heeft een dergelijke optie, maar dit kan ook worden uitgevoerd met behulp van de Icy freeware, de ROI intensiteit Evolution -plug-in gebruiken.</li>
		<li>Het bepalen van het percentage cellen met lokale reacties. Opmerking: Dit percentage is berekend op basis van het totale aantal cellen geanalyseerd op het gebied van de microscopie, die in voldoende mate moet ter ondersteuning van een statistisch belang met behulp van een niet-parametrische test.</li>
		<li>Bepaal de duur van de lokale reacties. Opmerking: Lokale Ca2 + reacties kunnen worden verder onderscheiden volgens hun duur bereiken (dat wil zeggen, minder dan 500 ms, tussen 5 en 10 s, of boven 10 s) en hun associatie met Shigella invasie sites.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kwantificeren van de amplitude van de reacties. Eerst, moet u de maximale Ca2 + en cel achtergrondniveaus bepaald zoals in stap 2.1.7 kalibreren. Aangezien de Fluo-4 belasting voor elke cel variëren kan, worden deze bepalingen voor afzonderlijke cellen in het veld uitvoeren.<ol>
<li>De amplitude van de reacties wordt uitgedrukt als een relatieve percentage van de maximale respons.</li>
		<li>Uit te voeren statistische tests met een test van de normaliteit, gevolgd door een parametrische test voor het analyseren van mogelijke verschillen in de amplitude van de reacties tussen de monsters.</li>
		<li>Het bepalen van de vereniging van deze reacties ten opzichte van de sites van de bacteriële invasie door hun respectieve localization voor de bacteriële-geïnduceerde membraan ruches in de overeenkomstige fase contrast beelden gevisualiseerd.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Ashida, H., Ogawa, M., Kim, M., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+and+host+interactions+in+the+gut+epithelial+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacteria and host interactions in the gut epithelial barrier.</a> Nature Chemical Biology. 8 (1), 36-45 (2012).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11413485">The versatility and universality of calcium signaling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Strehler, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+calcium+ATPases%3A+from+generic+Ca%282%2B%29+sump+pumps+to+versatile+systems+for+fine-tuning+cellular+Ca%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane calcium ATPases: from generic Ca(2+) sump pumps to versatile systems for fine-tuning cellular Ca(2).</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 460 (1), 26-33 (2015).</li>
<li>Muallem, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+Ca2%2B+signals%3A+a+question+of+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Decoding Ca2+ signals: a question of timing.</a> Journal of Cell Biology. 170 (2), 173-175 (2005).</li>
<li>Uhlen, P., Fritz, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20494106">Biochemistry of calcium oscillations.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (1), 28-32 (2010).</li>
<li>Carneiro, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+induces+mitochondrial+dysfunction+and+cell+death+in+nonmyleoid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">Shigella induces mitochondrial dysfunction and cell death in nonmyleoid cells.</a> Cell Host & Microbe. 5 (2), 123-136 (2009).</li>
<li>Horng, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+and+mitochondrial+destabilization+in+the+triggering+of+the+NLRP3+inflammasome%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling and mitochondrial destabilization in the triggering of the NLRP3 inflammasome.</a> Trends in Immunology. 35 (6), 253-261 (2014).</li>
<li>Galan, J. E., Lara-Tejero, M., Marlovits, T. C., Wagner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+type+III+secretion+systems%3A+specialized+nanomachines+for+protein+delivery+into+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial type III secretion systems: specialized nanomachines for protein delivery into target cells.</a> Annual Review of Microbiology. 68, 415-438 (2014).</li>
<li>Ashida, H., Mimuro, H., Sasakawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shigella+manipulates+host+immune+responses+by+delivering+effector+proteins+with+specific+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Shigella manipulates host immune responses by delivering effector proteins with specific roles.</a> Frontiers in Immunology. 6, 219(2015).</li>
<li>Tran Van Nhieu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+confinement+of+calcium+responses+during+Shigella+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Actin-based confinement of calcium responses during Shigella invasion.</a> Nature Communications. 4, 1567(2013).</li>
<li>Niebuhr, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+PtdIns%284%2C5%29P%282%29+into+PtdIns%285%29P+by+the+S.+flexneri+effector+IpgD+reorganizes+host+cell+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Conversion of PtdIns(4,5)P(2) into PtdIns(5)P by the S. flexneri effector IpgD reorganizes host cell morphology.</a> The EMBO Journal. 21 (19), 5069-5078 (2002).</li>
<li>Konradt, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+flexneri+type+three+secretion+system+effector+IpgD+inhibits+T+cell+migration+by+manipulating+host+phosphoinositide+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+%26+Microbe%22%5BJournal%5D)">The Shigella flexneri type three secretion system effector IpgD inhibits T cell migration by manipulating host phosphoinositide metabolism.</a> Cell Host & Microbe. 9 (4), 263-272 (2011).</li>
<li>Friedrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intriguing+Ca2%2B+requirement+of+calpain+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">The intriguing Ca2+ requirement of calpain activation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 323 (4), 1131-1133 (2004).</li>
<li>Thomas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+fluorescent+Ca2%2B+indicator+properties+and+their+use+in+measuring+elementary+and+global+Ca2%2B+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals.</a> Cell Calcium. 28 (4), 213-223 (2000).</li>
<li>Sun, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Shigella+type+III+effector+IpgD+recodes+Ca2%2B+signals+during+invasion+of+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The Shigella type III effector IpgD recodes Ca2+ signals during invasion of epithelial cells.</a> The EMBO Journal. 36 (17), 2567-2580 (2017).</li>
<li>Allaoui, A., Menard, R., Sansonetti, P. J., Parsot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+Shigella+flexneri+IpgD+and+IpgF+genes%2C+which+are+located+in+the+proximal+part+of+the+mxi+locus%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Characterization of the Shigella flexneri IpgD and IpgF genes, which are located in the proximal part of the mxi locus.</a> Infection and Immunity. 61 (5), 1707-1714 (1993).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te verklaren.

Dit manuscript wordt het protocol dat we ontworpen om te volgen van lokale Ca2 + signalen tijdens de relatief korte kinetiek van een Shigella -invasie, evenals global Ca2 + reacties tijdens de uitgebreide kinetiek van Shigellabeschreven. Hieronder signalen kwesties kunnen worden gevonden die moeten worden aangepakt om het optimaliseren van de opsporing van Ca2 + toets terwijl het minimaliseren van elke bemoeienis met de biologische processen.
Che...

CA2 + regelt alle bekende cel procédés, met inbegrip van cel dood trajecten aan gastheer-pathogeen interacties1,2,3gerelateerde cytoskeletal reorganisatie en inflammatoire reacties. Onder fysiologische omstandigheden, basale cytosolische Ca2 + concentraties zijn laag, in de honderden nM-bereik, maar kunnen worden onderworpen aan tijdelijke verhogingen op agonist stimulatie. Deze variaties tonen vaak oscillerende gedrag door het optreden van pompen en kanalen in het plasma en endoplasmatisch reticulum membranen. Het patroon van deze oscillaties wordt gekenmerkt door de periode, duur en amplitude van Ca2 + toeneemt, en wordt gedecodeerd door cellen die, op zijn beurt leiden specifieke reacties tot in wat bekend als de Ca2 + code4,5 staat . Een aanhoudende stijging van de cytosolische Ca2 + concentratie onder pathologische omstandigheden kan leiden tot de dood van de cel die is gekoppeld aan de permeabilization van de mitochondriale membraan en de vrijlating van de pro-apoptotic of necrotische factoren6, 7.
Shigella, de verwekker van bacillaire dysenterie, binnenvalt epitheliale cellen door het injecteren van effectoren in cellen van de gastheer met een type III secretie systeem (T3SS)8,9. Een Shigella -invasie van cellen van de gastheer wordt geassocieerd met lokaal en mondiaal Ca2 + signalen ontlokte door de T3SS. Wat betreft de porie-vormende toxinen, de T3SS translocon dat wordt ingevoegd in de celmembranen van de gastheer en is vereist voor de injectie van T3SS effectoren waarschijnlijk is verantwoordelijk voor de activering van PLC en de inositol (1, 4, 5) trisphosphate (InsP3)-afhankelijke Ca2 + release. De combinatie van de gelokaliseerde PLC stimulatie en de accumulatie van gepolymeriseerde actine bij plaatsen van een Shigella invasie resultaat in een opslagruimte langdurige InsP3-afhankelijke Ca2 + release10. Het type III effector IpgD, een fosfatidyl 4,5 difosfaat (PIP2) -4-fosfatase, beperkt de lokale hoeveelheid PIP2, waardoor de controle van de hoeveelheid beschikbaar materiaal voor PLC voor het genereren van InsP3, die aan de opsluiting van lokale Ca2 bijdraagt + Reacties op11,12van de sites van de bacteriële invasie. Deze lokale Ca2 + reacties waarschijnlijk bijdragen tot de actine polymerisatie op Shigella invasie sites10. Global Ca2 + antwoorden die ook door Shigella, echter ontlokte zijn zijn overbodig voor de invasie van bacteriën proces maar leiden tot de opening van connexin hemichannels op het plasma-membraan en de vrijlating van ATP in de extracellulaire compartiment. Vrijgegeven ATP handelen op een wijze van paracrine, op zijn beurt, stimuleert Ca2 + oscillerende reacties in de cellen naast de geïnfecteerde cel. IpgD is ook verantwoordelijk voor het vormgeven van globale Ca2 + reacties in grillige geïsoleerde reacties met langzame dynamiek. Uiteindelijk, na een langdurige bacteriële infectie leidt IpgD tot de remming van InsP3-gemedieerde Ca2 + signalen. Via haar bemoeienis met Ca2 + signalering, IpgD vertragingen een Ca2 +-afhankelijke calpain activering leidt tot de demontage van focal hechting structuren en de voortijdige detachement van geïnfecteerde cellen13.
Terwijl Ca2 + signalen bij kritieke aspecten van pathogenese betrokken zijn, verhoogt het gebruik van een micro-organisme een aantal technische uitdagingen die niet in klassieke agonist studies voordoen zich. De protocollen beschreven hier gebruik maken van de gebruikte TL Ca2 + chemische indicator Fluo-4 die we ontworpen om te karakteriseren van lokale Ca2 + signalen tijdens een Shigella -infectie. Stappen van cruciaal belang voor het opsporen van deze signalen worden besproken, evenals procedures voor hun kwantitatieve analyse die vereist is voor het karakteriseren van de rol van bacteriële effectoren in Ca2 + signalering geïmplementeerd.

<table><tbody><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Metamorph versie 7.7</td><td>Universal Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoolLED verlichtingssysteem pE-2</td><td>Roper Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>micro-schaal 35 mm, hoog&nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>81156</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy (TCS) bouillon</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11768</td></tr><tr><td>TCS agar</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>B11043</td></tr><tr><td>Congo rood</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>75768</td></tr><tr><td>M90T-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>Shigella flexneri serotype V. dat de AfaE adhesine tot expressie brengt</td><td></td></tr><tr><td>ipgD-AfaE</td><td>Sun et al. 2017</td><td>isogeen ipgD mutante stam die de AfaE adhesine tot expressie brengt</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging ca2 + reacties tijdens shigella besmetting van epitheliale cellen

Imaging Ca2+ Responses During Shigella Infection of Epithelial Cells

CA2 + is een alomtegenwoordige ion bij alle bekende cellulaire processen betrokken zijn. Terwijl de globale Ca2 + reacties kunnen invloed hebben op het lot van de cel, reguleren lokale variaties in gratis Ca2 + cytosolische concentraties, gekoppeld aan het bevrijden van interne winkels of een toestroom via plasmamembraan kanalen, corticale cel processen. Ziekteverwekkers die voldoen aan anders binnenvallen gastheer cellen trigger een reorganisatie van het cytoskelet van de actine ten grondslag liggen aan de host plasmamembraan, die waarschijnlijk van invloed op zowel lokale als globale Ca2 + signalering. Omdat deze gebeurtenissen bij lage frequenties in een pseudo-stochastische wijze over uitgebreide kinetiek voordoen, verhoogt de analyse van Ca2 + signalen veroorzaakt door pathogenen grote technische uitdagingen die moeten worden aangepakt.
Wij rapporteren hier protocollen voor de detectie van globale en lokale Ca2 + signalen op een Shigella besmetting van epitheliale cellen. In deze protocollen, artefacten gekoppeld aan een langdurige blootstelling en photodamage geassocieerd met de excitatie van Ca2 + fluorescerende sondes zijn daarvoor door strikt de overname parameters controle over bepaalde perioden tijdens een Shigella invasie. Procedures om te analyseren rigoureus de amplitude en frequentie van globale cytosolische Ca2 + signalen tijdens uitgebreide infectie kinetiek met behulp van de chemische sonde Fluo-4 ten uitvoer worden gelegd.

Shigella invasie wordt geassocieerd met atypische langdurige lokale Ca2 + antwoorden:
Naar aanleiding van het bovengenoemde protocol, Fluo-4-loaded HeLa cellen werden uitgedaagd met WT Shigella en stream acquisities werden uitgevoerd om te analyseren van Ca2 + signalen. Een representatieve experiment is afgebeeld in Figuur 1, met time-lapse beelden serie van de i...

Hier presenteren we protocollen om te visualiseren calcium (Ca2 +) Reacties ontlokte door HeLa cellen besmet door Shigella. Door het optimaliseren van de parameters van een bacteriële infectie en imaging met Ca2 + fluorescerende sondes, worden atypische globale en lokale Ca2 + signalen veroorzaakt door bacteriën over een groot bereik van de kinetiek van de infectie gekenmerkt.

Imaging Ca2 + reacties tijdens Shigella besmetting van epitheliale cellen

Ca2+ is a ubiquitous ion involved in all known cellular processes. While global Ca2+ responses may affect cell fate, local variations in free Ca2+ ...

Het algemene doel van deze fluorescentiemicroscopie-analyse met behulp van chemische sondes is om lokale en globale calciumreacties te analyseren die worden veroorzaakt door gastheercellen tijdens infectie door pathogene Shigella. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van cellulaire microbiologie, zoals door pathogenen geïnduceerde signalering die leidt tot herstructurering van het cytoskelet of celdood. Het grote voordeel van deze techniek is dat door het gebruik van chemische sondes men lokale calciumsignalen kan volgen die geassocieerd zijn met lokale processen die worden afgeleid door de ziekteverwekker.Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in deze methode het moeilijk vinden vanwege het instellen van parameters die het mogelijk maken om lokale calciumsignalen te volgen terwijl de integriteit van biologische monsters wordt behouden. Om te beginnen, plateer wildtype Shigella die de AfaE-adhesie tot expressie brengt op een trypticase soy of TCS agarplaat die 0,01% Congorood bevat en incubeer de platen 18 uur bij 37 graden Celsius. Bereid voorculturen voor van de gestreepte platen door drie rode kolonies te plukken en TCS-bouillon te inoculeren met 75 microgram per milliliter ampicilline.Laat de vloeibare culturen groeien in een schudincubator bij 37 graden Celsius en 200 tpm gedurende 16 uur. Injecteer vervolgens TCS met de bacterievoorcultuur bij een 1:100 verdunning. Incubeer de cultuur bij 37 graden Celsius in een schudincubator bij 200 tpm gedurende twee uur.Zorg ervoor dat de optische dichtheid bij 600 nanometer 0,2 tot 0,4 is. Centrifugeer de cultuur bij 13.000 g en 21 graden Celsius gedurende twee minuten en suspendeer het pellet opnieuw in een equivalent volume EM-medium. Verdun de bacteriesuspensie in EM-buffer tot een uiteindelijke OD 600 van 0,1 en gebruik deze onmiddellijk of bewaar deze bij 21 graden Celsius en gebruik deze binnen de volgende 60 minuten.Laat HeLa-cellen groeien in DMEM met één gram per liter glucose, aangevuld met 10%FCS en laat de cultuur groeien bij 37 graden Celsius met 10%CO2. Laat TC7-cellen groeien in DMEM met 4,5 gram per liter glucose, 10%FCS en niet-essentiële aminozuren en laat de cultuur groeien bij 37 graden Celsius en 10%CO2. Voor celonderhoud, verdeel de cellen regelmatig om groeiremming door contact te voorkomen die verband houdt met confluente toestanden.Dit is cruciaal voor een hoge calciumprobelading en transfectie-efficiëntie. Trypsiniseer en tel de TC7-cellen. De dag vóór het experiment met HeLa-cellen, plateer de cellen op steriele, 25 millimeter diameter ronde deksels in zes-well platen met een dichtheid van drie keer 10 tot de vijfde cellen per well.Vervolgens, om polarisatie toe te laten vóór de experimenten, zet de cellen uit bij vier keer 10 tot de vijfde cellen per well en incubeer ze gedurende vijf tot zeven dagen, waarbij het medium elke dag wordt vervangen. Op de dag van het experiment, verwijder het medium en gebruik één milliliter EM-medium om de cellen drie keer te wassen. Laad de cellen met drie micromolair Fluo-4 AM en EM-buffer en incubeer de platen gedurende 30 minuten bij 21 graden Celsius.Was de monsters drie keer met EM-buffer, voeg vervolgens één milliliter EM-buffer toe en incubeer de cellen bij 21 graden Celsius om de hydrolyse van de AM-groep mogelijk te maken. Plaats het deksel met de met Fluo-4 geladen cellen in een beeldvormings- of glazen bodemkamer. Gebruik EM-buffer om het monster drie keer te wassen om verbindingen te verwijderen die mogelijk het gevolg zijn van cellyse.Voeg vervolgens één milliliter EM-buffer toe. Plaats de kamer op een omgekeerde fluorescentiemicroscoop-standaard verwarmd tot 33 graden Celsius. Selecteer een microscopieveld en stel de acquisitieparameters in, inclusief belichtingstijd en binning indien nodig om het Fluo-4 fluorescente signaal te optimaliseren.Om bacteriën aan het monster toe te voegen, verwijder voorzichtig 500 microliter EM-buffer uit de kamer en voeg 500 microliter van de bacteriesuspensie toe om een ​​uiteindelijke OD 600 van 0,05 te verkrijgen. Voer onmiddellijk een acquisitie uit of wacht 10 minuten om de bacteriën te laten sedimenteren op de cellen. Aan het einde van de acquisitiestroom, verkrijg een fasecontrastafbeelding van het geselecteerde veld om de bacteriën die contact maken met de cellen te visualiseren, en de membraanplooien geassocieerd met bacteriële invasieplaatsen.Herhaal de acquisitieprocedure met tussenpozen die geschikt zijn voor de duur van de beeldacquisities, bestandsopslag en selectie van een nieuw veld om het hele proces te dekken. Aan het einde van de acquisitieprocedure, voeg toe aan het monster twee micromolair van de calciumionofoorionomycine om de maximale amplitude van de calciumsignalen te bepalen. Verkrijg beelden om de drie tot vijf seconden totdat het signaal stabiliseert, meestal gedurende minder dan 10 minuten.Volg door het calciumchelator EGTA toe te voegen tot een uiteindelijke concentratie van 10 millimolair om het fluorescente signaal in afwezigheid van calcium te bepalen. Verkrijg beelden om de drie tot vijf seconden totdat het signaal stabiliseert, meestal gedurende minder dan 10 minuten. Voer beeldafhankelijkheid uit volgens het tekstprotocol.In dit experiment werden Fluo-4 geladen HeLa-cellen uitgedaagd met wildtype Shigella en stream-acquisities werden uitgevoerd om calciumsignalen te analyseren. Een time-lapse beeldserie van de fluorescentie-intensiteit van de Fluo-4-probe wordt gemiddeld in een gebied van belang voor een enkele cel, en de overeenkomstige fasecontrastafbeelding wordt getoond. Atypische lokale toenames in vrij cytosolisch calcium worden waargenomen op de Shigella-invasieplaats met een variërende amplitude en duur variërend van 2,5 tot vijf seconden, gevolgd door globale toenames in de geïnfecteerde cel.In dit voorbeeld induceerde een isogene mutantenstam, gedeficiënt voor de type III-effector IpgD, een fosfatidy 4, 5-bisfosfaatfosfatase, meer globale en minder atypische lokale reacties met lange duur in vergelijk

imaging-ca2-responses-during-shigella-infection-of-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Source: Vonaesch, P. et. al., Immunofluorescence Analysis of Stress Granule Formation After Bacterial Challenge of Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the infection of epithelial cells with the pathogenic bacterium Shigella flexneri and the resulting host cellular response. Bacterial effector proteins disrupt host translation, triggering the formation of membrane-less organelles called stress granules, which reflect the cell's adaptive response to infection.

Stress Granule Formation During Shigella Infection of Cancerous Epithelial Cells

Source: Poore, K., et al. Epithelial Cell Infection Analyses with Shigella. J. Vis. Exp. (2024)This video demonstrates an in vitro assay to assess Shigella invasion and intracellular replication in human colonic epithelial monolayers. It highlights steps for infection, antibiotic selection, host cell lysis, and recovery of intracellular bacteria for downstream analysis.

Intracellular Replication Assay for Shigella in Human Colonic Epithelial Cells

This video demonstrates a technique for detecting local and global calcium ion response upon Shigella infection of human epithelial cells. Shigella invades host cells and releases invasion effectors, impacting intracellular calcium levels. The amplitude and frequency of the local and global cytosolic calcium are studied using a fluorescent indicator.

An Imaging Technique to Study the Calcium Response in Bacteria-Infected Cells

We beschrijven een werkwijze voor het volgen van de endomembraan scheuren opgewekt door de intracellulaire...

Single Cell Metingen van vacuole Rupture Veroorzaakt door intracellulaire pathogenen

Pathogeen verspreiding tegen te gaan, gastheercellen reorganiseren hun cytoskelet om bacteriën te grendelen en veroorzaken autofagie. Met behulp van Shigella infectie van weefselkweek cellen, gastheer en pathogeen determinanten ten grondslag liggen aan dit proces worden geïdentificeerd en gekarakteriseerd. Met behulp van zebravis modellen van Shigella-infectie, de rol van de ontdekte moleculen en mechanismen worden onderzocht in vivo.

Gebruik van<em&gt; Shigella flexneri</em&gt; Naar Autophagy-cytoskelet interacties te bestuderen

Het huidige protocol beschrijft infectietests om de therapietrouw, invasie en intracellulaire replicatie van Shigella te ondervragen met behulp van in vitro epitheelcellijnen.

Epitheelcelinfectieanalyses met Shigella

M-cellen in een gespecialiseerde follikel geassocieerd epitheel die plaques van Peyer spelen een belangrijke rol voor de mucosale immunosurveillance in de darm-geassocieerd lymfoïd weefsel. Hier hebben we beschreven evaluatiemethode voor bacteriële transcytose door...

Toepassing van een muis geligateerd Peyer&#39;s Patch Intestinale Loop Assay om Bacteriële opname evalueren door M-cellen

We beschrijven de snelle isolatie van primaire murine type II alveolaire epitheelcellen (AECII) door flowcytometrische negatieve selectie. Deze AECII vertonen hoge levensvatbaarheid en zuiverheid en zijn geschikt voor diverse functionele en moleculaire studies over hun rol bij luchtwegaandoeningen zoals auto of infectieziekten.

Flowcytometrische Isolatie van primaire Murine Type II alveolaire epitheelcellen voor Functionele en moleculaire studies

Kolonisatie van de muriene nasopharynx met Streptococcus pneumoniae en de daaropvolgende extractie van aanhangende of gerekruteerde cellen wordt beschreven. Deze techniek omvat het spoelen van de nasopharynx en het opvangen van de vloeistof door de nares en is aanpasbaar voor verschillende uitlezingen, waaronder differentiële celkwantificering en analyse van mRNA-expressie in situ.

Karakterisering van inflammatoire reacties tijdens intranasale kolonisatie met Streptococcus pneumoniae

Dit protocol detailleert een methode voor het isoleren van antigen-presenterende cellen uit humane thymus via verschillende stappen enzymatische afbraak van het weefsel, gevolgd door centrifugatie van de enkele celsuspensie en tenslotte magnetische en / of FACS sorteren van celpopulaties plaats.

Isolatie van myeloïde dendritische cellen en epitheelcellen van Human Thymus

Ontdek fluorescentiemicroscopie met chemische probes om lokale en globale calciumreacties te analyseren tijdens Shigella-infectie van HeLa-cellen. Deze methode optimaliseert visualisatie van pathogeen-geïnduceerde signalering.

Imaging Ca^{2 +} reacties tijdens Shigella besmetting van epitheliale cellen

Meer video's verkennen