Genoom-brede Surveillance van transcriptie fouten in eukaryote organismen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van transcriptionele mutagenese, zoals welke RNA-polymerase-subeenheden of biologische processen de getrouwheid van transcriptie bepalen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de meting van endogene transcriptiefouten in de transcriptomen van eukaryote organismen mogelijk maakt. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn in dit protocol worstelen vanwege de lengte en complexiteit van de test en de noodzaak van geavanceerde bio-informatica om de gegevens te interpreteren.

Om het protocol te beginnen, circulariseer de RNA-fragmenten door 20 microliter van het eerder bereide monster gedurende één minuut bij 65 graden Celsius te denatureren met warmte. Na één minuut plaatst u het monster onmiddellijk twee minuten op ijs. Voeg vervolgens vier microliter van 10x T4 RNA ligase buffer toe, vier microliter van 10 milliMolar ATP, één microliter van RNase inhibitor, één microliter van nuclease vrij water en acht microliter van 50%polyethyleenglycol of PEG.

Meng vervolgens het monster grondig door te vortexen. Voeg vervolgens twee microliter van 10 eenheden per microliter van T4 RNA ligase een toe. Meng het monster opnieuw door te pipetten en incubeer het gedurende twee uur bij 25 graden Celsius in een thermocycler met de dekseltemperatuur ingesteld op 30 graden Celsius.

Na de twee uur durende incubatie, voegt u 10 microliter nuclease vrij water toe aan het monster en reinig het monster met een oligo opruiming en concentratie kit. Eluteer het monster in 20 microliter nuclease vrij water. Om de circulaire RNA-moleculen te reverse transcriberen, voegt u vier microliter van 10 milliMolar dNTPs, vier microliter van 50 nanogram per microliter willekeurige hexamers en negen microliter van nuclease vrij water toe aan negen microliter RNA.

Meng grondig door te pipetten en denatureer het monster gedurende één minuut bij 65 graden Celsius. Na het denatureren van het monster, plaatst u het twee minuten op ijs. Voeg acht microliter van 5x eerste streng synthese buffer, twee microliter van 0,1 milliMolar DTT en vier microliter van 200 eenheden per microliter reverse transcriptase toe aan het monster en meng door te pipetten.

Incubeer het monster gedurende 10 minuten bij 25 graden Celsius met het deksel ingesteld op vijf graden Celsius hoger dan de incubatietemperatuur. Incubeer vervolgens het monster gedurende 20 minuten bij 42 graden Celsius met het deksel ingesteld op 47 graden Celsius. Eluteer het monster in 42 microliter elutieoplossing na reiniging met de opruiming en concentrator kit.

Gebruik de tweede streng synthese kit om een dubbelstrengs cDNA-bibliotheek te genereren. Plaats de monsters op ijs en voeg 30 microliter NF water toe aan 38 microliter van uw monster. Voeg vervolgens acht microliter van 10x tweede streng buffer en vier microliter van tweede streng enzym toe en meng het monster door voorzichtig te pipetten voordat u het gedurende twee en een half uur bij 16 graden Celsius incubeert.

Reinig de monsters met de oligo opruiming en concentratie kit voor 100 microliter reacties en eluteer de monsters in 38 microliter nuclease vrij water. Meng de eindreparatiereactie door te pipetten en incubeer deze gedurende 30 minuten bij 20 graden Celsius. Volg de incubatie van 20 graden Celsius met een incubatie van 30 minuten bij 65 graden Celsius.

Verdun eerst de adapters voor next generation sequencing tienvoudig in 10 milliMolar tris HCl tot een eindconcentratie van 1,5 microMolar. Voeg vervolgens 2,5 microliter van verdunde adapter en één microliter van ligatieverhoger toe aan elk monster en meng ze door te vortexen. Voeg vervolgens 15 microliter van blunt TA ligase master mix toe.

Pipetteer het monster op en neer om te mengen en incubeer het gedurende 15 minuten bij 20 graden Celsius. Voeg vervolgens drie microliter van uracil specifiek excisiereagens enzym toe en incubeer het monster gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius. Nadat de ligatie voltooid is, voegt u 13,5 microliter van nuclease vrij water toe aan het monster voor een totaal volume van 100 microliter en gaat u verder met de grootteselectie.

Acclimatiseer magnetische kralen tot kamertemperatuur. Voeg 30 microliter van acclimatiseerde, gesuspendeerde magnetische kralen toe aan elk monster en meng door te pipetten. Breng het monster over naar een 1,5 milliliter buisje en incubeer het gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.

Plaats het monster gedurende vijf minuten op een magnetische standaard om de kralen van het supernatant te scheiden. Breng het supernatant over naar een nieuw 1,5 milliliter buisje en doe de magnetische kralen weg. Voeg een verse aliquot van 15 microliter van magnetische kralen toe aan elk monster.

Meng grondig door te pipetten en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Plaats de monsters op een magnetische rack en incubeer ze gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Verwijder vervolgens voorzichtig en doe de supernatanten weg, zorg ervoor dat u de kralen niet verstoort.

Voeg 200 microliter van 80%vers bereid ethanol toe aan elk van de monsters zonder de gepelletiseerde magnetische kralen te verstoren en incubeer gedurende 30 seconden. Verwijder vervolgens volledig alle sporen van ethanol uit de monsters en laat de kralen vijf minuten aan de lucht drogen, maar wees voorzichtig om de kralen niet te veel te drogen. Om de monsters van de kralen te eluteren, verwijdert u de buisjes van de magnetische standaard.

Voeg 19 microliter van 10 milliMolar tris HCl toe. Pipetteer de mix meerdere keren omhoog en omlaag om de kralen te resuspenderen en incubeer de monsters gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Plaats de monsters terug op de magnetische standaard en incubeer ze gedurende vijf minuten om de kralen van het supernatant te scheiden.

Verwijder voorzichtig 15 microliter van het supernatant dat de gezuiverde, groottegeselecteerde cDNA-bibliotheken bevat uit de buisjes en breng het over naar een vers 1,5 milliliter buisje. Voeg vijf microliter van universele primer en vijf microliter van een unieke index primer toe aan elke gezuiverde cDNA-bibliotheek en meng ze grondig door te pipetten. Controleer zorgvuldig de polymerase master mix op kristallen en andere neerslagen en verwarm de master mix met de hand totdat de neerslagen zijn opgelost.

Voeg 25 microliter van de polymerase master