Name: Netvlies Cryo-secties, geheel-Mounts en hypotone geïsoleerde therapieën voorbereidingen voor immunohistochemische visualisatie van microvasculaire Pericytes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Leer drie weefselpreparatietechnieken voor immunohistochemische visualisatie van retinale microvasculaire pericyten bij ratten: cryosecties, whole-mounts en hypotone isolatie. Deze methoden ondersteunen onderzoek naar pericytengedrag in de oogheelkunde.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Het onderzoek werd gefinancierd door het Lundbeck Foundation, Denemarken.

Het protocol werd geoptimaliseerd en bij volwassen mannelijke albino ratten laten zien. In alle experimentele procedures, werden de dieren behandeld volgens de verordeningen in de ARVO instructie voor het gebruik van dieren in Ophthalmic en visie onderzoek. Dieren werden euthanized door kooldioxide en latere cervicale dislocatie.
1. rat retinale weefsel preparaten
<ol><li>
Cryo-sectie
	<ol>
<li>Maak posterieure en anterieure ~0.5 cm spleten van in het ooglid rat met een scalpel.<ol>
<li>Optioneel: Met een diathermie-brander, markeren het oog de binnenste hoek met het oog op een uniforme manier oriënteren tijdens het insluiten en zorgen voor verticale cryostaat segmenteren via de oogzenuw.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Pak het oog met een tang en zorgvuldig naar de kant bloot van het omringende weefsel te kantelen. Enucleate het oog door het bezuinigen met een schaar van de dissectie in het bindweefsel en gespierd weefsel. Let op: Trek niet aan het oog te hard zoals overmatige druk op de oogzenuw kan retinale detachement.</li>
		<li>Het oog kort gezegd in 4% formaldehyde in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) te stabiliseren alvorens een eerste gat in het hoornvlies limbus door lichte druk uit met het topje van een scalpel.</li>
		<li>Onder een Microscoop, snijd u langs het hoornvlies limbus met een dissectie schaar aan Verwijder het hoornvlies en de lens met een tang vóór het dompelen in 4% formaldehyde in PBS voor 2 – 4 h.</li>
		<li>Spoel opeenvolgend in Sörensen van fosfaatbuffer met 10% sucrose en 25% sucrose.</li>
		<li>Insluiten in Yazulla medium bereid met 3% gelatine van varkens huid en 30% albumine van kip-ei-wit. Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken hier met weefsel opslag bij-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Geheel-mount
	<ol>
<li>Maak posterieure en anterieure ~0.5 cm spleten in het ooglid rat met een scalpel.</li>
		<li>Pak het oog met een tang en zorgvuldig naar de kant bloot van het omringende weefsel te kantelen. Enucleate het oog door het bezuinigen met een schaar van de dissectie in het bindweefsel en gespierd weefsel. Let op: Trek niet aan het oog te hard zoals overmatige druk op de oogzenuw kan retinale detachement.</li>
		<li>Het oog kort gezegd in 4% formaldehyde in PBS te stabiliseren alvorens een eerste gat in het hoornvlies limbus door lichte druk uit met het topje van een scalpel.</li>
		<li>Onder een Microscoop, snijd u langs het hoornvlies limbus met een dissectie schaar aan Verwijder het hoornvlies en de lens met een tang.</li>
		<li>Het netvlies van het retinale pigment epitheel richting de oogzenuw scheiden met een tang met kleine opening bewegingen om te voorkomen dat grote scheuren.</li>
		<li>Het netvlies op de oogzenuw gratis met een dissectie schaar en vier spleten van een paar millimeter lengte maken vanuit de retinale periferie naar het hoofd van de oogzenuw.</li>
		<li>Verspreid het netvlies op een glasplaatje en laat gedurende 5-10 min. drogen.</li>
		<li>Oplossen in 4% formaldehyde voor 20-30 min door druipend van formaldehyde op het netvlies. Let op: Niet rechtstreeks op het netvlies van toepassing als het van het glas loskoppelen kan.</li>
		<li>Spoel met PBS. Voor optimale resultaten, immuno-vlek direct na het spoelen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Hypotone isolatie
	<ol>
<li>Maak posterieure en anterieure ~0.5 cm spleten in het ooglid rat met een scalpel.</li>
		<li>Pak het oog met een tang en zorgvuldig naar de kant bloot van het omringende weefsel te kantelen. Enucleate het oog door het bezuinigen met een schaar van de dissectie in het bindweefsel en gespierd weefsel. Let op: Trek niet aan het oog te hard zoals overmatige druk op de oogzenuw kan retinale detachement.</li>
		<li>Maak een eerste gat op het hoornvlies limbus door lichte druk uit met het topje van een scalpel.</li>
		<li>Onder een Microscoop, snijd u langs het hoornvlies limbus met een dissectie schaar aan Verwijder het hoornvlies en de lens met een tang.</li>
		<li>Het netvlies van het retinale pigment epitheel naar de kop van de oogzenuw scheiden met een tang met kleine opening bewegingen om te voorkomen dat grote scheuren.</li>
		<li>Gratis het netvlies op de oogzenuw met dissectie schaar, plaats van het netvlies in 1 mL gedeïoniseerd water in een 24-well-plate en schud bij 200 omwentelingen per minuut met een 1,5 mm trillingen baan gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Opmerking: Hierna, het netvlies verschijnt dat minder gedefinieerd aan de randen.</li>
		<li>Voeg toe 200 U DNAse 1 te distantiëren van het puin lysed cellen van het retinale therapieën en schud gedurende een ander 30 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Puin zou kunnen beginnen te vormen in de putjes.</li>
		<li>Spoel minimaal 3 keer in gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten met schudden bij 150-300 rpm neuronale cel puin te verwijderen. Het netvlies moet transparanter worden met elk indicatief voor de verwijdering van neuronale cellulaire puin spoelen.<ol>
<li>Gebruik een donkere achtergrond te zoeken in de 24-well plaat om te zien duidelijk het doorschijnende geïsoleerde retinale therapieën.</li>
			<li>(Optioneel): als de therapieën niet vrij van neuronale lagen (semi-transparant) op dit moment hetzij meer spoelen stappen toevoegen, het schudden snelheid verhogen of een pipet kunt gecombineerd vloeistof op de therapieën. Let op: Een van de optionele stappen kan schade aan de therapieën.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Corrigeer 10 min in 1 mL 4% paraformaldehyde in PBS bij kamertemperatuur en spoelen 3 keer in PBS. Opmerking: Het protocol kan worden onderbroken hier met weefsel opslag bij 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Immunohistochemistry
<ol><li>
-Verkleuring van de cryo-secties
	<ol>
<li>Knip 10 µm cryo-delen van het netvlies gelatine-ingesloten als verticale segmenteren via de oogzenuw en plaats de cryo-delen op een glasplaatje en laat drogen (minimaal 1 h).</li>
		<li>Het glasplaatje in PBS met 0,25% dompelen Triton X-100 (PBS-T) gedurende 15 minuten.</li>
		<li>1:100 PDGFRβ en 1:500 NG2 primaire antilichamen verdund in PBS-T + 1% BSA op de cryo-sectie druppelen en na een nacht bebroeden in incubatie kamers bij 4 ° C.</li>
		<li>Het glasplaatje 2 keer in PBS-T gedurende 15 min. onderdompelen en druppelen van 1:100 anti-muis Alexa Fluor 594-linked contracten en 1:100 anti-konijn FITC-linked secundaire antilichamen verdund in PBS-T met 3% BSA op de cryo-delen.</li>
		<li>Incubeer het glasplaatje 1 uur bij kamertemperatuur in het donker.</li>
		<li>Spoel het glasplaatje in PBS-T 2 x 15 min. Opmerking: Optionele: voor twee- en driepersoonskamers immunefluorescentie kleuring, opeenvolgende kleuring kan worden uitgevoerd door het procédé van 2.1.3 aan 2.1.6 twee of drie keer, respectievelijk.</li>
		<li>Monteer de gebeitst cryo-delen met anti-fading montage middellange met DAPI en een dekglaasje aan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kleuring voor geheel-mount
	<ol>
<li>PBS-T druppelen op het geheel-mount en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.</li>
		<li>Giet af en 1:100 PDGFRβ en 1:500 NG2 primaire antilichamen verdund in PBS-T + 1% BSA druppelen en na een nacht bebroeden in vochtige kamers bij 4 ° C.</li>
		<li>Giet af en druppelen op PBS-T te spoelen het glasplaatje in 2 x 15 min.</li>
		<li>Giet af en druppelen op 1:100 anti-konijn Cy2- en 1:100 anti-muis Cy3 alternerende secundair antilichaam verdund in PBS-T met 3% BSA naar Incubeer 1 uur in een vochtige kamer bij kamertemperatuur in het donker.</li>
		<li>Giet af en druppelen op PBS-T te spoelen in 2 x 15 min in het donker. Opmerking: Optionele: voor twee- en driepersoonskamers immunefluorescentie kleuring, opeenvolgende kleuring kan worden uitgevoerd door het procédé van 2.2.2 aan 2.2.5 twee of drie keer, respectievelijk.</li>
		<li>Monteer de gebeitst geheel-mount met anti-fading montage middellange met DAPI en een dekglaasje aan.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kleuring van hypotone geïsoleerde therapieën
	<ol>
<li>Blokkeren de hypotone geïsoleerde therapieën 1 h met schudden op 100 rpm en kamertemperatuur met 500 µL per putje van 10% ezel serum verdund in PBS.</li>
		<li>Na een nacht bebroeden bij kamertemperatuur en schud op 100 rpm met 600 µL per putje van 1:100 PDGFRβ en 1:500 NG2 primaire antilichamen in 10% ezel serum in PBS is verdund.</li>
		<li>Spoel de retinale netwerk 3 x in PBS voor 5 min en broeden in 1:100 anti-muis Alexa Fluor 594-linked contracten en 1:100 anti-konijn FITC-linked secundaire antilichamen verdund in 10% serum van de ezel in PBS schudden op 100 rpm en kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker.</li>
		<li>Spoel in PBS-T voor 5 min en incubeer in 0,2 ng/mL DAPI in PBS-T gedurende 15 minuten gevolgd door 3 x 5 min gespoeld in PBS-T in het donker.</li>
		<li>Knip het puntje van een plastic pipet van Pasteur, het bevochtigen met PBS-T en gebruiken voor het overbrengen van het netvlies netwerk naar een kamer van 4-well glasplaatje. Opmerking: De moistening stap is belangrijk om te voorkomen dat het netvlies therapieën vasthouden aan de binnenkant van de pipet van Pasteur.</li>
		<li>Ontvouwen van de retinale therapieën. Raak de retinale therapieën met een tang als dit leiden de therapieën tot kan te verwarren. Opmerking: Ontplooiing kan gedaan worden door het kantelen van de kamer dia heen en weer of zuigen druppels vloeistof op het netvlies therapieën.</li>
		<li>Verwijder het medium van de putten. De oppervlaktespanning van de vloeistof zal de therapieën op de bodem van de dia afvlakken.</li>
		<li>Zorgen voor juiste ontvouwen onder een Microscoop voordat het verwijderen van het plastic wells van de dia van de kamer.</li>
		<li>Monteer de gebeitst therapieën met anti-fading montage medium en een dekglaasje aan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+retinopathy%3A+Breaking+the+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pathophysiology%22%5BJournal%5D)">Diabetic retinopathy: Breaking the barrier.</a> Pathophysiology. , (2017).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes+in+Brain+Injury+and+Repair+After+Ischemic+Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Stroke+Research%22%5BJournal%5D)">Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke.</a> Translational Stroke Research. , (2016).</li>
<li>Trost, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+and+Retinal+Pericytes%3A+Origin%2C+Function+and+Role%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20(2016).</li>
<li>Ramos, D., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRamos%2C+D+%22Confocal+Laser+Microscopy+-+Principles+and+Applications+in+Medicine%2C+Biology%2C+and+the+Food+Sciences%22">Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences</a>. Lagali, N. , InTech. (2013).</li>
<li>Moran, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurovascular+cross+talk+in+diabetic+retinopathy%3A+Pathophysiological+roles+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Heart+and+Circulatory+Physiolog%22%5BJournal%5D)">Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications.</a> American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).</li>
<li>Henkind, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5357346">Microcirculation of the peripapillary retina.</a> Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).</li>
<li>Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+a+pericyte%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">What is a pericyte?</a> Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).</li>
<li>Fernandez-Bueno, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+Characterization+of+Retina+Neuroglia+Modifications+in+Diabetic+Zucker+Diabetic+Fatty+Rats%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).</li>
<li>Yu, D. -Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+morphological+characteristics+of+the+retinal+and+choroidal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).</li>
<li>Allen, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severity+of+middle+cerebral+artery+occlusion+determines+retinal+deficits+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Neurology%22%5BJournal%5D)">Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats.</a> Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).</li>
<li>Kyhn, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+retinal+ischemia+caused+by+controlled+low+ocular+perfusion+pressure+in+a+porcine+model.+Electrophysiological+and+histological+characterisation%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation.</a> Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).</li>
<li>Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+CGRP+and+its+receptor+components+CLR+and+RAMP1+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina.</a> Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).</li>
<li>Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+renin-angiotensin+system+and+the+developing+retinal+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).</li>
<li>Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+localization+and+characterization+of+putative+mesenchymal+stem+cell+markers+in+the+retinal+capillary+network+of+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Cells+Tissues+Organs%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents.</a> Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).</li>
<li>Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+immunofluorescent+staining+of+the+neonatal+mouse+retina+to+investigate+angiogenesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50546(2013).</li>
<li>Park, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastic+roles+of+pericytes+in+the+blood-retinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier.</a> Nature Communications. 8, 15296(2017).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).</li>
<li>Lange, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravitreal+injection+of+the+heparin+analog+5-amino-2-naphthalenesulfonate+reduces+retinal+neovascularization+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice.</a> Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).</li>
<li>Higgins, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diltiazem+reduces+retinal+neovascularization+in+a+mouse+model+of+oxygen+induced+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy.</a> Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).</li>
<li>Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin+digest+protocol+to+analyze+the+retinal+vasculature+of+a+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. , e50489(2013).</li>
<li>Hazra, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+X+receptor+modulates+diabetic+retinopathy+outcome+in+a+mouse+model+of+streptozotocin-induced+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes.</a> Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).</li>
<li>Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+antioxidant+gene+therapy+on+the+development+of+diabetic+retinopathy+and+the+metabolic+memory+phenomenon%5BTitle%5D)+AND+%22Graefe%27s+Archive+for+Clinical+and+Experimental+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon.</a> Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).</li>
<li>Dagher, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+rat+and+human+retinas+predict+a+role+for+the+polyol+pathway+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).</li>
<li>Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteolytic+degradation+of+VE-cadherin+alters+the+blood-retinal+barrier+in+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes.</a> Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).</li>
<li>Gustavsson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+cellular+adhesion+molecule-1+%28VCAM-1%29+expression+in+mice+retinal+vessels+is+affected+by+both+hyperglycemia+and+hyperlipidemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia.</a> PLoS One. 5, e12699(2010).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+blood+flow+in+the+retinal+trilaminar+vascular+network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network.</a> Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Wij presenteren drie retinale voorbereiding technieken die kunnen worden toegepast in de studie van microvasculaire retinale pericytes. Hieronder, wij bieden een vergelijking tussen elk van de methoden en markeer kritische stappen in de protocollen.
Met de cryo-segmenteren, het netvlies wordt gesneden in Sagittaal secties en vandaar, is het mogelijk om talrijke exemplaren te verkrijgen door het dezelfde netvlies. De cijfervormen secties die voortvloeien uit deze methode maken het een ideale ke...

Netvlies pericytes zijn de focus van vele onderzoekslaboratoria zoals deze cellen een belangrijke rol in de integriteit van de therapieën spelen. Pathologische condities zoals diabetische retinopathie1, ischemie2en glaucoom3 hebben vasculaire kenmerken die betrekking hebben op de functie van pericytes. Pericytes zijn te vinden in de innerlijke retinale capillaire pelxi. De centrale netvlies slagader die de innerlijke netvlies takken in twee lagen van capillaire pelxi levert. Het innerlijke vasculaire bed ligt tussen de ganglion cel en de binnenste nucleaire lagen. De diepere laag is meer dichte en complex en is gelokaliseerd tussen de binnenste en buitenste lagen van de nucleaire4,5. Bovendien, bevatten sommige delen van het netvlies ook een derde netwerk genoemd van de radiale parapapillary haarvaten. Dit zijn lange, rechte haarvaten, die tussen de zenuwvezels en zelden liggen anastomose met elkaar of de andere twee pelxi6. Binnen de capillaire muur, pericytes worden ingebed in het membraan van de kelder en lijn de abluminal kant van vasculaire endotheliale cellen.
Tot op heden is er geen unieke biologische marker van deze pericytes die hen van andere vasculaire cellen onderscheiden kunt. Bloedplaatjes afkomstige groei factor receptor β (PDGFRβ) en zenuw/gliale antigeen 2 (NG2) zijn veelgebruikte markeringen die beide op pericytes maar ook andere vasculaire cellen presenteren. Identificatie van de pericytes wordt verder bemoeilijkt door het bestaan van pericyte subsets kunt weergeven die in morfologie en eiwit expressie7 verschillen. Op dit moment de beste identificatie is gebaseerd op een combinatie van eiwit markers en de karakteristieke positionering van de pericyte in de vasculaire muur. Wij tonen hier drie verschillende weefsel voorbereiding technieken voor PDGFRβ/NG2 Immunohistochemie van rat retinale microvasculaire pericytes, dat wil zeggen, cryo-secties, geheel-mounts en hypotone isolatie van de vasculaire netwerk.
Met cryo-secties, worden het netvlies en de sclera gesneden door de oogzenuw. Dit zorgt voor de visualisatie van alle gelaagde structuren van neuronen. De afzonderlijke tien lagen van het netvlies zijn herkenbaar als het uitwisselen van nucleaire en axonale/dendritische structuren die kunnen worden gevisualiseerd met vlekken zoals Haematoxyline/eosine of fluorescerende nucleaire 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. De metabole eisen verschillen tussen de lagen9 en het biedt een methode om te bepalen dikte of totaal gebrek aan een specifieke laag (bijvoorbeeldhet verlies van retinale peesknoopcellen is één van de kenmerken van retinale ischemie10, 11). De therapieën blijkt zoals dwarse het netvlies doorsnijdt, waardoor het kan afzonderlijk bestuderen de capillaire pelxi binnen de respectieve retinale lagen12,13.
Het onderzoek van het netvlies therapieën netwerk worden meer traditioneel, uitgevoerd in netvlies geheel-mounts. Het netvlies is met de voorbereiding van dit weefsel, knippen en afgevlakt als een bloem-vormige structuur. De methode is een relatief snel weefsel voorbereiding techniek die de algehele het platform retinale therapieën kunt markeren en het wordt daarom vaak toegepast bij het onderzoek van neovascularization in de lymfkliertest retina. Succesvolle visualisatie van het microvasculature in geheel gemonteerde netvlies wordt ook gemeld in de ontwikkelingslanden neonatale muis en rat netvlies14,15,16,17,18, 19. deze studies openbaren een meer gedefinieerde pericytic activiteit met grotere capillair-vrije gebieden in de volwassene in vergelijking met de neonatale netvlies14.
Een andere manier van het visualiseren is het netvlies microvasculature na hypotone isolatie. Dit weefsel voorbereiding techniek resulteert in netvlies bloedvaten en haarvaten wordt bevrijd van de neuronale cellen. Dit soort tweedimensionale beeldvorming van het geïsoleerde retinale vasculaire netwerk is meestal na het netvlies trypsine spijsvertering20 uitgevoerd en gebruikt om te beoordelen van de vasculaire afwijkingen van diabetische retinopathie, met inbegrip van verlies van de pericyte en capillaire degeneratie20,21,22. De methode hypotone isolatie biedt het onderzoek van het netvlies vasculaire gen- en eiwit regelgevende reacties zoals zij heeft gedaan met de RT-PCR en westelijke bevlekkende23,24,25. Wij bieden hier een protocol voor de free float immunohistochemische kleuring van de hypotone geïsoleerde retinale therapieën als alternatief voor de spijsvertering van de trypsine te onderzoeken de microvasculaire pericytes.

<table><tbody><tr><td>Gelatine van varkenshuid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2625-500G</td><td></td></tr><tr><td>Albumine van kippeneiwit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5253-500G</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease (DNAse) I van runderpancreas</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td>Opgelost in 0,15 M NaCl</td></tr><tr><td>Runderserumalbumine (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>Normaal ezelsserum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121, lot 129348</td><td></td></tr><tr><td>Konijn anti-PDGFR&beta;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-432</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Muis anti-NG2</td><td>Abcam</td><td>ab50009</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Ezel Anti-Konijn IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-585-152</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Fluoresceïne (FITC) AffiniPure Ezel Anti-Muis IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-095-151</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Cy2 AffiniPure Ezel Anti-Konijn IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-225-152</td><td>1:100</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure Ezel Anti-Muis IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-150</td><td>1:100</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>Opgelost in DMSO</td></tr><tr><td>Anti-vervagende montagemedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Anti-vervagende montagemedium met DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II 4-well kamerslide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>154526</td><td></td></tr></tbody></table>

netvlies cryo-secties, geheel-mounts en hypotone geïsoleerde therapieën voorbereidingen voor immunohistochemische visualisatie van microvasculaire pericytes

Retinal Cryo-sections, Whole-Mounts, and Hypotonic Isolated Vasculature Preparations for Immunohistochemical Visualization of Microvascular Pericytes

Netvlies pericytes spelen een belangrijke rol in vele ziektes van het oog. Immunohistochemische kleuring technieken van retinale vaartuigen en microvasculaire staan pericytes centraal in uitgevoerd oftalmologisch onderzoek. Het is belangrijk om te kiezen van een geschikte methode voor het visualiseren van de microvasculaire pericytes. We beschrijven de retinale microvasculaire pericyte immunohistochemische kleuring in cryo-secties, geheel-mounts en hypotone geïsoleerde therapieën met antilichamen voor bloedplaatjes afkomstige groei factor receptor β (PDGFRβ) en zenuw/gliale antigeen 2 (NG2). Hierdoor kunnen we voordelen en tekortkomingen van elk van de drie weefsel voorbereidingen voor de visualisatie van de retinale microvasculaire pericytes te benadrukken. Cryo-secties bieden transsectional visualisatie van alle retinale lagen maar bevatten slechts een paar occasionele dwarse bezuinigingen van de microvasculature. Geheel-mount geeft een overzicht van de gehele netvlies therapieën, maar visualisatie van de microvasculature kan worden lastig. Hypotone isolatie biedt een methode om te visualiseren de gehele netvlies therapieën door de verwijdering van neuronale cellen, maar dit maakt het weefsel erg kwetsbaar.

De succesvolle protocollen bieden drie verschillende retinale preparaten voor het visualiseren van microvasculaire pericytes. Elk van deze methoden gebruikt de PDGFRβ en NG2 co lokalisatie van de immunoreactivity en de unieke positie van de pericytes die rondom de capillaire endotheel-foridentification doorloopt.
De neuronale lagen kunnen worden geïdentificeerd door de fluorescerende dichtheid van DAPI-gelabelde kernen en de bin...

We tonen drie verschillende weefsel voorbereiding technieken voor immunohistochemische visualisatie van rat retinale microvasculaire pericytes, dat wil zeggen, cryo-secties, geheel-mounts en hypotone isolatie van de vasculaire netwerk.

Netvlies Cryo-secties, geheel-Mounts en hypotone geïsoleerde therapieën voorbereidingen voor immunohistochemische visualisatie van microvasculaire Pericytes

Retinal pericytes play an important role in many diseases of the eye. Immunohistochemical staining techniques of retinal vessels and microvascular ...

Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van oogheelkunde, zoals pericytenproliferatie of migratie. Het belangrijkste voordeel van deze procedure is dat ze een verscheidenheid aan visualisatieopties bieden. Het aantonen van de procedures zijn Karin Dreisig en Frank W.Blixt, twee post-docs in ons laboratorium.Om het oog teucleren, gebruik je eerst een scalpel om de achterste en voorste spleten van ongeveer 0,5 centimeter in het rattenooglid te maken. Pak het oog met tangen en kantel voorzichtig naar de zijkant om het omliggende weefsel bloot te leggen. Breng het oog door het maken van bezuinigingen met dissectie schaar in het bind-en spierweefsel.Plaats het oog kort in 4% formaldehyde en fosfaatgebufferde zoutoplossing gedurende één tot twee minuten. Spoel kort in natriumbuffer voordat u een gat maakt in de hoornvliesledemat door lichte druk uit te oefenen met het puntje van een scalpel. Snijd langs de hoornvlies limbus met dissectie schaar om het hoornvlies en de lens te verwijderen met tangen.Dompel het resterende weefsel met netvlies onder in 4% formaldehyde in PBS gedurende twee tot vier uur. Cryo-bescherm het weefsel door onder te do

retinal-cryo-sections-whole-mounts-hypotonic-isolated-vasculature

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dit artikel beschrijft een methode voor het labelen van embryonale huid en thymus bloedvaten.

Een methode voor het labelen van bloedvaten in Embryonic Muizen

De neonatale muizen netvlies biedt een goed gekarakteriseerd fysiologisch model van angiogenese, die onderzoeken van de rol van de verschillende genen of medicijnen die angiogenese moduleren in een...

Hele Mount immunofluorescentiekleuring van de Neonatale Mouse Retina naar Angiogenese Onderzoek<em&gt; In vivo</em

Het hier beschreven protocol is voor structurele beoordeling van een wholemount retinale preparatie. Dit omvat beschrijvingen van weefseldissecatie, montage op een hydrofiliseerde polytetrafluorethyleen (PTFE) membraaninzet, bolusbelasting met fluorescente markeringen, en een vergelijking van fixatie met carbodiimide en paraformaldehyde voor immunohistochemische analyse van cellulaire en synaptische componenten.

Geoptimaliseerd protocol voor Retina Wholemount Voorbereiding voor Imaging en Immunohistochemistry

Dit rapport beschrijft uitgebreide methoden voor de voorbereiding van bevroren muis Retina secties voor Immunohistochemistry (IHC).  Beschreven methoden omvatten dissectie van de oculaire posterior Cup, Paraformaldehyde fixatie, inbedding in optimale snij-temperatuur (OCT) media en weefsel oriëntatie, sectioneren en immunokleuring.

Voorbereiding van de muis netvlies Cryo-profielen voor Immunohistochemistry

Dit artikel beschrijft een gevestigde en reproduceerbare lectinevlekkentest voor de gehele retinale preparaten van mount en de protocollen die nodig zijn voor de kwantitatieve meting van vasculaire parameters die vaak worden gewijzigd in proliferatieve en niet-proliferatieve retinopathieën.

Kwantificering van vasculaire parameters in whole mount retinas van muizen met niet-proliferatieve en proliferatieve retinopathieën

Dit protocol beschrijft een betrouwbare methode voor het verkrijgen van hoogwaardige cryosecties van hele konijnenogen. Het beschrijft procedures voor dissectie, fixatie, inbedding en secties van konijnenogen, die gemakkelijk kunnen worden aangepast voor gebruik in elk onderzoek waarbij immunohistochemie in grotere ogen wordt gebruikt.

Het verkrijgen van cryosecties van het hele konijnenoog van hoge kwaliteit 

De pericyten in het retinale vaatstelsel werden onderzocht door middel van immunofluorescerende kleuring met van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β na retro-orbitale injectie van fluorescerend tomatenlectine. Het gelabelde netvlies werd verder behandeld met de weefselopruimingsmethode en in zijn geheel gemonteerd voor het visualiseren van de driedimensionale beelden van pericyten rond het netvliesvaatstelsel onder een confocale microscoop.

3D-visualisatie van retinale vasculaire pericyten bij muizen door immunokleuring 

Er wordt een protocol beschreven voor het voorbereiden van retinale cryosecties van muizen en het uitvoeren van immunokleuring op fotoreceptoren. Dit artikel stelt onderzoekers in staat om consequent bevroren secties van het netvlies van muizen te produceren met goed bewaarde morfologie en hoogwaardige immunokleuringsresultaten.

Cryosectie en immunokleuring van het netvlies van de muis

Het netvlies vertoont een complexe ruimtelijke organisatie over zijn laminaire structuur. Moderne ruimtelijke transcriptomics en sequencingtechnieken vereisen weefselcoupes &lt; 20 μm dik, waardoor hun toepasbaarheid voor retinaal onderzoek wordt beperkt. Deze vers ingevroren cryosectiemethode produceert dunne delen van het netvlies van de muis met behoud van vlakke ruimtelijke relaties, waardoor uitgebreide moleculaire kartering over laminae mogelijk is.

En gezicht Cryosectie van het netvlies van de muis voor hoogdimensionale ruimtelijke moleculaire analyse

De huidige methode maakt het mogelijk reproduceerbaar cryostaat opdeling van de kleine, moeilijk te beheren, weefsel stukken, zoals biopsieën en hersenen plakjes. Wij gebruiken een eenvoudige aluminium bevriezing stadium bij het verwerken van weefsel en een standaard cryostaat om routinematig produceren 5-10 micron seriële secties van 400 micron dikke sneden hersenen te vergemakkelijken.

Dun snijden van Slice voorbereidingen voor immunohistochemie

Leer drie weefselpreparatietechnieken voor immunohistochemische visualisatie van retinale microvasculaire pericyten bij ratten: cryosecties, whole-mounts en hypotone isolatie. Deze methoden ondersteunen onderzoek naar pericytengedrag in de oogheelkunde.

Netvlies Cryo-secties, geheel-Mounts en hypotone geïsoleerde therapieën voorbereidingen voor immunohistochemische visualisatie van microvasculaire Pericytes (Video) | JoVE Journal

Netvlies Cryo-secties, geheel-Mounts en hypotone geïsoleerde therapieën voorbereidingen voor immunohistochemische visualisatie van microvasculaire Pericytes

Meer video's verkennen