Netvlies Cryo-secties, geheel-Mounts en hypotone geïsoleerde therapieën voorbereidingen voor immunohistochemische visualisatie van microvasculaire Pericytes

Deze methoden kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van oogheelkunde, zoals pericytenproliferatie of migratie. Het belangrijkste voordeel van deze procedure is dat ze een verscheidenheid aan visualisatieopties bieden. Het aantonen van de procedures zijn Karin Dreisig en Frank W.Blixt, twee post-docs in ons laboratorium.

Om het oog teucleren, gebruik je eerst een scalpel om de achterste en voorste spleten van ongeveer 0,5 centimeter in het rattenooglid te maken. Pak het oog met tangen en kantel voorzichtig naar de zijkant om het omliggende weefsel bloot te leggen. Breng het oog door het maken van bezuinigingen met dissectie schaar in het bind-en spierweefsel.

Plaats het oog kort in 4% formaldehyde en fosfaatgebufferde zoutoplossing gedurende één tot twee minuten. Spoel kort in natriumbuffer voordat u een gat maakt in de hoornvliesledemat door lichte druk uit te oefenen met het puntje van een scalpel. Snijd langs de hoornvlies limbus met dissectie schaar om het hoornvlies en de lens te verwijderen met tangen.

Dompel het resterende weefsel met netvlies onder in 4% formaldehyde in PBS gedurende twee tot vier uur. Cryo-bescherm het weefsel door onder te dompelen in sorenson's fosfaatbuffer met 10% sacharose en vervolgens 25%sucrose. Breng het weefsel zodra het is gezonken naar de bodem van de container.

Insluiten in Yazulla medium bereid met 3% gelatine uit varkenshuid en 30% albumine van kippeneiwit. Snijd vervolgens 10-micron verticale cryosections van het gelatine-ingebedde netvlies door naar de oogzenuw. Plaats de cryosections op een glazen schuif en laat minimaal een uur drogen.

Eenmaal droog, dompel de dia in PBS met 0,25%Triton-X 100 gedurende 15 minuten. Druppel vervolgens een mengsel van 1:100 PDGF receptor bèta en 1:500 NG2 primaire antilichamen in PBST en 1% BSA op de cryosection en plaats in een vochtige kamer op vier graden Celsius 's nachts. De volgende dag, was de secties door het onderdompelen van de dia in PBST twee keer gedurende 15 minuten elke keer.

Druppel vervolgens een mengsel van 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594-gekoppeld en 1:100 Anti-Rabbit FITC-gekoppelde secundaire antilichamen verdund in PBST met 3%BSA op de cryosections en incubate gedurende een uur in het donker. Na de incubatie spoelt u de glazen schuif in PBST telkens gedurende 15 minuten af. Monteer de gekleurde cryosections met anti-fading montage medium met DAPI en een coverslip.

Een tweede retinale weefsel preparele techniek is hele-mount. Na de verwijdering van het hoornvlies, gebruik kleine openingsbewegingen van tangen om het netvlies te scheiden van het netvlies pigment epitheel naar de oogzenuw. Bevrijd het netvlies bij de oogzenuw met dissectieschaar en maak drie tot vier spleten van een paar millimeter lengte van de netvliesperiferie naar het oogzenuwhoofd.

Verdeel het netvlies op een glazen glijbaan en laat vijf tot tien minuten drogen. Druppel 4% formaldehyde op het netvlies en fix voor 20 tot 30 minuten. Na fixatie, spoelen met PBS.

Voor optimale resultaten, immunostain direct na het spoelen. Druppel eerst PBST op de hele berg en incubbate bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Giet de PBST af, voeg vervolgens de primaire antilichaamoplossing toe en broed in een vochtige kamer bij vier graden Celsius 's nachts.

De volgende dag giet u het primaire antilichaam af en druppel op PBST om het netvlies twee keer gedurende 15 minuten per keer te spoelen. Na het gieten van de tweede was, druppel secundaire antilichaam oplossing op het netvlies en incubeer gedurende een uur in een vochtige kamer bij kamertemperatuur in het donker. Na de secundaire antilichaam incubatie, was twee keer met PBST als voorheen.

Monteer de gekleurde hele-mount met anti-fading montage medium met DAPI en een cover slip. Alternatief voor het geheel monteren van het netvlies, het netvlies vasculatuur kan worden geïsoleerd door hypotonische isolatie. Plaats eerst het netvlies in een milliliter gedeïmiseerd water in een 24-put plaat en schud bij 200 rpm met een 1,5-millimeter trillingsbaan gedurende een uur bij kamertemperatuur, voeg vervolgens 200 eenheden DNAse 1 toe om het lysed celpuin van het netvliesvaatculatuur te scheiden en nog eens 30 minuten bij kamertemperatuur te schudden.

Spoel het netvlies in gedeïoniseerd water gedurende drie keer gedurende vijf minuten elk met schudden op 150 tot 300 rpm om neuronale celpuin te verwijderen. Het netvlies moet transparanter worden met elke spoeling, indicatief voor het verwijderen van neuronale cellulaire puin. Na het spoelen, bevestig het netvlies in een milliliter van 4%paraformaldehyde en PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.

Spoel met PBS drie keer. Als u overgaat tot immunostaining, blokkeer dan de hypotonisch geïsoleerde vasculatuur met 500 microliter van 10% ezelserum dat in PBS gedurende een uur wordt verdund met schudden bij 100 tpm. Na het blokkeren, incubeer het netvlies 's nachts in 600 microliters van primaire antilichaam oplossing bestaande uit 1:100 PDGF-receptor beta en 1:500 NG2 primaire antilichamen verdund in 10% ezel serum en PBS.

De volgende dag, spoel het netvlies netwerk drie keer in PBS gedurende vijf minuten elke keer, dan incubeer in 1:100 Anti-Mouse Alexa Fluor 594th-linked en 1:100 Anti-Rabbit FITC-gekoppelde secundaire antilichamen, verdund in 10% ezel serum en PBS met schudden bij 100 rpm bij kamertemperatuur gedurende een uur in het donker. Na een wasbeurt van vijf minuten in PBST, 15 minuten lang incubeer in 0,2 nanogram per milliliter DAPI en PBST. Was drie keer gedurende vijf minuten met PBST terwijl beschermd tegen licht.

Snijd vervolgens het puntje van een plastic Pasteur pipet. Verwijder scherpe randen met behulp van een pipet tip, en bevochtig de Pasteur pipet met PBST, dan aspirate het netvlies vasculatuur in de pipet en afzien van een vier-goed glazen kamer schuif. De bevochtigingsstap is belangrijk om te voorkomen dat de retinale vasculatuur aan de binnenkant van de Pasteur pipet blijft plakken.

Plaats de retinale vasculatuur door de kamer heen en weer te kantelen. Verwijder het medium uit de putten van de kamerglijbaan. De oppervlaktespanning van de vloeistof zal de vasculatuur op de bodem van de dia platmaken.

Indien nodig druppeldruppels vloeistof op het netvlies vasculatuur te ontvouwen. Zorg voor een correcte ontvouwen onder een microscoop voor het verwijderen van de plastic putten uit de kamer dia. Monteer de gekleurde vasculatuur met anti-vervagen montage medium en een cover slip.

NG2 immunohistochemie onthult positieve vaten in het binnenste deel van het netvlies. Pijlen wijzen op cirkelvormige en hoefijzervormige immunoreactiviteit in de vaten. De pijlpunt wijst op een langsgesneden vat.

PDGF-receptor bèta-immunohistochemie vertoont vergelijkbare immunoreactiviteit als NG2. Opnieuw wijzen de pijlen en pijlpunt op immunoreactiviteit in de vaten. Dit beeld toont een samensmelten van NG2 in groen, PDGF-receptor bèta in rood, en DAPI in blauw.

Door de drie verschillende filters te over elkaar te plaatsen, wordt onthuld dat NG2 en PDGF-receptor bèta co-gelokaliseerd zijn. Dit beeld toont een immunostained gehele-bergvoorbereiding met NG2 het kleuren in rood. Immunoreactiviteit is zichtbaar langs het oppervlakkige vasculaire netwerk met intense kleuring in abluminale pericyten.

De neuronale cellen zijn zichtbaar als DAPI blauwe kernen tussen de NG2-gekleurde microvasculatuur. Dit beeld toont de hypotonische geïsoleerde rat retinale vasculaire netwerk gekleurd met NG2 in het groen en PDGF-receptor beta in het rood. Het volledige netwerk toonde NG2-immunoreactiviteit.

PDGF-receptor bèta-immunoreactiviteit werd gevonden in cel soma's. Bij een hogere vergroting is het duidelijk dat PDGF-receptor bètakleuring alleen wordt gezien in celsorma's in het vasculaire netwerk, wat duidt op pericyte immunoreactiviteit. Inclusief DAPI kleuring samen met NG2 en PDGF-receptor beta onthult drie pericyten in twee ongedefinieerde vaatwandcellen in dit hoge vergroting beeld.

Na deze procedures kunnen andere immunostainings zoals gladde spiercel of endotheelvlekken worden gebruikt om aanvullende vragen te beantwoorden. Bijvoorbeeld, hoe cellen in het netvlies vasculatuur kijken volgende ischemie?