Evaluatie van de rol van mitochondriale functie in moeheid in verband met kanker

Het algemene doel van deze procedure is om mitochondriale disfunctie geassocieerd met vermoeidheid bij kankerpatiënten te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ondersteunende kankerzorg, zoals of mitochondriale disfunctie geassocieerd is met vermoeidheid bij kankerpatiënten na bestralingstherapie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het minder invasief is en gemakkelijk in de kliniek kan worden gebruikt om patiënten met een risico op toxiciteit door kankertherapie te identificeren.

Deze techniek breidt niet alleen ons begrip van de rol van mitochondriale disfunctie bij vermoeidheid gerelateerd aan kanker uit, maar kan ook de beoordeling verbeteren en het beheer optimaliseren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de onderliggende mechanismen van vermoeidheid gerelateerd aan kanker, kan deze ook worden toegepast op andere vermoeidheidsgerelateerde aandoeningen, zoals metabole en urine-ontstekingsaandoeningen. Over het algemeen kan het voor personen die nieuw zijn met deze methode een uitdaging zijn om respiratoire remmers goed in elke poort van de sensorcartridge te injecteren zonder voorafgaande visuele demonstratie.

Deze procedure zal worden gedemonstreerd door de heer Quang Nguyen, een postbac-fellow van ons laboratorium. Om de sensorcartridge te hydrateren, verwijdert u deze eerst uit de verpakking. Voeg vervolgens 200 microliter kalibratieoplossing toe aan elk putje van de hulpplaat.

Vul ook elke gracht met 400 microliter kalibratieoplossing. Plaats vervolgens de sensorplaat terug op de hulpplaat en begin met het hydrateren van de cartridge in een koolzuurvrije incubator bij 37 graden Celsius overnacht. Meet het niveau van vermoeidheid op basis van de 13-item functionele beoordeling van therapie voor chronische ziekten.

Vermoeidheid bij baseline, halverwege, bij voltooiing van EBRT en een jaar na EBRT. Bereid eerst het assaymedium voor de meting van mitochondriale functie voor. Na het bereiden van het medium, verwarm het tot 37 graden Celsius en pas de pH aan tot 7,4.

Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat het assaymedium wordt bereid op de dag van het experiment en wordt opgewarmd tot 37 graden voordat de PH wordt aangepast tot 7,4. Zaai vervolgens de PBMC's in elk putje om 80 tot 90 procent confluency te bereiken. Draai vervolgens de plaat 200 keer g gedurende 2 minuten zodat de cellen zich aan de bodem van de putjes hechten.

Na het draaien verwijdert u het medium uit elk putje en spoelt u de putjes eenmaal met assaymedium. Voeg 180 microliter assaymedium toe aan elk putje, inclusief de achtergrondputjes. Vervolgens incubeert u de plaat 45 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius in een koolzuurvrije incubator.

Om de geneesmiddelen te reconstrueren, voegt u 252 microliter assaymedium toe aan het geneesmiddel om een 50 micromolar stockoplossing van oligomycine te genereren. Voeg 288 microliter assaymedium toe aan het geneesmiddel om een 50 micromolar stockoplossing van FCCP te genereren. Voeg tenslotte 216 microliter assaymedium toe om een 25 micromolar stockoplossing van antimycine a/rotenon te genereren.

Na het reconstrueren van alle drie de geneesmiddelen, vermengt u de geneesmiddelensuspensie gedurende één minuut en verdunt u vervolgens de werkoplossingen. Pipetteer vervolgens 20 microliter van 10 micromolar oligomycine in poort A tot een eindconcentratie van één micromolar in elk putje. Pipetteer vervolgens 22 microliter van 10 micromolar FCCP in poort B tot een eindconcentratie van één micromolar in elk putje.

Pipetteer tenslotte 25 microliter van 5 micromolar antimycine a/rotenon in poort C tot een eindconcentratie van 0,5 micromolar in elk putje. Selecteer vervolgens de Mito Stress Test op het extracellulaire fluxinstrument. Voer vervolgens de sensorcartridge in volgens de prompt van het instrument.

Het instrument voert automatisch sensorkalibratie uit. Zodra de kalibratie is voltooid, plaatst u de cellenplaat voor het instrument om de rest van het assay te voltooien. Om de oplossing voor de celproliferatie-assay voor te bereiden, voegt u 5,76 microliter nucleïnezuurkleuring en 28,8 microliter achtergrondonderdrukker toe aan 1,405 milliliter fosfaatgebufferde zoutoplossing.

Na de Mito Stress Test voegt u 180 microliter 2x werkoplossing direct in het medium in elk putje toe. Incubeer vervolgens de cellen met de celproliferatie-assay-oplossing gedurende 45 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius. Kwantificeer het aantal levende cellen op een platereader bij 508 nanometer excitatie en 527 nanometer emissie, gevolgd door het normaliseren van de OCR-gegevens.

Bij het uitvoeren van FCCP-titratie is één micromolar de optimale geneesmiddelconcentratie die wordt gebruikt om de mitochondriale functie van PBMC's te beoordelen. Onderzoek naar mitochondriale ademhaling en vers geïsoleerde PBMC's toont aan dat OCR begint af te nemen na drie uur en dit tot acht uur voortduurt. De maximale ademhaling veroorzaakt door FCCP-injectie overschrijdt echter ook niet het basale OCR-niveau.

Hier wordt normalisatie van de mitochondriale functie getoond waarbij de cellen zijn geïsoleerd van twee gezonde individuen. In feite is de OCR, genormaliseerd op levende cellen, weergegeven door de groene fluorescentie DNA-bindende kleurstof, vergelijkbaar bij beide gezonde individuen. Er is in feite geen significant verschil in de basale OCR waargenomen tussen een gezond en een vermoeide proefpersoon.

De vermoeide proefpersoon vertoont echter een verminderde maximale zuurstofopname en spaarbare ademhalingscapaciteit in vergelijking met de controle. Er worden geen verschillen gevonden in niet-mitochondriale en ATP-gerelateerde zuurstofopname of koppelingsefficiëntie tussen de gezonde en de vermoeide proefpersonen. Eenmaal beheerst, kan deze techniek in vier uur worden voltooid als deze correct wordt uitgevoerd.

Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om eerst de optimale celdichtheid en FCCP-concentraties te bepalen. Na deze procedure kunnen andere methoden, zoals het isoleren van verschillende celpopulaties, worden uitgevoerd om toekomstige