Name: Evaluatie van de rol van mitochondriale functie in moeheid in verband met kanker (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Leer hoe u mitochondriale dysfunctie evalueert bij kankergerelateerde vermoeidheid met behulp van standaard flebotomie en laboratoriumprocedures. Deze methode helpt patiënten te identificeren die risico lopen op toxiciteit van kankertherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie is volledig ondersteund door de divisie van intramurale onderzoek van het National Institute of Nursing Research van de NIH, Bethesda, Maryland.

De huidige studie (NCT00852111) werd goedgekeurd door de institutionele Review Board (IRB) van de National Institutes of Health (NIH), Bethesda, Maryland. Deelnemers ingeschreven in deze studie werden euthymic mannen, 18 jaar of ouder, die niet-gemetastaseerd prostaatkanker met of zonder voorafgaande prostatectomie werden gediagnosticeerd en waren gepland om te ontvangen van de lichtbundel van de externe radiotherapie (EBRT). Potentiële deelnemers waren uitgesloten indien zij had een progressieve ziekte die leiden grote vermoeidheid tot kan, psychiatrische ziekte binnen de afgelopen vijf jaar had, had ongecorrigeerd hypothyreoïdie of bloedarmoede, of had een tweede maligniteit. Personen die sedativa, steroïden of niet-steroïdale anti-inflammatoire agenten gebruikte werden ook uitgesloten. Gezonde controle werden bloedmonsters bij de NIH departement van transfusiegeneeskunde van gezonde donoren onder een IRB-goedgekeurde protocol (NCT00001846). Alle deelnemers worden gerekruteerd bij de Magnuson Clinical Research Center op de NIH. Ondertekende schriftelijke geïnformeerde toestemming zijn verkregen vóór deelname van de studie.
1. de mitochondriale functie meting voorbereiding (dag 1 van het Experiment)
<ol><li>Hydrate Sensor Cartridge (Zie Tabel of Materials; geschatte duur: 5 minuten).<ol>
<li>Sensor Cartridge uit pakket verwijderen. Voeg 200 μl kalibrant oplossing in elk putje van de plaat hulpprogramma, vul dan elke gracht met 400 μL kalibrant oplossing.</li>
		<li>Sensor plaat terug naar de utility-plaat, die inmiddels kalibrant oplossing erin. Hydrateer de Cartridge in een niet-CO2 -37 ° C incubator's nachts. Opmerking: Sensor Cartridge moet worden gehydrateerd voor een minimum van 4 uur en een maximum van 72 uur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. klinische monstervoorbereiding (dag 2 van het Experiment)
<ol><li>Meten van vermoeidheid met behulp van de 13-item functionele beoordeling van chronische ziekte therapie - vermoeidheid (FACIT-F)2,23,24 op basislijn (vóór EBRT initiatie), middelpunt en voltooiing van EBRT, en de 1-jarige post-EBRT.<ol>
<li>Gebruik een 0 - 4 schaal voor elk item antwoord, waar een 0 geeft aan dat "helemaal niet" en een 4 geeft aan dat de verweerder heeft betrekking op de overeenkomstige instructie "heel erg." Totaalscores moeten variëren van 16-53, met lagere scores als gevolg van hoge vermoeidheid intensiteit.</li>
		<li>Vermoeidheid als een FACIT-F-score lager dan 43, met een score van de FACIT-F van ≥43 aangeeft, ontbreken van of niet klinisch-zinvol vermoeidheid2definiëren. Opmerking: Een score FACIT-F van 43 beste verdeelt vermoeidheid scores van kankerpatiënten en de algemene bevolking2.</li>
		<li>De volgende 13 items worden opgenomen in de FACIT vermoeidheid schaal: 1) ik voel me vermoeid; 2) Ik voel me zwak helemaal; 3) Ik voel me lusteloos ("gewassen"); 4) Ik voel me moe; 5) ik problemen ondervindt bij het starten van dingen, want ik moe ben; 6) ik problemen ondervindt bij het afwerken van dingen, want ik moe ben; 7) Ik heb energie; 8) Ik ben in staat om te doen van mijn gebruikelijke activiteit; 9) Ik nodig om te slapen tijdens de dag; 10) Ik ben te moe om te eten; 11) behoeftehulp van I doen van mijn gebruikelijke activiteiten; 12) Ik ben gefrustreerd door het wordt te moe om te doen de dingen die ik wil doen; en 13) ik moet mijn sociale activiteit te beperken omdat ik moe ben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBMC isoleren van vers verzameld bloedmonsters (geschatte duur: 1 uur).<ol>
<li>Verzamelen van 8 mL bloed in een mononucleaire cellen Preparation Tube (Zie Tabel van materialen). Opmerking: Bloedmonsters moeten worden verwerkt binnen 2 uur van collectie. De kwaliteit van PBMCs kan worden aangetast als bloedmonsters meer dan 2 uur na sample collectie verwerkt worden.</li>
		<li>Centrifugeer bij 1.750 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (18-25 ° C). De bewolkte laag overbrengen in een conische tube van 15 mL. Voeg maximaal 15 mL PBS en 5 keer omkeren.</li>
		<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 15 minuten bij 4 ° C. Verwijder voorzichtig en verwijder het supernatant zonder storende pellet. Resuspendeer de pellet door tot 10 mL PBS toe te voegen, en 5 keer omkeren.</li>
		<li>Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Negeren van vloeibare supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL PBS. De PBMCs overbrengen in een 1,5 mL microfuge buis.</li>
		<li>Centrifugeer bij 610 x g gedurende 10 minuten. Zorgvuldig verwijderen van supernatant en resuspendeer de pellet in volledige RPMI-1640 (RPMI-1640 aangevuld met 10% FBS, 10 mM penicilline/streptomycine).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Jas van cel platen voor niet-aanhanger cellen (geschatte duur: 30 min).<ol>
<li>Bereiden van cel- en weefseltransplantaties zelfklevende oplossing (Zie Tabel van materialen) door verdunning van de stockoplossing in 0,1 M natriumbicarbonaat pH 8,0. De werkoplossing dient bij 3.5 μg/cm2 van oppervlakte. Opmerking: Deze oplossing bevat polyphenolic eiwitten de mariene Mossel, Mytilus edulisis onttrokken. Deze eiwitten zijn belangrijke onderdelen van de lijm uitgescheiden door de Mossel om zelf op oppervlakken te verankeren. Wij vinden dat cel-Tak het beste met PBMCs werkt.</li>
		<li>Voeg 100 μl van de verdunde lijm oplossing aan elk putje en incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur. Spoel driemaal met DI water en lucht droog.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. mitochondriale functie meting
<ol><li>Voorbereiding van Assay Media (geschatte duur: 10 min). Opmerking: Assay media moet vers worden bereid op de dag van het experiment.<ol>
<li>L-glutamine, pyruvaat en glucose naar de basis van de media (de dezelfde bestanddelen als de Dulbecco bewerkt Eagle's Medium (DMEM), maar zonder natrium-bicarbonaat, glucose, glutamine, of natrium pyruvaat) zodat assay media toevoegen. Media opwarmen tot 37 ° C, pH aan 7.4 vervolgens aanpassen. Opmerking: Concentraties van L-glutamine, glucose en pyruvaat zijn meestal hetzelfde als concentraties in normale groeiomstandigheden en media, maar kunnen worden aangepast op basis van de bepaling.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBMCs voorbereiden op de Mito Stress-test (geschatte duur: 2 h).<ol>
<li>Plaat genoeg PBMCs uit stap 2 in elk putje 80-90% confluentie bereiken. In onze ervaring, 1.5 x 105 cellen/well de meest consistente resultaten opgeleverd. Opmerking: Wells A en H zijn achtergrond putten en mag alleen assay media met geen cellen bevatten. In putten B tot en met G, is het raadzaam minimaal 3-6 wells per patiënt monster plating om rekening voor uitschieters.</li>
		<li>Spin platen neer bij 200 x g gedurende 2 min aan cellen vast te houden aan de onderkant van de putten toestaan. Wassen van de cellen een keer met Assay media. Deze stap verwijdert serum en natriumbicarbonaat uit de media groei. Opmerking: In onze ervaring, het wassen stap meestal verwijdert 20-30% van de cellen.</li>
		<li>180 μL Assay media toevoegen aan elk putje, met inbegrip van achtergrond wells A en H. Incubate in een niet-CO2 -37 ° C incubator voor 45-60 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De Mito stresstest uitvoeren<ol>
<li>Reconstrueren drugs in de Mito Stress Kit met assay media als volgt:<ol>
<li>Oligomycin: Voeg 252 μL assay media in de flacon voor het genereren van een stamoplossing bij 50 μM.</li>
			<li>FCCP: Voeg 288 μL van assay media in de flacon voor het genereren van een stamoplossing bij 50 μM.</li>
			<li>Antimycin A / rotenon: 216 toevoegen μL van assay media in de flacon voor het genereren van een stamoplossing op 25 μM.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Vortex gereconstitueerd drugs voor ongeveer 1 minuut. Verdun in werkende oplossingen. Opmerking: Concentraties van de werkoplossing moeten worden getitreerd en vooraf bepaalde voorafgaand aan het experiment afhankelijk van het celtype. Voor PBMCs, vinden we dat 1 μM van Oligomycin, 1 μM FCCP en 0,5 μM antimycin A / rotenon werken het beste.</li>
		<li>Pipetteer de drugs in elke haven in de sensor patroon opeenvolgend:<ol>
<li>Haven A: Pipetteer 20 μL van 10 μM Oligomycin, voor een uiteindelijke concentratie in elk putje van 1 μM.</li>
			<li>Poort B: Pipetteer 22 μL van 10 μM FCCP, voor een uiteindelijke concentratie in elk putje van 1 μM.</li>
			<li>Haven C: Pipetteer 25 μL van 5 μM antimycin A / rotenon voor een uiteindelijke concentratie in elk putje van 0,5 μM.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecteer "Mito Stress Test" op een instrument dat extracellulaire flux. Volg instrument prompt en plaats de sensor cartridge. Het instrument zal automatisch sensor kalibratie uit te voeren. Voeg cel plaat nadat sensor kalibratie, en het instrument zal de rest van de bepaling. Dynamiek van de zuurstof wordt gemeten op 530 nm (excitatie) / 650nm (emissie), en proton-concentratie wordt gemeten op 470 nm (excitatie) / 530 nm (emissie).</li>
</ol>4. normalisatie van mitochondriale functie gegevens
<ol><li>Bereid cel proliferatie Assay-oplossing (geschatte duur: 5 minuten).<ol>
<li>48 μl nucleïnezuur vlek (500 x) en 240 μL achtergrond suppressor toevoegen aan 11,7 mL PBS (2 x). De vlek nucleïnezuur is een cel-permeant DNA-bindende kleurstof en de achtergrond suppressor is een maskeren kleurstof die dode cellen of cellen met gekraakte celmembraan integriteit van gekleurd wordt geblokkeerd. De combinatie van de DNA-bindende kleurstof en de achtergrond suppressor zorgt ervoor dat alleen levende cellen zijn gekleurd.</li>
		<li>Voeg gelijk volume 2 x werkoplossing (180 μL) direct in het medium in elk putje nadat de Mito Stress-Test is voltooid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubeer de cellen in het bijzijn van cel proliferatie assay oplossing in een 37 ° C incubator voor 45-60 min. Quantify het aantal levende cellen (TL) op een afleesapparaat op 508 nm (excitatie) / 527 nm (emissie) en normaliseren van OCR-gegevens (geschatte duur: 10 min) . Opmerking: naast het aantal levende cellen, gebruikers kunnen ook kiezen om te normaliseren hun gegevens met het totale aantal cellen, het bedrag van nucleic zuur, eiwit-concentratie, enz.</li>
</ol>

<ol><li>Berger, A. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26285247">Cancer-Related Fatigue, Version 2.2015.</a> Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 13 (8), 1012-1039 (2015).</li>
<li>Feng, L. R., Dickinson, K., Kline, N., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27521284">Different phenotyping approaches lead to dissimilar biologic profiles in men with chronic fatigue following radiation therapy.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 52 (6), 832-840 (2016).</li>
<li>Feng, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+Predictors+of+Fatigue+in+Men+With+Non-Metastatic+Prostate+Cancer+Receiving+External+Beam+Radiation+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Journal+of+Oncology+Nursing%22%5BJournal%5D)">Clinical Predictors of Fatigue in Men With Non-Metastatic Prostate Cancer Receiving External Beam Radiation Therapy.</a> Clinical Journal of Oncology Nursing. 19 (6), 744-750 (2015).</li>
<li>Feng, L. R., Wolff, B. S., Lukkahatai, N., Espina, A., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploratory+Investigation+of+Early+Biomarkers+for+Chronic+Fatigue+in+Prostate+Cancer+Patients+Following+Radiation+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Nursing%22%5BJournal%5D)">Exploratory Investigation of Early Biomarkers for Chronic Fatigue in Prostate Cancer Patients Following Radiation Therapy.</a> Cancer Nursing. 40 (3), 184-193 (2017).</li>
<li>Myhill, S., Booth, N. E., McLaren-Howard, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19436827">Chronic fatigue syndrome and mitochondrial dysfunction.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 2 (1), 1-16 (2009).</li>
<li>Pernas, L., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mito-Morphosis%3A+Mitochondrial+Fusion%2C+Fission%2C+and+Cristae+Remodeling+as+Key+Mediators+of+Cellular+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mito-Morphosis: Mitochondrial Fusion, Fission, and Cristae Remodeling as Key Mediators of Cellular Function.</a> Annual Review of Physiology. 78 (1), 505-531 (2016).</li>
<li>Vecchiet, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+characterization+of+somatic+parietal+tissues+in+humans+with+chronic+fatigue+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Letters%22%5BJournal%5D)">Sensory characterization of somatic parietal tissues in humans with chronic fatigue syndrome.</a> Neuroscience Letters. 208 (2), 117-120 (1996).</li>
<li>Jones, D. E. J., Hollingsworth, K. G., Taylor, R., Blamire, A. M., Newton, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormalities+in+pH+handling+by+peripheral+muscle+and+potential+regulation+by+the+autonomic+nervous+system+in+chronic+fatigue+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Abnormalities in pH handling by peripheral muscle and potential regulation by the autonomic nervous system in chronic fatigue syndrome.</a> Journal of Internal Medicine. 267 (4), 394-401 (2010).</li>
<li>Feng, L. R., Suy, S., Collins, S. P., Saligan, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+TRAIL+in+fatigue+induced+by+repeated+stress+from+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Psychiatric+Research%22%5BJournal%5D)">The role of TRAIL in fatigue induced by repeated stress from radiotherapy.</a> Journal of Psychiatric Research. 91, 130-138 (2017).</li>
<li>Karamercan, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+peripheral+blood+mononuclear+cells+be+used+as+a+proxy+for+mitochondrial+dysfunction+in+vital+organs+during+hemorrhagic+shock+and+resuscitation%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Can peripheral blood mononuclear cells be used as a proxy for mitochondrial dysfunction in vital organs during hemorrhagic shock and resuscitation.</a> Shock. 40 (6), (2013).</li>
<li>Ijsselmuiden, A. J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+white+blood+cells+and+platelets+amplify+oxidative+stress+in+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Clinical+Practice+Cardiovascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating white blood cells and platelets amplify oxidative stress in heart failure.</a> Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 5, 811(2008).</li>
<li>Kong, C. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+mitochondrial+alterations+after+cardiac+surgery+involving+cardiopulmonary+bypass%3A+Clinical+correlations%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">Leukocyte mitochondrial alterations after cardiac surgery involving cardiopulmonary bypass: Clinical correlations.</a> Shock. 21 (4), 315-319 (2004).</li>
<li>Straub, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+and+immune+system+prompt+energy+shortage+in+chronic+inflammation+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Rheumatology%22%5BJournal%5D)">The brain and immune system prompt energy shortage in chronic inflammation and ageing.</a> Nature Reviews Rheumatology. 13, 743(2017).</li>
<li>Kuhnke, A., Burmester, G., Krauss, S., Buttgereit, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetics+of+immune+cells+to+assess+rheumatic+disease+activity+and+efficacy+of+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+Rheumatic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Bioenergetics of immune cells to assess rheumatic disease activity and efficacy of glucocorticoid treatment.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 62 (2), 133-139 (2003).</li>
<li>Kramer, P. A., Ravi, S., Chacko, B., Johnson, M. S., Darley-Usmar, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+mitochondrial+and+glycolytic+metabolism+in+human+platelets+and+leukocytes%3A+Implications+for+their+use+as+bioenergetic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">A review of the mitochondrial and glycolytic metabolism in human platelets and leukocytes: Implications for their use as bioenergetic biomarkers.</a> Redox Biology. 2, Supplement C 206-210 (2014).</li>
<li>Garrabou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Sepsis+on+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">The Effects of Sepsis on Mitochondria.</a> The Journal of Infectious Diseases. 205 (3), 392-400 (2012).</li>
<li>Mittal, M., Siddiqui, M. R., Tran, K., Reddy, S. P., Malik, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+in+inflammation+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species in inflammation and tissue injury.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 20 (7), 1126-1167 (2014).</li>
<li>Adrie, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Membrane+Potential+and+Apoptosis+Peripheral+Blood+Monocytes+in+Severe+Human+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Membrane Potential and Apoptosis Peripheral Blood Monocytes in Severe Human Sepsis.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 164 (3), 389-395 (2001).</li>
<li>Traba, J., Miozzo, P., Akkaya, B., Pierce, S. K., Akkaya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+protocol+to+analyze+glycolysis+and+mitochondrial+respiration+in+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An optimized protocol to analyze glycolysis and mitochondrial respiration in lymphocytes.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54918(2016).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2511(2010).</li>
<li>Van den Bossche, J., Baardman, J., de Winther, M. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+characterization+of+polarized+M1+and+M2+bone+marrow-derived+macrophages+using+real-time+extracellular+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Metabolic characterization of polarized M1 and M2 bone marrow-derived macrophages using real-time extracellular flux analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53424(2015).</li>
<li>Boutagy, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+isolated+mitochondria+from+minimal+quantities+of+mouse+skeletal+muscle+for+high+throughput+microplate+respiratory+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using isolated mitochondria from minimal quantities of mouse skeletal muscle for high throughput microplate respiratory measurements.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53216(2015).</li>
<li>Yellen, S. B., Cella, D. F., Webster, K., Blendowski, C., Kaplan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+fatigue+and+other+anemia-related+symptoms+with+the+Functional+Assessment+of+Cancer+Therapy+%28FACT%29+measurement+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain+and+Symptom+Management%22%5BJournal%5D)">Measuring fatigue and other anemia-related symptoms with the Functional Assessment of Cancer Therapy (FACT) measurement system.</a> Journal of Pain and Symptom Management. 13 (2), 63-74 (1997).</li>
<li>Yost, K. J., Eton, D. T., Garcia, S. F., Cella, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+important+differences+were+estimated+for+six+Patient-Reported+Outcomes+Measurement+Information+System-Cancer+scales+in+advanced-stage+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Epidemiology%22%5BJournal%5D)">Minimally important differences were estimated for six Patient-Reported Outcomes Measurement Information System-Cancer scales in advanced-stage cancer patients.</a> Journal of Clinical Epidemiology. 64 (5), 507-516 (2011).</li>
<li>Kang, J. -G., Wang, P. -y, Hwang, P. M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/journal/00766879/542">Methods in Enzymology</a>. Galluzzi, L., Kroemer, G. 542, Academic Press. 209-221 (2014).</li>
<li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets%2C+lymphocytes%2C+monocytes%2C+and+neutrophils%2C+and+the+oxidative+burst+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Laboratory Investigation. 93 (6), 690-700 (2013).</li>
<li>Jones, L. J., Gray, M., Yue, S. T., Haugland, R. P., Singer, V. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11406155">Sensitive determination of cell number using the CyQUANT® cell proliferation assay.</a> Journal of Immunological Methods. 254 (1), 85-98 (2001).</li>
<li>Hartman, M. -L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+mitochondrial+oxygen+consumption+in+peripheral+blood+mononuclear+cells+to+vascular+function+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Vascular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Relation of mitochondrial oxygen consumption in peripheral blood mononuclear cells to vascular function in type 2 diabetes mellitus.</a> Vascular Medicine. 19 (1), London, England. 67-74 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Vermoeidheid bij kankerpatiënten is een invaliderende aandoening die is niet goed gedefinieerd of1gekenmerkt. Diagnose van vermoeidheid is volledig gebaseerd op subjectieve rapportage en er is geen huidige diagnostische standaard of behandeling voor deze aandoening, grotendeels te wijten aan een gebrek aan inzicht in de pathobiology2. Van de voorgestelde mechanismen ten grondslag liggen aan de vermoeidheid bij kankerpatiënten, is bijzondere waardeverminderingen in mitochond...

Vermoeidheid is een overwegend en pijnlijke aandoening die een negatief effect op de kwaliteit van leven van kanker patiënten1 heeft. Tot op heden, kanker vermoeidheid blijft slecht gedefinieerde en vertrouwt alleen op subjectieve rapportage door patiënten2. Daarom is er dringend behoefte aan een eenvoudig aan te passen diagnostisch laboratoriumtest objectief karakteriseren vermoeidheid in de klinische setting3,4te identificeren.
Meerdere onderliggende mechanismen, met inbegrip van de mitochondriën dysfunctie, hebben voorstellen gedaan tot vermoeidheid5. Mitochondriën zijn de krachtpatser organellen, met 95% van cellulaire energiebehoefte via oxidatieve fosforylatie, en een belangrijke rol spelen bij calcium signalering, apoptosis, immuun signalering en regulering van de andere intracellulaire signalering gebeurtenissen6 . Dienovereenkomstig, verminderde mitochondriale Bioenergetica en gebreken in de energieproductie kunnen bijdragen aan vermoeidheid. Ter ondersteuning van deze hypothese, hebben vorige studies waargenomen mutaties in het mitochondriaal DNA bij patiënten met chronische vermoeidheid syndroom7. Terwijl het blijft onduidelijk of de pathofysiologische oorsprong van vermoeidheid ligt binnen het centrale zenuwstelsel of perifere weefsels, zoals skeletspieren8,9, is er momenteel geen directe methode om nauwkeurig beoordelen mitochondriale dysfunctie gerelateerde tot vermoeidheid in live, respiring cellen.
Met behulp van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs) te bestuderen van mitochondriale functie biedt een aantal voordelen. Eerst PBMCs zijn beschikbaar in de klinische setting met behulp van standaard phlebotomy en kunnen worden geïsoleerd snel met behulp van eenvoudige laboratoriumtechnieken. Ten tweede, is de bloedinzameling minder invasief dan het verzamelen van andere weefsels zoals een biopsie van spier. Zo kunnen bloedmonsters worden verzameld uit de dezelfde patiënt herhaaldelijk na verloop van tijd, dat longitudinale beoordeling van de effecten van de behandeling vergemakkelijkt. Interessant, leek mitochondriale functie in PBMCs te worden goed gecorreleerd met nier mitochondriale status in een diermodel10. Bovendien hebben immuun cel mitochondriën is gebruikt als een proxy voor het opsporen van systemische veranderingen onder andere ziekte voorwaarden11,12. Mitochondriën in circulerende immune cellen zijn vooral gevoelig voor veranderingen in immuun functies en immuun signalering van moleculen zoals cytokines13,14,15. Men heeft bijvoorbeeld opgemerkt dat PBMCs van patiënten met acute reumatische inflammatoire ziekten hoge basislijn zuurstof verbruik14 vertonen. Daarentegen was zuurstofverbruik in PBMCs geïsoleerd van patiënten met systemische inflammatoire voorwaarden waaronder sepsis16verlaagd. Inflammatoire voorwaarden, kunnen de vrije radicalen geproduceerd door disfunctionele mitochondriën verder bijdragen tot verhoogde oxidatieve stress en langdurige ontsteking17. De centrale rol van mitochondria in de productie van de energie zo goed zoals in oxidatieve stress suggereert het potentiële nut van het gebruik van mitochondriale functie als een proxy voor de studie van vermoeidheid in kanker patiënten 13.
Eerdere studies onderzoeken van mitochondriale functie gebruikt biochemische technieken, mitochondriale membraan potentiële meting of isolatie van specifieke cel populaties die niet mag gemakkelijk aanpasbaar in de klinische setting5, 14,18. In de afgelopen jaren de ontwikkeling van extracellulaire flux tests hebben onderzoekers gemakkelijk en nauwkeurig onderzoeken van wijzigingen in zuurstof verbruik tarief (OCR) in reactie op geautomatiseerde injecties van respiratoire remmers19,20 , 21 , 22. echter, de meeste van deze studies zijn ontworpen voor specifieke celtypes en het grote formaat van de hoge gegevensdoorvoer mogelijk niet van toepassing in een klinische setting. In dit manuscript beschrijven we een geoptimaliseerde protocol voor de behandeling van mitochondriale functie voor klinisch gebruik.

<table><tbody><tr><td>CPT Mononuclear Cells Preparation Tube&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>362761</td><td>Voor het isoleren van PBMC's na venepunctie</td></tr><tr><td>RPMI-1640&nbsp;</td><td>Corning</td><td>10-040</td><td>Voor het maken van groeimedia voor PBMC's</td></tr><tr><td>Fetal bovien serum (FBS)</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td>Voor het maken van groeimedia voor PBMC's</td></tr><tr><td>Penicilline/Streptomycine</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td>Voor het maken van groeimedia voor PBMC's</td></tr><tr><td>Cell-Tak</td><td>Corning</td><td>354240</td><td>Cel- en weefsel kleefoplossing; laat suspensiecellen aan de oppervlakte hechten</td></tr><tr><td>Seahorse XF Calibrant Solution</td><td>Agilent</td><td>103059-000</td><td>Voor het hydrateren van cartridges</td></tr><tr><td>XFp Fluxpak (miniplaten en sensor cartridges)</td><td>Agilent</td><td>103022-100</td><td>Bevat XFp celcultuur miniplaten en sensor cartridges</td></tr><tr><td>XF basismedia</td><td>Agilent</td><td>103335-100</td><td>Voor het maken van XF assay media</td></tr><tr><td>45% celcultuur D-(+)-Glucose oplossing</td><td>Corning</td><td>25-037-CI</td><td>Voor het maken van XF assay media</td></tr><tr><td>Natriumpyruvaat oplossing</td><td>Corning&nbsp;</td><td>25-000-CI</td><td>Voor het maken van XF assay media</td></tr><tr><td>L-glutamine oplossing</td><td>ThermoFisher</td><td>25030081</td><td>Voor het maken van XF assay media</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Mito Stress Test Kit</td><td>Agilent</td><td>103010-100</td><td>Bevat oligomycine, FCCP, antimycine A/rotenon</td></tr><tr><td>CyQUANT Direct Cell Proliferation Assay</td><td>ThermoFisher</td><td>C35011</td><td>Voor kwantificering van levende cellen en data normalisatie</td></tr><tr><td>Seahorse XFp Analyzer</td><td>Agilent</td><td>S7802AEA</td><td>Voor het meten van mitochondriale functie in levende cellen</td></tr><tr><td>Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (of elk instrument dat fluorescente cellen in een plaat kan kwantificeren)</td><td>BioTek</td><td>BTCYT5PV</td><td>Voor kwantificering van levende cellen en data normalisatie</td></tr></tbody></table>

evaluatie van de rol van mitochondriale functie in moeheid in verband met kanker

Evaluating the Role of Mitochondrial Function in Cancer-related Fatigue

Vermoeidheid is een gemeenschappelijk en het afmatten voorwaarde dat de meeste patiënten met kanker beïnvloedt. Tot op heden, test vermoeidheid blijft slecht gekenmerkt met geen diagnostische voor objectief maatregel de ernst van deze aandoening. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde methode voor de beoordeling van de mitochondriale functie van PBMCs verzameld uit vermoeid kankerpatiënten. Met een compacte extracellulaire flux-systeem en de sequentiële injectie van respiratoire remmers, onderzochten we PBMC mitochondriale functionele status door het meten van de basale mitochondriale ademhaling en luchtwegen reservecapaciteit energie fenotype, waarin wordt beschreven het traject van de voorkeur energie om te reageren op stress. Verse PBMCs zijn beschikbaar in de klinische setting met behulp van standaard phlebotomy. De hele test beschreven in dit protocol kan worden afgerond in minder dan 4 uur zonder de betrokkenheid van complexe biochemische technieken. Daarnaast beschrijven we een normalisatie-methode die nodig is voor reproduceerbare gegevens te verkrijgen. De eenvoudige procedure en de normalisatie methoden gepresenteerd mogelijk voor herhaalde sample collectie van dezelfde patiënt en generatie van reproduceerbare gegevens die kunnen worden vergeleken tussen de tijdstippen te evalueren van potentiële effecten van de behandeling.

De Mito Stress Test berust op het meten van zuurstof verbruik tarief (OCR) na sequentiële injectie van verschillende respiratoire remmers een compleet mitochondriale profiel toewijzen. OCR metingen na de injectie van elke drug kan worden gebruikt voor het berekenen van de volgende parameters in verband met mitochondriale gezondheid: Basale OCR wordt eerst gemeten vóór elke drug injectie te beoordelen zuurstofverbruik nodig om te voldoen aan niveau ATP vraag rusten. Basale...

Ons doel was het ontwikkelen van een praktische protocol om te evalueren van de mitochondriale dysfunctie vermoeidheid bij kankerpatiënten is gekoppeld. Dit innovatieve protocol is geoptimaliseerd voor klinisch gebruik waarbij alleen standaard phlebotomy en basic Labor procedures.

Evaluatie van de rol van mitochondriale functie in moeheid in verband met kanker

Fatigue is a common and debilitating condition that affects most cancer patients. To date, fatigue remains poorly characterized with no diagnostic test to ...

Het algemene doel van deze procedure is om mitochondriale disfunctie geassocieerd met vermoeidheid bij kankerpatiënten te evalueren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van ondersteunende kankerzorg, zoals of mitochondriale disfunctie geassocieerd is met vermoeidheid bij kankerpatiënten na bestralingstherapie. Het grote voordeel van deze techniek is dat het minder invasief is en gemakkelijk in de kliniek kan worden gebruikt om patiënten met een risico op toxiciteit door kankertherapie te identificeren.Deze techniek breidt niet alleen ons begrip van de rol van mitochondriale disfunctie bij vermoeidheid gerelateerd aan kanker uit, maar kan ook de beoordeling verbeteren en het beheer optimaliseren. Hoewel deze methode inzicht kan geven in de onderliggende mechanismen van vermoeidheid gerelateerd aan kanker, kan deze ook worden toegepast op andere vermoeidheidsgerelateerde aandoeningen, zoals metabole en urine-ontstekingsaandoeningen. Over het algemeen kan het voor personen die nieuw zijn met deze methode een uitdaging zijn om respiratoire remmers goed in elke poort van de sensorcartridge te injecteren zonder voorafgaande visuele demonstrat

evaluating-role-mitochondrial-function-cancer-related

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

Vermoeidheid is een veelvoorkomend, onvoldoende behandeld en vaak slecht begrepen symptoom bij vele ziekten en aandoeningen. Nieuwe preklinische tests op vermoeidheid kunnen helpen bij het verbeteren van het huidige begrip en de toekomstige behandeling van vermoeidheid. Met dat doel biedt het huidige protocol een nieuwe manier om vermoeidheidsachtig gedrag bij de muis te meten.

De loopband Vermoeidheid Test: Een eenvoudige, High-throughput assay van vermoeidheid-achtig gedrag van de muis

Hier presenteren we een protocol voor de isolatie van leukemische cellen van leukemie patiënten beenmerg en analyse van hun metabolische staat. Beoordeling van de metabole Profiel van primaire leukemie cellen zou kunnen bijdragen tot het beter karakteriseren de vraag van primaire cellen en omhoog zou kunnen leiden tot meer gepersonaliseerde geneeskunde.

Beoordeling van de metabole Profiel van primaire leukemie cellen

We ontwikkelden een praktisch protocol en een analytische benadering om mitochondriale oxidatieve fosforylering en elektronenoverdrachtscapaciteit in verse tumorhomogenaten te evalueren. Dit protocol kan eenvoudig worden aangepast om verschillende mitochondriale functies te onderzoeken die bijdragen aan het initiëren, progressie en behandelingsrespons van kanker.

Analytische bepaling van mitochondriale functie van weggesneden vaste tumorhomogenaten

Hoge resolutie respirometrie gekoppeld aan fluorescentiesensoren bepaalt mitochondriaal zuurstofverbruik en reactieve zuurstofsoorten (ROS) generatie. Het huidige protocol beschrijft een techniek om mitochondriale ademhalingssnelheden en ROS-productie in de gepermeabiliseerde heupzenuw te beoordelen.

Beoordeling van mitochondriale functie in heupzenuw door middel van hoge resolutie respirometrie

We beschrijven stapsgewijze protocollen die de mitochondriale ademhaling van muis en menselijke neutrofielen en HL60-cellen meten met behulp van de metabole extracellulaire fluxanalysator.

Real-time meting van het mitochondriale bio-energetische profiel van neutrofielen

Dit protocol beschrijft een techniek voor cybridegeneratie uit suspensie-groeiende kankercellen als een hulpmiddel om de rol van mitochondriën in het tumorogene proces te bestuderen.

Transmitochondriale Cybride generatie met behulp van kankercellijnen

De bio-energetica van CD8 T-cellen kan worden ondervraagd met behulp van de Mito-stresstest. Deze methodologie kan worden gebruikt om acute en chronische metabole programmering te bestuderen. Dit protocol beschrijft benaderingen om de relaties tussen T-celreceptorbiologie en bio-energetische analyse te onderzoeken.

Meten van de mitochondriale functie van naïeve en effector CD8 T-cellen

Hier presenteren we een respirometrieprotocol met hoge resolutie om bio-energetica in PINK1B9-null mutante fruitvliegjes te analyseren. De methode maakt gebruik van het SUIT-protocol (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Analyse van de mitochondriale functie in een Drosophila melanogaster PINK1 B9-Null-mutant met behulp van respirometrie met hoge resolutie

Hier beschrijven we een uitgebreide methode voor het meten van mitochondriale oxidatieve fosforylering in verse gepermeabiliseerde skeletspiervezels van menselijke of muizenspieren. Deze methode maakt de real-time kwantificering van de mitochondriale ademhaling en de beoordeling van brandstofvoorkeur en metabole flexibiliteit mogelijk, met behoud van bestaande mitochondriale netwerken en membraanintegriteit.

Meting van mitochondriale ademhaling in skeletspiervezels van mens en muis door middel van respirometrie met hoge resolutie

Deze studie gebruikt echografie voor diagnose en follow-up tests om werkzaamheid van de behandeling van Progressive Resistance Exercise (PRE) te bevestigen bij borstkanker in verband met lymfoedeem (BCRL). Echografie kan effectief worden toegepast voor diagnose en behandeling van lymfoedeem waarborgen.

Echografisch Evaluatie van borstkanker gerelateerd lymfoedeem

Leer hoe u mitochondriale dysfunctie evalueert bij kankergerelateerde vermoeidheid met behulp van standaard flebotomie en laboratoriumprocedures. Deze methode helpt patiënten te identificeren die risico lopen op toxiciteit van kankertherapie.

Evaluatie van de rol van mitochondriale functie in moeheid in verband met kanker

Meer video's verkennen