Productie van elastine-achtige eiwitten Hydrogels voor inkapselen en immunokleuring van cellen in 3D
May 19th, 2018
Recombinant eiwit-engineered hydrogels zijn voordelig voor 3D-celkweek als ze toe voor volledige tunability van de ruggengraat van het polymeer, en dus de cel communicatie. Hier beschrijven we het proces van recombinante elastine-achtige EiwitReiniging en de toepassing ervan in 3D hydrogel cel inkapseling.
Het algemene doel van dit protocol is om recombinant afgeleide elastine-achtige eiwitten te exprimeren en te zuiveren voor gebruik als een afstembare hydrogel voor 3D-celincapsulatie. Bovendien presenteert dit protocol de methodologie voor downstream fluorescente markering in confocale microscopie van ingekapselde cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken binnen de velden van biomaterialen, regeneratieve geneeskunde en celbiologie, zoals het begrijpen van de rol van cel-extracellulaire matrix interacties in 3D.
Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een reproduceerbare, afstembare en modulaire materiaalplatform biedt die geschikt is voor de studie van meerdere celtypen. Over het algemeen kan de implementatie van deze techniek onze kennis van de kritische cel ECM signaalparameters verbeteren die de succes van toekomstige cel-gebaseerde regeneratieve therapieën kunnen bepalen. Streek een ampicilline en chlooramfenicol agar plaat met een voorgemaakte bacteriestok die een vector bevat die codeert voor de ELP van belang.
Bekijk vervolgens de gestreepte plaat ondersteboven bij 37 graden Celsius een nacht lang om bacteriegroei mogelijk te maken. De volgende dag, pluk een enkele kolonie van de plaat en inoculeer de voorverwarmde startercultuur. Bewaar de cultuur in een shaker bij 37 graden Celsius gedurende 16 uur.
Na de incubatieperiode, gebruik een serologische pipet om 20 milliliter van de startercultuur over te brengen naar elke expressieflacon. Laat de expressieflacon een uur lang schudden. Na een uur, meet de optische dichtheid bij 600 nanometer van een aliquot uit de expressieflacon.
Zodra de lezing 0,6 bereikt, verlaag de temperatuur van de shaker naar 32 graden Celsius. Wanneer de lezing 0,8 bereikt, voeg een milliliter van een molaar sterieel gefilterd IPTG toe om ELP expressie in de expressieflacon te induceren. Laat de cultuur gedurende zeven uur expresseren.
Na zeven uur, centrifugeer de expressiemedia bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in een vloercentrifuge. Na de centrifugatie, gebruik een spatel om de cellenpellet uit het centrifugecontainer te verzamelen en plaats deze in een vooraf gewogen ziploc zak. Los vervolgens de cellenpellet op in sterieel gefilterde TEN buffer.
Massage de cellenpellet om een homogene oplossing te vormen. Vries de ziploc zak met de heropgeloste cellenpellet in een secundair container bij 80 graden Celsius. Voeg aan de ontdooide cellenpellet ongeveer 30 tot 40 milligram deoxyribonuclease en een milliliter van 100 millimolar PMSF toe voor elke 100 milliliter cellysaat.
Bewaar de lysaat bij vier graden Celsius op een shaker gedurende een nacht. Na de derde vries-dooi cyclus, centrifugeer de monsters bij minimaal 15.000 x g gedurende een uur bij vier graden Celsius. Na de centrifugatie, giet het supernatant uit het centrifugecontainer en breng de oplossing over naar een nieuw centrifugecontainer.
Voeg aan elke 100 milliliter supernatant 5,84 gram natriumchloride in drie delen toe tot een eindconcentratie van één molaar. Bewaar de suspensie in een schudende incubator bij 37 graden Celsius gedurende drie uur. Na de incubatie, centrifugeer de monsters bij minimaal 15.000 x g gedurende een uur bij 37 graden Celsius.
Na de centrifugatie, gooi het supernatant uit het centrifugecontainer weg en weeg het pellet. Voeg vervolgens 10 milliliter van autoclaved ultrapuur water toe per gram pellet verkregen na de centrifugatie. Om ervoor te zorgen dat het eiwit volledig oplost, gebruik een metalen spatel om het pellet te pletteren en opnieuw op te schorsen.
Bewaar het heropgeloste pellet bij vier graden Celsius gedurende een nacht op een orbitale shaker. Herhaal de koude en hete centrifugatie stappen gedurende een totaal van drie cycli om het ELP verder te zuiveren. Daarna, dialyseer het resterende supernatant in een 3,5 kilodalton dialyse membraan tegen vier liter voorgekoeld ultrapuur water bij vier graden Celsius gedurende drie dagen om de eiwit oplossing te ontzouten.
Centrifugeer de uiteindelijke gedialyseerde oplossing in een voorgekoelde centrifuge. Vries het supernatant bij 80 graden Celsius in een vooraf gewogen conische buis. Lyofiliseer vervolgens de bevroren oplossing gedurende drie dagen en weeg tenslotte het uiteindelijke lyofilisaat om de eiwit opbrengst te bepalen.
Met behulp van een biopsiepomp, maak gaten in een 0,5 millimeter dikke siliconen blad. Snijd vervolgens een vierkant rond elk gat. Gebruik vervolgens pincetten om de plastic folie van elke kant van de individuele mallen te verwijderen.
Na het verwijderen van de plastic folie, gebruik de pincetten om het identieke aantal kale siliconen mallen en glazen deksels in afwisselende rijen op het deksel van een 48 well plaat te positioneren voor verdere plasmabinding. Nadat alle celcultuurmaterialen zijn gemaakt, kan de voorbereiding van het celtype van belang voor downstream hydrogel incapsulatie beginnen. Nadat de cellen zijn gedissocieerd in een enkele cel suspensie, verdeel het gewenste aantal cellen in een 1,5 milliliter centrifugebuis.
Centrifugeer vervolgens de cellen bij ongeveer 200 x g gedurende drie minuten. Na de centrifugatie, zuig het supernatant op en bewaar de pellet op ijs. Heropschort de cellenpellet in ELP stock oplossing tot 80% van het eindvolume.
Gebruik vervolgens een pipet om de oplossing te mengen tot een homogene suspensie van cellen in ELP. Voor de resterende 20% eindvolume, voeg THPC stock oplossing toe aan de cel ELP suspensie. Pipet verscheidene keren om de vorming van een homogene mengsel te waarborgen, terwijl de vorming van luchtbellen wordt vermeden.
Pipet vervolgens in een cirkelvormige beweging de cel ELP THPC mengsel in elke mal in een 24 well plaat. Bewaar vervolgens de monsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Na 15 minuten, bewaar de monsters bij 37 graden Celsius gedurende een extra 15 minuten.
Zodra de incubatie voorbij is, voeg voorzichtig 750 microliter warm celcultuur medium toe aan elke well in een 24 well plaat. Laat de hydrogel bij 37 graden Celsius gedurende de gewenste cultuurduur. Zuig eerst het medium uit elke well.
Was vervolgens de wells met een milliliter warm DPBS. Nadat het wassen voltooid is, voeg 750 microliter fixeer
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit protocol beschrijft de expressie en zuivering van elastine-achtige eiwitten voor gebruik in aanpasbare hydrogels die geschikt zijn voor 3D-cellencapsulatie. Het beschrijft ook methoden voor fluorescerende markering van gecapsuleerde cellen voor analyse met confocale microscopie.
Belangrijkste Studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Biomaterialen
- Regeneratieve Geneeskunde
- Celbiologie
Achtergrond
- Recombinant-eiwit-geengineerde hydrogels bieden aanpasbaarheid van de polymeerruggengraat.
- Deze hydrogels kunnen de celmicro-omgeving aanzienlijk beïnvloeden.
- Het begrijpen van cel-extracellulaire matrix-interacties is cruciaal voor regeneratieve therapieën.
- De techniek biedt een reproduceerbaar en modulair materiaalplatform.
Doel van het Onderzoek
- Om elastine-achtige eiwitten te zuiveren voor 3D-cellencapsulatie.
- Om het onderzoek naar cel-ECM-interacties in een gecontroleerde omgeving mogelijk te maken.
- Om inzichten te verbeteren in celsignaleringsparameters die regeneratieve therapieën beïnvloeden.
Gebruikte Methoden
- Expressie van elastine-achtige eiwitten in bacteriële systemen.
- Zuivering van eiwitten voor hydrogelvorming.
- Fluorescerende markering van gecapsuleerde cellen.
- Confocale microscopie voor beeldvorming van celinteracties.
Belangrijkste Resultaten
- Succesvolle zuivering van elastine-achtige eiwitten.
- Ontwikkeling van een aanpasbare hydrogel voor 3D-celcultuur.
- Fluorescerende markeringstechnieken gevalideerd voor confocale microscopie.
- Inzichten verkregen in cel-ECM-interacties in 3D-omgevingen.
Conclusies
- Het protocol biedt een robuuste methode voor het bestuderen van celgedrag in 3D.
- Recombinante hydrogels kunnen worden aangepast voor verschillende celtypen.
- Deze aanpak kan toekomstige cel-gebaseerde regeneratieve therapieën verbeteren.
Veelgestelde Vragen
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible, tunable hydrogel platforms for 3D cell encapsulation, addressing the translational gap between 2D in vitro models and in vivo microenvironments. By providing independent control over mechanical properties and cell-adhesive ligand concentration, it supports mechanistic de-risking in early discovery and improves predictive confidence in cell-based regenerative therapy development. The method enhances workflow continuity from target validation through preclinical modeling by enabling standardized, quantitative assessment of cell-ECM interactions in disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by modulating ECM mechanics and ligand density to clarify pathway-specific cell responses.
- Operational Value: Provides a modular material system for consistent phenotypic screening across multiple cell types under defined 3D conditions.
- Predictive Value: Supports lead identification by reducing mechanistic ambiguity in cell-ECM signaling parameters critical for regenerative medicine targets.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized hydrogels with quantifiable mechanical and biochemical outputs for reliable compound or genetic perturbation screening.
- Reproducibility: Enables batch-to-batch consistency in hydrogel formulation, supporting assay standardization and cross-functional data comparison.
- Scalability: Supports platform reuse in downstream workflows through lyophilized protein storage and rapid reconstitution for high-throughput encapsulation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Facilitates modeling of pathophysiological microenvironments by tuning hydrogel properties to match tissue-specific ECM profiles.
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical validation by maintaining consistent 3D culture conditions across workflow stages.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on quantitative immunostaining readouts of stemness markers and viability in encapsulated cells.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification and preclinical evaluation, providing a tunable 3D system that improves biological fidelity at each stage.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling precise control over ECM variables that influence cellular phenotype and signaling.
- Screening: Delivers assay-ready hydrogels with reproducible encapsulation efficiency and downstream compatibility with immunostaining and imaging workflows.
- Analytics: Generates quantitative fluorescence readouts from immunostained biomarkers (e.g., Sox2, nestin) and viability assays, enabling objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Maintains phenotypic stability of progenitor cells over extended culture periods, supporting continuity from mechanistic discovery to preclinical validation.
- Enterprise Reuse: Positions the ELP expression and purification pipeline as a reusable platform capability for multiple projects requiring customizable 3D microenvironments.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing biological noise through tunable, defined 3D matrices that better reflect in vivo ECM complexity.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via lyophilizable protein stocks and standardized encapsulation protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets through mechanistic insights into cell-ECM dependencies.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by generating quantitative, imaging-based endpoints for assessing cellular responses in 3D.
Implementation Considerations
- Requires expertise in recombinant protein expression, bacterial culture, and purification techniques including centrifugation, dialysis, and lyophilization.
- Dependent on access to shakers, centrifuges, and electrophoresis/wblotting equipment for expression validation and quality control.
- Necessitates standardization of hydrogel formulation ratios and crosslinking conditions across teams to ensure mechanical and ligand consistency.
- Requires adaptation of cell dissociation and resuspension protocols for different cell types to maintain viability during encapsulation.
- Practical limitations include the need for optimization of ELP variant ratios to independently tune mechanics and adhesion without compromising gelation kinetics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:58
ELP Expression Protocol
5:06
Cell Encapsulation in 3D Elastin-like Protein Hydrogels
7:11
Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels
9:47
Results: Purification of Elastin-like Protein and its Application for 3D Hydrogel Cell Encapsulation
11:18
Conclusion
