Productie van elastine-achtige eiwitten Hydrogels voor inkapselen en immunokleuring van cellen in 3D

Het algemene doel van dit protocol is om recombinant afgeleide elastine-achtige eiwitten te exprimeren en te zuiveren voor gebruik als een afstembare hydrogel voor 3D-celincapsulatie. Bovendien presenteert dit protocol de methodologie voor downstream fluorescente markering in confocale microscopie van ingekapselde cellen. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken binnen de velden van biomaterialen, regeneratieve geneeskunde en celbiologie, zoals het begrijpen van de rol van cel-extracellulaire matrix interacties in 3D.

Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een reproduceerbare, afstembare en modulaire materiaalplatform biedt die geschikt is voor de studie van meerdere celtypen. Over het algemeen kan de implementatie van deze techniek onze kennis van de kritische cel ECM signaalparameters verbeteren die de succes van toekomstige cel-gebaseerde regeneratieve therapieën kunnen bepalen. Streek een ampicilline en chlooramfenicol agar plaat met een voorgemaakte bacteriestok die een vector bevat die codeert voor de ELP van belang.

Bekijk vervolgens de gestreepte plaat ondersteboven bij 37 graden Celsius een nacht lang om bacteriegroei mogelijk te maken. De volgende dag, pluk een enkele kolonie van de plaat en inoculeer de voorverwarmde startercultuur. Bewaar de cultuur in een shaker bij 37 graden Celsius gedurende 16 uur.

Na de incubatieperiode, gebruik een serologische pipet om 20 milliliter van de startercultuur over te brengen naar elke expressieflacon. Laat de expressieflacon een uur lang schudden. Na een uur, meet de optische dichtheid bij 600 nanometer van een aliquot uit de expressieflacon.

Zodra de lezing 0,6 bereikt, verlaag de temperatuur van de shaker naar 32 graden Celsius. Wanneer de lezing 0,8 bereikt, voeg een milliliter van een molaar sterieel gefilterd IPTG toe om ELP expressie in de expressieflacon te induceren. Laat de cultuur gedurende zeven uur expresseren.

Na zeven uur, centrifugeer de expressiemedia bij 12.000 x g gedurende 15 minuten bij vier graden Celsius in een vloercentrifuge. Na de centrifugatie, gebruik een spatel om de cellenpellet uit het centrifugecontainer te verzamelen en plaats deze in een vooraf gewogen ziploc zak. Los vervolgens de cellenpellet op in sterieel gefilterde TEN buffer.

Massage de cellenpellet om een homogene oplossing te vormen. Vries de ziploc zak met de heropgeloste cellenpellet in een secundair container bij 80 graden Celsius. Voeg aan de ontdooide cellenpellet ongeveer 30 tot 40 milligram deoxyribonuclease en een milliliter van 100 millimolar PMSF toe voor elke 100 milliliter cellysaat.

Bewaar de lysaat bij vier graden Celsius op een shaker gedurende een nacht. Na de derde vries-dooi cyclus, centrifugeer de monsters bij minimaal 15.000 x g gedurende een uur bij vier graden Celsius. Na de centrifugatie, giet het supernatant uit het centrifugecontainer en breng de oplossing over naar een nieuw centrifugecontainer.

Voeg aan elke 100 milliliter supernatant 5,84 gram natriumchloride in drie delen toe tot een eindconcentratie van één molaar. Bewaar de suspensie in een schudende incubator bij 37 graden Celsius gedurende drie uur. Na de incubatie, centrifugeer de monsters bij minimaal 15.000 x g gedurende een uur bij 37 graden Celsius.

Na de centrifugatie, gooi het supernatant uit het centrifugecontainer weg en weeg het pellet. Voeg vervolgens 10 milliliter van autoclaved ultrapuur water toe per gram pellet verkregen na de centrifugatie. Om ervoor te zorgen dat het eiwit volledig oplost, gebruik een metalen spatel om het pellet te pletteren en opnieuw op te schorsen.

Bewaar het heropgeloste pellet bij vier graden Celsius gedurende een nacht op een orbitale shaker. Herhaal de koude en hete centrifugatie stappen gedurende een totaal van drie cycli om het ELP verder te zuiveren. Daarna, dialyseer het resterende supernatant in een 3,5 kilodalton dialyse membraan tegen vier liter voorgekoeld ultrapuur water bij vier graden Celsius gedurende drie dagen om de eiwit oplossing te ontzouten.

Centrifugeer de uiteindelijke gedialyseerde oplossing in een voorgekoelde centrifuge. Vries het supernatant bij 80 graden Celsius in een vooraf gewogen conische buis. Lyofiliseer vervolgens de bevroren oplossing gedurende drie dagen en weeg tenslotte het uiteindelijke lyofilisaat om de eiwit opbrengst te bepalen.

Met behulp van een biopsiepomp, maak gaten in een 0,5 millimeter dikke siliconen blad. Snijd vervolgens een vierkant rond elk gat. Gebruik vervolgens pincetten om de plastic folie van elke kant van de individuele mallen te verwijderen.

Na het verwijderen van de plastic folie, gebruik de pincetten om het identieke aantal kale siliconen mallen en glazen deksels in afwisselende rijen op het deksel van een 48 well plaat te positioneren voor verdere plasmabinding. Nadat alle celcultuurmaterialen zijn gemaakt, kan de voorbereiding van het celtype van belang voor downstream hydrogel incapsulatie beginnen. Nadat de cellen zijn gedissocieerd in een enkele cel suspensie, verdeel het gewenste aantal cellen in een 1,5 milliliter centrifugebuis.

Centrifugeer vervolgens de cellen bij ongeveer 200 x g gedurende drie minuten. Na de centrifugatie, zuig het supernatant op en bewaar de pellet op ijs. Heropschort de cellenpellet in ELP stock oplossing tot 80% van het eindvolume.

Gebruik vervolgens een pipet om de oplossing te mengen tot een homogene suspensie van cellen in ELP. Voor de resterende 20% eindvolume, voeg THPC stock oplossing toe aan de cel ELP suspensie. Pipet verscheidene keren om de vorming van een homogene mengsel te waarborgen, terwijl de vorming van luchtbellen wordt vermeden.

Pipet vervolgens in een cirkelvormige beweging de cel ELP THPC mengsel in elke mal in een 24 well plaat. Bewaar vervolgens de monsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Na 15 minuten, bewaar de monsters bij 37 graden Celsius gedurende een extra 15 minuten.

Zodra de incubatie voorbij is, voeg voorzichtig 750 microliter warm celcultuur medium toe aan elke well in een 24 well plaat. Laat de hydrogel bij 37 graden Celsius gedurende de gewenste cultuurduur. Zuig eerst het medium uit elke well.

Was vervolgens de wells met een milliliter warm DPBS. Nadat het wassen voltooid is, voeg 750 microliter fixeer