Name: Subcellular fractionering van verse en diepgevroren gastro-intestinale Specimens (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Leer subcellulaire fractie-analyse van verse en diepgevroren gastro-intestinale biopten. Deze methode scheidt cytoplasmatische en nucleaire eiwitten voor lokalisatiestudies en functionele analyse.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Auteurs erkennen de hulp van Ander Lopez en Miren Telletxea voor video opnemen en bewerken. ACR is gefinancierd door een beurs Ikerbasque en een onderzoeksproject van de Asociación de Celiacos Madrid (ACM). RGI is gefinancierd door Project ISCIII-PI16/00258 en medegefinancierd door de Europese Unie EFRO/ESF "Een manier om Europa te maken". IS wordt gefinancierd door een projectsubsidie onderzoek 2015111068 van het Baskische ministerie van volksgezondheid. IRG en AJM worden ondersteund door predoctoraal fellowship subsidies uit de UPV/EHU en het Baskische ministerie van onderwijs, respectievelijk.

Deze studie werd goedgekeurd door de Cruces Universiteit ziekenhuis Ethics Board en analyses werden uitgevoerd nadat toestemming is verkregen van alle onderwerpen of hun ouders.
1. biopsie collectie
Opmerking: Biopsie exemplaren van de distale twaalfvingerige darm van patiënten zijn verkregen tijdens routinematige diagnose endoscopie, biopten beheren dat bereik tussen 2 en 10 mg in gewicht. Biopsied weefsel is een complex weefsel dat bestaat uit verschillende soorten cellen met inbegrip van epitheliale, immuun en endotheliale cellen. Klinische gastroenterologen uitvoeren de endoscopie volgende klinische richtsnoeren opgesteld.
<ol><li>Plaats de biopsie op een steriele filterpapier net na endoscopie.</li>
	<li>Pincet kunt door overdracht van de biopsieën in 1,5 mL buizen, geniet ze met PBS en leg deze in een cryotube.</li>
	<li>Houd buizen op ijs totdat ze in het laboratorium aankomen.<ol>
<li>Begonnen met de verwerking van verse biopsieën onmiddellijk.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Voor bevroren biopsieën, flash bevriezen de biopsie met buizen en bewaren in vloeibare stikstof tot gebruik. Opmerking: Het is belangrijk om te houden van het monster bevroren totdat de koude aangevuld buffer 1 wordt toegevoegd.</li>
</ol>2. buffer voorbereiding
Opmerking: Voordat u begint, aanvulling van de buffers als volgt.
<ol><li>Voeg 1 mM DTT (eindconcentratie) en protease en phosphatase remmer cocktail (1 x eindconcentratie) aan de hypotone buffer 1 en hypertonic buffer 2 (tabel 1).<ol>
<li>Bereiden van 1,5 mL buffer 1 en 150 µL van buffer 2 per monster. DTT zal het voorkomen van de oxidatie van de monsters.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiden kernen was buffer door 1% wasmiddel (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) toe te voegen aan een definitieve concentratie van 0,1% aan de reeds aangevuld buffer 1. Bereiden 1 mL kernen was buffer per monster.</li>
</ol>3. biopsie homogenisering
<ol><li>
Verse biopten
	<ol>
<li>Plaats de wegwerp stamper in de gemotoriseerde mixer. Zorgen dat de stamper terechtkomt bij de onderkant van de buis.</li>
		<li>Neem de biopsie uit de cryotube en plaats deze in een 1,5 mL tube met een pipet tip.</li>
		<li>Voeg 200 µL van aangevuld buffer 1 aan de 1,5 mL-buis.</li>
		<li>Meng de biopsie met de stamper tot het weefsel wordt volledig verstoord en bewaar deze op ijs.</li>
		<li>Zodra alle de biopten worden gehomogeniseerd gaat u verder met stap 4. Opmerking: Disposable pestles moeten worden gewijzigd tussen biopsieën.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bevroren biopten Let op: Voorzichtig vloeibare stikstof; contact van vloeibare stikstof met de huid of ogen kan ernstige schade kan bevriezen. Bescherm handen en ogen altijd bij het werken met vloeibare stikstof.<ol>
<li>Neem sommige vloeibare stikstof in een doos voor het opslaan van de cryotubes ontvangen van de stikstof tank.</li>
		<li>De biopsie in de stikstof tank zoeken en plaatsen van de cryotube in het vak met de vloeibare stikstof. Herhaal deze stap voor alle de biopten.</li>
		<li>De biopsie van de cryotube tot een 1,5 mL koker overbrengen. Opmerking: Biopsieën zal worden gehecht aan de bevroren buis. Duw de biopsie met een steriele Pipetteer tip dus het van de buis losmaken zal.</li>
		<li>Voeg 200 µL van aangevuld buffer 1.</li>
		<li>Meng het weefsel met behulp van de stamper en vijzel, tot het weefsel is helemaal verstoord, de maximumtemperatuur bij 4 ° C gedurende al de procedure. Opmerking: Laat geen biopsieën ontdooien voordat de buffer wordt toegevoegd.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cytoplasma isolatie
<ol><li>Incubeer de gehomogeniseerde biopsie op ijs gedurende 10 minuten.</li>
	<li>10 µL van 1% wasmiddel (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) aan elk monster voor een eindconcentratie van 0,05% toevoegen. Opmerking: Cellen zal zwellen en barsten door osmotische lysis zoals de mild schoonmaakmiddel de celmembraan verstoren zal.</li>
	<li>Incubeer op ijs gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Vortex kort en centrifugeer bij 400 x g bij 4 ˚C gedurende 2 min.</li>
	<li>Na vortexing, verwijder het supernatant en overbrengen naar een nieuwe schone 1,5 mL-buis; Dit zal de cytoplasmatische breuk. Gooi niet de pellet.</li>
</ol>5. nucleaire isolatie
<ol><li>Resuspendeer de pellet in de vorige stap met 200 µL van kernen was buffer.</li>
	<li>Centrifugeer de buis gedurende 2 minuten bij 400 x g- en 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en herhaal de procedure wassen twee meer tijden. Opmerking: De wasbeurten verwijdert cytoplasmatische verontreiniging in de nucleaire Fractie.</li>
	<li>Na de derde wash, resuspendeer de pellet in 100 µL van buffer 2.</li>
	<li>Goed schudden het monster op 4 ˚C voor 30 min. alternatief, Incubeer het monster op ijs en vortex elke 5 min.</li>
	<li>Na schudden, Centrifugeer het monster gedurende 10 minuten op topsnelheid (> 12.000 x g) en 4 ° C.</li>
	<li>Breng de bovendrijvende substantie in een nieuwe schone 1.5 na vortexing. mL-buis. Dit zal de nucleaire breuk.</li>
</ol>6. eiwit kwantificering
Let op: De eiwitten met een bicinchoninic zuur (BCA) eiwit assay kit te kwantificeren. De concentratie van proteïnen toe in de fracties zullen variëren tussen de 0.5 en 5 µg/µL, lager in het nucleaire fractie (eiwit concentratie van 2 mg biopsieën resulterende Zie tabel 2 ).
<ol><li>Voorbereiden van een standaard kromme met de volgende bedragen (µg) bovien serumalbumine (BSA)-12: 0-0.5-1-2-3-4-5-6.</li>
	<li>Voorbereiden van de reagentia die nodig zijn voor het gebruik van 100 µL van definitieve BCA mix per monster.</li>
	<li>Pipetteer 2 µL van elke eiwitoplossing in een 96 goed bord, voeg de BCA-mix en volg de instructies van de fabrikant voor de lezing.</li>
</ol>

<ol><li>Cox, B., Emili, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+subcellular+fractionation+and+protein+extraction+for+use+in+mass-spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tissue subcellular fractionation and protein extraction for use in mass-spectrometry-based proteomics.</a> Nature Protocols. 1 (4), 1872-1878 (2006).</li>
<li>Itzhak, D. N., Tyanova, S., Cox, J., Borner, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global%2C+quantitative+and+dynamic+mapping+of+protein+subcellular+localization%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Global, quantitative and dynamic mapping of protein subcellular localization.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Preedy, V. R., Watson, R. R., Ronald, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPreedy%2C+VR+%22Methods+in+disease+investigating+the+gastrointestinal+tract%22">Methods in disease investigating the gastrointestinal tract</a>. , Greenwich Medical Media. (1998).</li>
<li>Alex, P., Gucek, M., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+proteomics+in+the+study+of+inflammatory+bowel+diseases%3A+Current+status+and+future+directions+with+available+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+bowel+diseases%22%5BJournal%5D)">Applications of proteomics in the study of inflammatory bowel diseases: Current status and future directions with available technologies.</a> Inflammatory bowel diseases. 15 (4), 616-629 (2009).</li>
<li>Ericsson, C., Franzén, B., Nistér, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frozen+tissue+biobanks.+Tissue+handling%2C+cryopreservation%2C+extraction%2C+and+use+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+oncologica+%28Stockholm%2C+Sweden%29%22%5BJournal%5D)">Frozen tissue biobanks. Tissue handling, cryopreservation, extraction, and use for proteomic analysis.</a> Acta oncologica (Stockholm, Sweden). 45 (6), 643-661 (2006).</li>
<li>Hoffmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+application+of+a+subcellular+fractionation+method+to+kidney+and+testis+for+the+determination+of+conjugated+linoleic+acid+in+selected+cell+organelles+of+healthy+and+cancerous+human+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">New application of a subcellular fractionation method to kidney and testis for the determination of conjugated linoleic acid in selected cell organelles of healthy and cancerous human tissues.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 381 (6), 1138-1144 (2005).</li>
<li>Foster, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mammalian+Organelle+Map+by+Protein+Correlation+Profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Mammalian Organelle Map by Protein Correlation Profiling.</a> Cell. 125 (1), 187-199 (2006).</li>
<li>Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+fractionation+and+isolation+of+subcellular+proteins+from+tissue+or+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells.</a> MethodsX. 2, e440-e445 (2015).</li>
<li>Börner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+protein+extraction+from+human+pancreatic+cancer+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Subcellular protein extraction from human pancreatic cancer tissues.</a> BioTechniques. 46 (4), 297-304 (2009).</li>
<li>Antalis, T. M., Shea-Donohue, T., Vogel, S. N., Sears, C., Fasano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+disease%3A+protease+functions+in+intestinal+mucosal+pathobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+clinical+practice.+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of disease: protease functions in intestinal mucosal pathobiology.</a> Nature clinical practice. Gastroenterology. 4 (7), 393-402 (2007).</li>
<li>Cutler, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCutler%2C+P+%22Protein+purification+protocols%22">Protein purification protocols</a>. , Humana Press. (2004).</li>
<li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Bicinchoninic+Acid+%28BCA%29+Assay+for+Protein+Quantitation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Protein+Protocols+Handbook%22%5BJournal%5D)">The Bicinchoninic Acid (BCA) Assay for Protein Quantitation.</a> The Protein Protocols Handbook. , 11-14 (1996).</li>
<li>McLane, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+localization+of+T-bet+and+Eomes+in+CD8+T+cell+memory+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology+%28Baltimore%2C+Md.%3A+1950%29%22%5BJournal%5D)">Differential localization of T-bet and Eomes in CD8 T cell memory populations.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 190 (7), 3207-3215 (2013).</li>
<li>Nguyen, K. T., Holloway, M. P., Altura, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CRM1+nuclear+export+protein+in+normal+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+biochemistry+and+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">The CRM1 nuclear export protein in normal development and disease.</a> International journal of biochemistry and molecular biology. 3 (2), 137-151 (2012).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het protocol hier beschreven wordt gebruikt voor de nucleaire en cytoplasmatische fractionering van intestinale biopsieën. De gezuiverde eiwitten zijn niet gedenatureerd en kan worden gebruikt, niet alleen in westelijke vlekkenanalyse zoals weergegeven in Figuur 2 en 3 , maar ook in tests vereisen native-gevouwen eiwitten zoals immunoprecipitation, elektroforetische mobiliteit shift assay (EMSA) of native polyacrylamide gelelektroforese (pagina).
...

Eiwitten nemen in bijna alle biologische functies binnen een cel en elke wijziging in hun structuur, de hoeveelheid of de locatie kan leiden tot een pathogene scenario. Weefsel monster fractionering methoden zijn een nuttige benadering naar het verminderen van de complexiteit van ziekte gerelateerde eiwit analyses. Sommige studies gebruik eiwit lokalisatie-informatie of verrijken van een eiwit van een specifieke cellulaire compartiment, zodat een protocol voor reproduceerbare fractionering van intacte eiwitten is nuttig om bepaalde biologische vragen te beantwoorden. Bepalen de subcellular localisatie van eiwitten en het toezicht op hun compartimentaire herverdeling of interacties op basale en ziekten zal helpen bij het identificeren van ziekte gerelateerde functionele verschillen1,2. Dus, wil deze methode reproducibly fractionate intestinale weefsel biopsieën, zowel vers als diepgevroren, in cytoplasmatische en nucleaire subcellular compartimenten.
Intestinale biopsie monsters worden routinematig verkregen tijdens de endoscopie procedures3 (Figuur 1) en effectief kunnen worden gebruikt voor eiwit kwantificering of immunoprecipitation studies. Aangezien weefselmonsters van intestinale epitheliale eiwitten die rechtstreeks kunnen worden betrokken bij de ziekte pathogenese4 bevatten zal, zijn intestinale biopsie monsters een zeer waardevolle bron voor de succesvolle identificatie van intestinale ziekte-specifieke eiwitten. Opgeslagen bevroren, geduldige weefselsteekproeven samen met de klinische informatie zijn nuttige middelen voor eiwit analyse, en een eenvoudige en reproduceerbare monstervoorbereiding is een belangrijke kwestie te informeren cel compartimentaire behulp van beperkende bedragen van bevroren weefsel5.
Er zijn verschillende commercieel beschikbare kits voor de scheiding van cellulaire breuken, maar deze zijn duurder en over het algemeen meer tijd in beslag dan het protocol hier gepresenteerd. Protocollen op basis van meerdere stappen kleurovergang centrifugeren en continu verlopen ook al eerder hebt gebruikt voor de versplintering van diverse cellulaire compartimenten in verschillende weefsels en6,7. Onderhouden van de consistentie van continue verlopen is echter vaak een moeilijke taak. Soortgelijke protocollen op basis van de sequentiële lysis van membranen zijn eerder beschreven maar ze moeten over het algemeen meer dan twee buffers en de handen op tijd is langer8 .
Wanneer van weefselmonsters, niet vergeten dat weefsel monsters huidige cel-cel en cel-matrix interacties die zowel niet aanwezig in gekweekte cellen zijn en belangrijk wanneer u eiwit extractie. De juiste verdeling tussen cellen en extracellulaire matrix zonder de kwaliteit van de eiwitten te beïnvloeden zullen een cruciale factor in de intestinale weefsel eiwit isolatie9. In dit protocol zijn cel-cel en cel-matrix contacten eerst gebroken, het vrijgeven van de cellen en waardoor de buffer te bereiken van de afzonderlijke cellen. Om te voorkomen dat eiwit-vaks mengen vóór fractionering, moet de verdeling van de contactpersonen plaatsvinden zonder dat de integriteit van de cellen of de nucleaire membranen.
Door de verrijking van verschillende proteasen in de intestinale mucosa10is het belangrijk om te controleren de eiwit-afbraak tijdens extractie. Om te minimaliseren van de potentiële eiwit-afbraak, moet meerdere proteaseinhibitor worden opgenomen in de eiwit extractie buffers. Bovendien, als extracten worden gebruikt voor functionele testen gaat, is het essentieel om te voorkomen dat de denaturatie van eiwitten of proteolyse omdat dit leiden een verlies van eiwit activiteit11 tot zal. Voor dit doel, het protocol wordt uitgevoerd bij 4 ° C en verse phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) wordt toegevoegd aan de buffers op een eindconcentratie van 0.1 mM enkel voorafgaand aan het gebruiken om te remmen verder proteolyse.
De eerste stap in cel fractionering is verstoring van de weefsel en lysis van de cel. Zoals eerder vermeld, is het doel om het gedesag van de cellen en breken die ze met minimale schade open. Intestinale weefselsteekproeven moeten worden gehomogeniseerd en de cellen lysed om maximale breuk van de celmembraan. In dit protocol gebruiken we een gemotoriseerde stamper mixer te breken de intestinale weefsel dat is gehomogeniseerd binnen enkele seconden door middel van hoge snelheid vortexing actie. Na homogenisatie, weefselcellen geïncubeerd in een hypotone buffer die zal barsten het celmembraan, maar zal behouden de kernen, gevolgd door toevoeging van een niet-denaturering wasmiddel (nonyl phenoxypolyethoxylethanol) en een korte vortex te scheiden van de kernen uit de cytoplasmatische afvalfractie. Na de verwijdering van het cytoplasma, is de celmembraan van de kernen barstte in een hypertonic buffer met schudden.
De methode die hier gepresenteerd is een geschikte methode voor de subcellular fractionering van verse en diepgevroren intestinale biopsieën die zijn verkregen tijdens de Endoscopische procedures en bereik tussen 2 en 10 mg in gewicht. Het protocol is gemakkelijk en reproduceerbaar en kan worden uitgevoerd met behulp van elementaire laboratoriumapparatuur en reagentia in minder dan een uur.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034-1kg</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333-1kg</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5588886-1kg</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10199777001</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase en fosfatase remmers</td><td>Thermo Scientific</td><td>A32959</td><td></td></tr><tr><td>NP-40&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CA-630</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>BCA assay</td><td>Thermo Scientific</td><td>23227</td><td>Eiwit kwantificeringskit</td></tr><tr><td>Disponeerbare plastic stampers</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z359947-100EA</td><td></td></tr><tr><td>Dounce homogenisator</td><td>VWR</td><td>431-0100</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5415-R</td><td></td></tr><tr><td>Shacker</td><td>IKA</td><td>MS3 basic</td><td></td></tr></tbody></table>

subcellular fractionering van verse en diepgevroren gastro-intestinale specimens

Subcellular Fractionation from Fresh and Frozen Gastrointestinal Specimens

Het doel van dit protocol is aan menselijke intestinale weefsels verkregen door endoscopie in nucleaire en cytoplasmatische compartimenten voor de analyse van de lokalisatie van specifieke proteïnen of eiwitcomplexen in verschillende weefsels Staten (dat wil zeggen, gezonde fractionate VS. ziekte). Deze methode is handig voor de versplintering van zowel verse en diepgevroren intestinale weefselsteekproeven; het is gemakkelijk toegankelijk voor alle laboratoria en niet tijdrovend.

Figuur 1 toont een Haematoxyline eosine-kleuring van een gedeelte van de intestinale biopsie met intact villi en crypte structuren.
Representatieve resultaten van nucleaire en cytoplasmatische fractionering met behulp van dit protocol worden weergegeven in de figuren 2 en 3. In het experiment wordt weergegeven in Figuur 2, een vers (Fh)...

Hier presenteren we een protocol voor het uitvoeren van een eenvoudige cellulaire fractionering voor de subcellular scheiding van cytoplasmatische en nucleaire eiwitten in menselijke verse en diepgevroren intestinale biopsieën.

Subcellular fractionering van verse en diepgevroren gastro-intestinale Specimens

The purpose of this protocol is to fractionate human intestinal tissue obtained by endoscopy into nuclear and cytoplasmic compartments for the ...

Het doel van het volgende protocol is om subcellulaire fracties te genereren uit bevroren of verse gastro-intestinale specimens. Eiwitten zijn betrokken bij bijna al uw biologische functies binnen een cel. In welke variant ze ook zijn, de extractie van een locatie kan leiden tot een pathogene situatie.Sommige studies zullen gebruikmaken van de beoordeling van eiwitlokalisatie of zullen een eiwit uit een specifiek celcompartiment moeten binnendringen. Daarom is de reproduceerbare fractie van intacte eiwitten in dit opzicht belangrijk. Intestinale biopsiemonsters zijn recent verkrijgbaar tijdens endoscopieprocedures en kunnen effectief worden gebruikt voor eiwitkwantificering of immunoprecipitatiestudies.Klinische intestinale monsters zijn een belangrijke bron voor de effectieve identificatie van weefsel- en ziektespecifieke eiwitten. De naam van deze methode is om menselijk darmweefsel verkregen door endoscopie te fractieseren in nucleaire en cytoplasmatische compartimenten voor de lokalisatieanalyse van een specifiek eiwit of eiwitcomplexen. Deze methode dient voor de fractie van beide.Eerst gebeurt onze bevroren darmbiose. Voor de bevroren weefselprocedure, bevries monsters onmiddellijk na extractie en bewaar in vloeibare stikstof tot gebruik. Het is belangrijk om het monster bevroren te houden totdat de koude homogenisatiebuffer is toegevoegd.Voor verse monsters, breng de biopsie over naar een microbuisje van 1,5 ml en houd het op ijs totdat de procedure is gestart. Bevroren weefselmonsters zijn meestal bevestigd aan de wand van de cryobuis, het weefsel kan worden losgemaakt met behulp van een steriele pipettip voordat het wordt overgebracht naar een conische microbuis van 1,5 ml. Voeg 200 ml buffer een toe, aangevuld met DDT en fosfatase en proteaseremmers, aan de microbuis met het monster.Homogeniseer het monster met een vat totdat het weefsel volledig is vernietigd en houd het op ijs. Bewaar het monster 10 minuten op ijs. Voeg 10 ml 1 procent detergent toe aan elk monster tot een uiteindelijke concentratie van 0,05 procent om het celmembraan te verstoren.Bewaar op ijs gedurende vijf minuten. Kortjes vortex en centrifugeer gedurende twee minuten bij 400 g bij 4 graden. Verwijder het supernatant dat de cytoplasmatische eiwitfractie bevat en breng het over in een schone buis.Gooi het pellet niet weg. Resuspendeer het pellet in 200 ml buffer twee aangevuld met DDT en fosfatase en proteaseremmers. Centrifugeer gedurende 2 minuten bij 400 g.Gooi het supernatant weg en herhaal de wasprocedure nog twee keer. Na de derde was, resuspendeer het pellet in 100 ml buffer twee. Schud krachtig gedurende 30 minuten bij 4 graden.Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 graden op de hoogste snelheid. Breng het supernatant met de nucleaire eiwitfractie over in een schone buis. Cytoplasmatische en nucleaire fracties zijn nu klaar voor kwantificering en downstream experimenten.Het darmmucosa is rijk aan verschillende proteasen en daarom moet de eiwitafbraak worden gecontroleerd tijdens extractie om eiwitafbraak te minimaliseren, moeten meerdere proteaseremmers worden opgenomen in de eiwitextractiebuffers. Bovendien moeten de extracten worden gebruikt voor aanvullende assays. Het is essentieel om eiwitdenaturatie of proteolyse te voorkomen.Omdat dit een verlies van eiwitactiviteit veroorzaakt. Als gevolg van de cel-cel en cel-matrix contacten die aanwezig zijn in weefsels, moeten sommige wijzigingen worden geïmplementeerd in de eiwitextractieprotocollen die routinematig worden gebruikt met celculturen. Scheiding van de cellen van de transcellulaire matrix zonder de eiwitkwaliteit te beïnvloeden, is een kritische factor voor de efficiënte isolatie van darmweefselproteïnen.Links geeft de tabel de eiwitconcentraties weer van elk van de fracties van de verse en bevroren 2 ml biopsiemonsters. Concentraties worden getoond in microgram per microliter. In dit experiment werden een vers en een bevroren monster gelijktijdig gefracieerd volgens het protocol.En een Western blot werd uitgevoerd met behulp van 20 mg van elk monster. Om de zuiverheid van de fracties te controleren, werden HSP90 en Tubuline gebruikt als cytoplasmatische controles en HDAC1 en H3 als nucleaire controles. Zoals kan worden waargenomen, zijn HSP90 en Tubuline voornamelijk gelokaliseerd in het cytoplasma en HDAC1 en H3 in de kern met zeer resterende vermenging tussen de twee fracties.Om te zien of het protocol de celdood beïnvloedt, hebben we ook CASP3 gedetecteerd. Beide monsters vertonen een zeer minimale kleuring voor CASP3, wat bevestigt dat de procedure de celdoodroute niet beïnvloedt, zelfs niet na het flash-invriezen van de biopsies. De bevroren monsters die in dit experiment werden gebruikt, kwamen van een persoon met een inflammatoire darmaandoening en zoals verwacht, verschijnt pSTAT1 in het cytoplasma van dit monster, wat bevestigt dat de eiwitmodificaties na fractie worden gehandhaafd en dus kunnen worden gebruikt voor downstream functionele analyse.Reproduceerbaarheid van de resultaten in bevroren biopsies wordt getoond in deze figuur. Fracties zijn schoon met minimale menging van compartiment-eiwitten. Verse en bevroren biopsies kunnen gelijkelijk worden gebruikt in deze protocollen, met bevroren biopsies die schone en reproduceerbare resultaten geven zoals te zien is in figuur 1 en 2.Het protocol dat hier wordt beschreven is ontworpen om de mogelijke eiwitfracties te genereren. Echter, enige intrinsieke variabiliteit binnen het monster, inclusief de grootte en status van het weefsel, kan leiden tot afwijkingen in de eiwitbedragen en de verdelingsbedragen in de fracties.

subcellular-fractionation-from-fresh-frozen-gastrointestinal

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In situ subcellulaire fractionatie van zoogdiercellen op microscoop dekglaasjes kan de visualisatie van eiwit lokalisatie.

In situ subcellulaire fractionering van het aanklevende en niet-klevende zoogdiercellen

This video describes the protocol to isolate single-nuclei from fresh frozen glioma tissue. The isolated single-nuclei can be used as specimens for sequencing techniques such as single-nuclei RNA (snRNA) sequencing and single-nuclei Assay for Transposase-Accessible Chromatin (snATAC) sequencing to obtain deeper insights into inter- and intra-tumor heterogeneity observed in glioma of the central nervous tissues.

Isolation of Nuclei from Fresh Frozen Glioma Tissues: A Method to Obtain Intact Nuclei from Glioma Tumor Samples

Hier beschrijven we een eenvoudige methode voor het isoleren van ruimtelijk verschillende muis colonische epitheliale oppervlaktecellen van de onderliggende crypt-basiscellen.

Cryosectioning Methode voor Microdissection van Murine colonslijmvlies

Hier wordt een protocol gepresenteerd om primaire fibroblast/myofibroblast (MF) culturen te isoleren en te vestigen uit bevroren maag-, dunne darm- en colonweefsel, waardoor cellen met een MF-fenotype worden verkregen. Deze cellen expresseren CD90, α-SMA en vimentin. MF's kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan functionele assays, inclusief enzymatische activiteit en cytokineproductie.

Isolatie van CD 90+ Fibroblast / Myofibroblasten van Human Frozen Maag Monsters

Het doel van dit protocol is het verkrijgen van hoge-integriteit RNA monsters van darmen ganglia geïsoleerd van nietgefixeerde, vers gereseceerd menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM). Dit protocol omvat voorbereiding van monsters van menselijke intestinale weefsels, cryosectioning, ethanolbevattend kleuring en uitdroging, LCM, flash-bevroren en RNA extractie.

Optimalisatie van Laser-Capture Microdissection voor de isolatie van darmen Ganglia van menselijk weefsel vers bevroren

Hier presenteren we een protocol om te isoleren van het plasmamembraan, cytoplasma en mitochondria van U937 cellen zonder het gebruik van high-speed centrifugeren. Deze techniek kan worden gebruikt voor het zuiveren van subcellular breuken voor latere onderzoek van eiwit lokalisatie via immunoblotting.

Cel fractionering van U937 cellen in het ontbreken van snelle centrifugeren

Dit protocol beschrijft verschillende procedures voor het voorbereiden van hoogwaardige bevroren weefselmonsters op het moment van obductie voor gebruik in de komeettest om DNA-schade te beoordelen: 1) gehakt weefsel, 2) geschraapte epitheelcellen uit het maag-darmkanaal en 3) in blokjes gelopen weefsel monsters, die homogenisatie vereisen met behulp van een weefselhakkende apparaat.

Gebruik van bevroren weefsel in de Komeet Assay voor de evaluatie van DNA-schade

Intratumorale heterogeniteit is een inherent kenmerk van tumoren, waaronder gliomen. We ontwikkelden een eenvoudig en efficiënt protocol dat een combinatie van buffers en gradiëntcentrifugatie gebruikt om enkele kernen te isoleren uit vers bevroren glioomweefsels voor single nucleus RNA en ATAC-sequencingstudies.

Kernisolatie van vers bevroren hersentumoren voor single-nucleus RNA-seq en ATAC-seq

Dit fractioneringsprotocol stelt onderzoekers in staat om cytoplasmatische, nucleaire, mitochondriale en membraaneiwitten uit zoogdiercellen te isoleren. De laatste twee subcellulaire fracties worden verder gezuiverd via isopycnic dichtheidsgradiënt.

Celfractionering van U937-cellen door isopycnic density gradient purification

Het protocol biedt een betrouwbare en geoptimaliseerde benadering voor de isolatie van kernen uit solide tumormonsters voor multioomsequencing met behulp van het 10x Genomics-platform, inclusief aanbevelingen voor weefseldissociatieomstandigheden, cryopreservatie van eencellige suspensies en beoordeling van geïsoleerde kernen.

Geoptimaliseerde kernisolatie van verse en diepgevroren solide tumormonsters voor multioomsequencing

We beschrijven een muizenmodel van postoperatieve ileus gegenereerd via darmmanipulatie. De gastro-intestinale transitfunctie, pathologische veranderingen en activering van immuuncellen werden 24 uur na de operatie beoordeeld.

Postoperatief Ileus muizenmodel

Leer subcellulaire fractie-analyse van verse en diepgevroren gastro-intestinale biopten. Deze methode scheidt cytoplasmatische en nucleaire eiwitten voor lokalisatiestudies en functionele analyse.

Subcellular fractionering van verse en diepgevroren gastro-intestinale Specimens

Meer video's verkennen