Name: Genetische analyse van erfelijke Transthyretin Ala97Ser gerelateerde amyloidose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Leer een betrouwbaar protocol voor het detecteren van de Ala97Ser-mutatie in erfelijke transthyretine-amyloidose met PCR en agarose gelelektroforese. Deze methode is geschikt voor routinematig klinisch gebruik.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij willen Miss Shin-Fun Wu bedanken voor haar hulp bij de experimenten. Deze studie werd gesteund door een subsidie van de Chang Gung medische Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) en IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.

Het testen uitgevoerd in het laboratorium werd uitgevoerd overeenkomstig de eisen van de klinische laboratorium verbetering amendementen (CLIA) van 1988, de verordeningen die zijn goedgekeurd door de institutionele Review Board van Chang Gung Memorial Hospital en Universiteit (licentie nr. 100 - 4470A3 en 104-2462A3). Geïnformeerde toestemming was verkregen bij alle patiënten.
1. Blood Specimen Collection
<ol><li>Volbloed in verkrijgbare EDTA-behandelde buizen verzamelen. Meng voorzichtig en bewaren van bloedmonster bij 4 ° C tot verwerking.</li>
</ol>2. DNA-extractie uit perifeer bloed
Gebruik van een DNA-extractie-Kit voor de genomic DNA-extractie (Zie Tabel van materialen).
<ol><li>Voeg 10 mL van oplossing 1 aan het 4,0 mL bloedmonster. Incubeer het monster op het ijs gedurende 10 minuten.</li>
	<li>Centrifugeer het monster bij 2.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Verwijder en zorgvuldig wordt weggeworpen. Resuspendeer de pellet in 3 mL oplossing 1.</li>
	<li>Centrifugeer het monster bij 2.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C weer en weggeworpen. Resuspendeer de pellet in 3 mL oplossing 2.</li>
	<li>Voeg 10 µL van pronase-stockoplossing (225 mg/mL) om een eindconcentratie van 100 µg/mL en meng goed. Incubeer bij 37 ° C's nachts.</li>
	<li>Chill de buis op ijs voor 10 min. toevoegen 0.8 mL van oplossing 3 aan het monster en omkeren van 3 - 5 keer. Leg het monster op het ijs gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Centrifugeer het monster bij 3000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C. Zorgvuldig overbrengen in het supernatant een tube van 15 mL steriele conische centrifuge.</li>
	<li>Voeg 6 µL van RNase stockoplossing (10 mg/mL) om een eindconcentratie van 20 µg/mL. Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten.</li>
	<li>Toevoegen van 2.5 mL isopropyl alcohol en meng grondig door voorzichtig omkeren van meerdere keren te precipiteren DNA (strengen van witte, flocculator materiaal zal vormen). Met behulp van een pipet grote boring, overbrengen in de neerslaande DNA een nieuwe 1,5 mL centrifugebuis.</li>
	<li>Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 3 min bij 4 ° C. Zorgvuldig vloeistof wordt weggeworpen. Wassen DNA pellet door 500 µL van 70% ethanol toe te voegen.</li>
	<li>Centrifugeer bij 12.000 x g voor 1 min en weggeworpen. Lucht drogen DNA pellet bij kamertemperatuur. Voeg 100 µL van ddH2O en Incubeer bij 65 ° C gedurende 15 min naar resuspendeer DNA.</li>
</ol>3. genomic DNA kwantificering
Gebruik van een spectrofotometer (Zie Tabel van materialen) om te ontdekken de kwantiteit en kwaliteit van de genomic DNA.
<ol><li>Log in op de computer waarop de spectrofotometer machine aangesloten. De software niet openen.</li>
	<li>Initialiseer de spectrofotometer machine:<ol>
<li>Klik "Nucleic zuur" op de spectrofotometer software.</li>
		<li>Reinig het voetstuk met een disposable papier wipe en gezuiverd water.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Leeg de spectrofotometer:<ol>
<li>Laden 2 µL van het gezuiverde water op het voetstuk.</li>
		<li>Verlaag de bovenarm van de spectrofotometer valt en klikt u op 'Leeg' te kalibreren, hoeft.</li>
		<li>Wanneer het heeft gedaan, til de bovenarm en het voetstuk met een doekje droog.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het meten van de steekproef:<ol>
<li>Klik op "DNA-50" op monster Type.</li>
		<li>Laden 2 µL van DNA-monster op het voetstuk.</li>
		<li>Verlaag de bovenarm en klik op "Maatregel" om de verhouding A260/A280 en de concentratie van het monster te meten.</li>
		<li>Reinig de sokkel tussen elke uitvoering met een doekje en gezuiverd water.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Klik op de "Print Screen" om de gegevens te verzamelen.</li>
</ol>4. Genetische analyses van mutaties
Versterken van doelDNA met de PCR-4. Uitvoeren van PCR in een reactie van 25 µL mengsel met behulp van een Polymerase van DNA kit (Zie Tabel van materialen). Tabel 1 toont de TTR-gene intronic inleidingen.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>gen</td>
			<td>Primer volgorde</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon1</td>
			<td>F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon2</td>
			<td>F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon3</td>
			<td>F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exon4</td>
			<td>F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1. TTR gene intronic inleidingen. (NCBI referentie volgorde: NC_000018.10)
<ol><li>De reagentia in tabel 2 toevoegen aan een PCR-tube van 0,2 mL.</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Onderdelen</td>
			<td>Volume (µL)</td>
			<td>Eindconcentratie</td>
		</tr>
<tr>
<td>10 x Buffer</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1 x</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>1.5</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>360 GC Enhancer</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>360 DNA-Polymerase</td>
			<td>0.2</td>
			<td>2 U/reactie</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTP Mix (elke 25 mM)</td>
			<td>2</td>
			<td>elke 2 mM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer F (10 µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.4 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer R (10 µM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0.4 ΜM</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA (100 ng)</td>
			<td>2</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>PCR-grade water</td>
			<td>13,8</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Totaal Volume</td>
			<td>25</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 2. PCR reactie voorwaarden.
<ol start="2"><li>Meng voorzichtig en kort centrifugeren op een benchtop centrifuge voor het verzamelen van alle onderdelen naar de onderkant van de buis. Plaats de buis in een thermocycler.</li>
	<li>PCR voor 30 cycli uitvoeren. Elke cyclus bestaat uit een denaturatie stap voor 30 bij 94 ° C, primer gloeien voor 30 s s op 58 ° C, en polymerase uitbreiding voor 45 s bij 72 ° C (Zie tabel 3).</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Stap</td>
			<td>Temperatuur (° C)</td>
			<td>Tijd</td>
			<td>cyclus</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eerste denaturatie</td>
			<td>95</td>
			<td>5 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA denaturatie stap</td>
			<td>94</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 cycli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer onthardende stap</td>
			<td>58</td>
			<td>30 s</td>
			<td>30 cycli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Polymerase extensie stap</td>
			<td>72</td>
			<td>45 s</td>
			<td>30 cycli</td>
		</tr>
<tr>
<td>Post rek stap</td>
			<td>72</td>
			<td>10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Einde van PCR fietsen</td>
			<td>4</td>
			<td>Onbepaalde tijd</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 3. Voorwaarden voor het sturen van PCR producten te fietsen.
<ol start="4"><li>Het valideren van het PCR-product door het visualiseren van de Elektroforese van het gel:<ol>
<li>Bereiden een 1,2% agarose gel:<ol>
<li>1.2 g agarose poeder mengen met 100 mL 0,5 x TBE in een maatkolf van microwavable. Magnetron gedurende 2 minuten totdat de agarose volledig is opgelost. Afkoelen van het agarose mengsel tot 55 ° C.</li>
			<li>Voeg 2 µL van een ethidium bromide oplossing (10 mg/mL) toe aan het mengsel agarose en meng voorzichtig. Giet het mengsel agarose in een lade gel ongeveer 5-7 mm, voeg dan de comb(s) op zijn plaats. Laat het stollen (minstens 30 min) en verwijder voorzichtig comb(s).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Laden van monsters en het uitvoeren van een agarose gel:<ol>
<li>Gel en lade in de elektroforese cel plaatsen. De elektroforese cel vullen met 0,5 x TBE totdat de gel is gedekt.</li>
			<li>Zorgvuldig laden 2 µL van een 100 bp DNA ladder (Zie Tabel van materialen) in de één rijstrook van de gel als moleculaire grootte markering. Laden kleurstof/monster mengsel (5 µL van het PCR productmix met 1 µL 6 x laden kleurstof) in de extra rijstroken.</li>
			<li>Schakel de voeding. Stel de gel gedurende 25 minuten bij 100 V.</li>
			<li>Het verwijderen van de gel uit de elektroforese-cel. Visualiseren van de DNA-fragmenten onder UV-licht in een imaging systeem.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. DNA sequencing
<ol><li>Zuiveren van PCR producten met behulp van een commerciële kit en volgnummer commercieel of met een automatische sequencer (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Indienen nucleotidesequenties naar de NCBI BLAST server te vergelijken van de nucleotide-query naar de nucleotide databases10. Nadat de resultaten worden weergegeven, reeks aanpassingen uitvoeren en identificeren van de verwachte mutatie.</li>
</ol>

<ol><li>Planté-Bordeneuve, V., Said, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22094129">Familial amyloid polyneuropathy.</a> The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).</li>
<li>Planté-Bordeneuve, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+treatment+of+transthyretin+familial+amyloid+polyneuropathy+with+tafamidis%3A+a+clinical+and+neurophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study.</a> Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).</li>
<li>Nichols, W. C., Benson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+amyloidosis%3A+detection+of+variant+prealbumin+genes+by+restriction+enzyme+analysis+of+amplified+genomic+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences.</a> Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Hsu, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+expressions+of+hereditary+Transthyretin+Ala97Ser+related+Amyloidosis+%28ATTR%29+in+Taiwanese%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese.</a> BMC Neurology. 17 (1), 178(2017).</li>
<li>Barroso, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+tafamidis+for+the+treatment+of+hereditary+transthyretin+amyloid+polyneuropathy%3A+results+up+to+6+years%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years.</a> Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).</li>
<li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+profile+and+differential+diagnosis+of+hereditary+transthyretin-related+amyloidosis+with+exclusively+cardiac+phenotype%3A+an+Italian+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective.</a> European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).</li>
<li>Mariani, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype-phenotype+correlation+and+course+of+transthyretin+familial+amyloid+polyneuropathies+in+France%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France.</a> Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).</li>
<li>Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+denaturation+energetics%3A+A+major+determinant+in+amyloid+disease+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, suppl 4 16427-16432 (2002).</li>
<li>Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCBI+BLAST%3A+a+better+web+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NCBI BLAST: a better web interface.</a> Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 5-9 (2008).</li>
<li>Fox, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+for+the+detection+of+actionable+mutations+in+solid+and+liquid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li>
<li>Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+three+transthyretin+gene+mutations+in+familial+amyloidotic+polyneuropathy+by+analysis+of+DNA+extracted+from+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues.</a> Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).</li>
<li>Buckingham, L., Flaws, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuckingham%2C+L+%22Molecular+diagnostics%3A+Fundamentals%2C+methods%2C+and+clinical+applications%22">Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications</a>. , F.A. Davis Co. Philadelphia. (2012).</li>
<li>Tan, S. C., Yiap, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%2C+RNA%2C+and+Protein+Extraction%3A+The+Past+and+The+Present%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).</li>
<li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+cardiac+amyloidoses%3A+disease+profiles+and+clinical+courses+of+the+3+main+types%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types.</a> Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).</li>
<li>Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25311231">Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis.</a> Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).</li>
<li>Vrana, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+diagnosis+and+typing+of+systemic+amyloidosis+in+subcutaneous+fat+aspirates+by+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics.</a> Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).</li>
<li>Nakamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+transthyretin+variant+%28Ile49%29+in+familial+amyloidotic+polyneuropathy+using+electrospray+ionization+mass+spectrometry+and+nonisotopic+RNase+cleavage+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Heredity%22%5BJournal%5D)">Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay.</a> Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).</li>
<li>Ueda, M., Ando, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25228988">Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy.</a> Translational Neurodegeneration. 3, 19(2014).</li>
<li>Brown, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+testing+improves+identification+of+transthyretin+amyloid+%28ATTR%29+subtype+in+cardiac+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis.</a> Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).</li>
<li>Tasaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+wild-type+and+mutated+transthyretins%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).</li>
<li>Plante-Bordeneuve, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17698792">Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP).</a> Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).</li>
<li>Hsu, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective%2C+observational+study+of+patients+with+uncommon+distal+symmetric+painful+small-fiber+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy.</a> PLoS ONE. 12 (9), 0183948(2017).</li>
<li>Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall'Osso, D., Rapezzi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+and+phenotypic+correlation+in+an+Italian+population+of+hereditary+amyloidosis+TTR-related+%28HA-TTR%29%3A+Clinical+and+neurophysiological+aids+to+diagnosis+and+some+reflections+on+misdiagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis.</a> Amyloid. 19, suppl 1 58-60 (2012).</li>
<li>Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+mutation%2C+two+distinct+disease+variants%3A+Unravelling+the+impact+of+transthyretin+amyloid+fibril+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition.</a> Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).</li>
<li>Vilà-Rico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+post-translational+modifications+in+human+serum+transthyretin+associated+with+familial+amyloidotic+polyneuropathy+by+targeted+LC-MS+and+intact+protein+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS.</a> Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Er zijn twee belangrijke stappen in het protocol. Eerst, om voldoende aantal witte bloedcellen hebben een hemodiluted monster moet vermeden11. Ten tweede, het gebruik van passende PCR inleidingen is fundamenteel voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten12. We gebruikten het gereedschap van de web Primer-BLAST te ontwerpen de inleidingen4,13; een minimum van 40 basenparen aan weerskanten van de vier TTR exons mo...

Transthyretin (TTR) amyloidose (ATTR) is de meest voorkomende vorm van erfelijke systemische amyloidose1, en kan worden veroorzaakt door een autosomaal dominant erfelijke mutatie in het gen transthyretin (TTR)2. TTR mutaties destabiliseren het tetramere eiwitstructuur en leiden tot haar dissociatie in monomeren die herassembleert in amyloïde fibrillen2. Meer dan 100 amyloidogenic TTR mutaties zijn gerapporteerde wereldwijd1. Genetische analyses met polymerase kettingreactie (PCR) methoden bevestigen de aanwezigheid van TTR punt mutatie en voordelen, waaronder het vermijden van de behandeling van radioactief gelabelde sondes in vergelijking met de zuidelijke vlek3hebben. PCR is een snelle, eenvoudige, goedkope en betrouwbare techniek die is toegepast op tal van gebieden in moderne wetenschappen4.
De vroegtijdige diagnose van deze progressieve en dodelijke ziekte is uitdagend gegeven haar fenotypische heterogeniteit. Met toenemende aandacht en bredere erkenning op de vroege uitingen van ATTR evenals de opkomende behandelingen5, zijn passende diagnostische studies, met inbegrip van TTR genetische test daarom kritisch fundamenteel voor het verbeteren van de prognose. Bovendien verschillende mutaties zijn geassocieerd met verschillende doordringendheid van de Trek, leeftijd van intreden, patronen van progressie, ernst van de ziekte, mediane overleving, werkzaamheid of lever transplantatie, TTR stabilisatoren2,6, en variabele graden van neurologische en cardiologische betrokkenheid, die grote gevolgen voor genetische counseling7,8,9 hebben. Bovendien, een zeer nauwkeurige genetische test is het enige hulpmiddel dat de twee verschillende soorten ATTR onderscheidt: erfelijke (mutant) en wild-type (niet-mutant vorm, seniele systemische amyloidose, SSA)7. Het is noodzakelijk om te bevestigen de soorten ATTR, omdat de therapieën2sterk uiteenlopen. Daarom is er een toenemende noodzaak om te beschrijven de stapsgewijze protocol van de TTR genetische test.
De moleculaire benadering om op te sporen van de mutatie wordt geïllustreerd met behulp van Ala97Ser, de meest voorkomende endemisch mutatie in Taiwan, als voorbeeld. Wijzigingen in de DNA-extractie stap verminderen het bedrag van de drie oplossingen gebruikt en levert van een voldoende hoeveelheid van DNA. In dit protocol, alle vier TTR exons werden geanalyseerd, terwijl de regio's, met inbegrip van 5' stroomopwaarts 3' stroomafwaarts, initiatiefnemers, introns, en niet-vertaalde regio's (UTR) waren niet gesequentieerd.

<table><tbody><tr><td>EDTA-behandelde buizen</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA-extractiekit</td><td>Stratagen</td><td>200600</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND2000 spectrofotometer&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Delicate Task Wipers</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td></td></tr><tr><td>AmpliTaq Gold 360 DNA-polymerasekit</td><td>Applied Biosystems</td><td>4398823</td><td></td></tr><tr><td>TTR-genintronische primers&nbsp;</td><td>Exon1</td><td>F: 5&rsquo;-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3&rsquo;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon1</td><td>R: 5&rsquo;-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3&rsquo;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon2</td><td>F: 5&rsquo;-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3&rsquo;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon2</td><td>R: 5&rsquo;-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3&rsquo;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon3</td><td>F: 5&rsquo;-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3&rsquo;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon3</td><td>R: 5&rsquo;-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3&rsquo;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon4</td><td>F: 5&rsquo;-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3&rsquo;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Exon4</td><td>R: 5&rsquo;-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3&rsquo;</td><td></td></tr><tr><td>thermocycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>elektroforesecel&nbsp;</td><td>ADVANCE</td><td>Mupid-2plus</td><td></td></tr><tr><td>DNA-ladder</td><td>Protech</td><td>PT-M1-100</td><td></td></tr><tr><td>kleurstof</td><td>BioLabs</td><td>B7021</td><td></td></tr><tr><td>AlphaImager EC</td><td>Alpha Innotech</td><td>AlphaImager EC</td><td></td></tr><tr><td>automatische sequencer&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>3730xl DNA Analyzer</td><td></td></tr></tbody></table>

genetische analyse van erfelijke transthyretin ala97ser gerelateerde amyloidose

Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis

Genetische tests is de meest betrouwbare test voor erfelijke transthyretin gerelateerde amyloidose en in de meeste gevallen van transthyretin Amyloïdose (ATTR) moet worden uitgevoerd. ATTR is een zeldzame maar fatale ziekte met heterogene fenotypen; de diagnose wordt daarom soms uitgesteld. Met de toenemende aandacht en bredere erkenning op vroege uitingen van ATTR evenals opkomende behandelingen, passende diagnostische studies, met inbegrip van de transthyretin (TTR) genetische testen, om te bevestigen de types en varianten van ATTR zijn daarom fundamentele ter verbetering van de prognose. Genetische analyses met polymerase kettingreactie (PCR) methoden bevestigen de aanwezigheid van TTR puntmutaties veel sneller en veiliger dan met conventionele methoden zoals zuidelijke vlek. Hierin tonen wij genetische bevestiging van de ATTR Ala97Ser mutatie, de meest voorkomende endemisch mutatie in Taiwan. Het protocol omvat vier hoofdstappen: het verzamelen van volbloed specimen, DNA-extractie, genetische analyse van alle vier TTR exons met PCR, en DNA sequencing.

Agarose gelelektroforese van twee patiënten en een gezonde individuele geopenbaarde bands van de verwachte omvang, met inbegrip van een 454 bp PCR product voor exon 4 van de TTR-gen (Figuur 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57743/57743fig1.jpg"> Figuur 1 . De Elektroforese van het gel beeltenis van PCR versterkt TTR gene....

Hier presenteren we een protocol ter bevestiging van de aanwezigheid van punt mutatie voor de diagnose van erfelijke transthyretin amyloidose, met behulp van Ala97Ser, de meest voorkomende endemisch mutatie in Taiwan, als voorbeeld.

Genetische analyse van erfelijke Transthyretin Ala97Ser gerelateerde amyloidose

Genetic testing is the most reliable test for hereditary transthyretin related amyloidosis and should be performed in most cases of transthyretin ...

Met toenemende aandacht voor vroege manifestaties van transthyretine-amyloïdose, evenals opkomende behandelingen, zijn geschikte studies om de typen en varianten van transthyretine-amyloïdose te bevestigen, fundamenteel voor het verbeteren van de prognose. Het grote voordeel van dit protocol is dat deze test haalbaar en gemakkelijk uit te voeren is in het klinische laboratorium. Om het protocol te starten, verkrijgt u een DNA-extractiekit, voegt u 10 milliliter oplossing één toe aan de eerder verkregen 4,0 milliliter bloedmonster en incubeert u het monster gedurende 10 minuten op ijs.Na incubatie centrifugeert u het monster 5 minuten bij 2000 G bij vier graden Celsius. Verwijder en gooi voorzichtig de supernatant. Hersuspendeer de pellet in drie milliliter oplossing één.Centrifugeer het monster opnieuw 5 minuten bij 2000 G bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant weg. Hersuspendeer de pellet in drie milliliter oplossing twee.Voeg vervolgens 10 microliters Pronase-stockoplossing toe om een ​​eindconcentratie van 100 microgram per milliliter te krijgen en meng de inhoud goed. Incubeer het DNA gedurende één nacht bij 37 graden Celsius. De volgende dag koelt u de buis gedurende 10 minuten op ijs.Voeg 0,8 milliliter oplossing drie toe aan het monster en draai het drie tot vijf keer om. Plaats vervolgens het monster gedurende vijf minuten op ijs. Centrifugeer het monster gedurende 15 minuten bij 3000 G bij vier graden Celsius.Breng de supernatant voorzichtig over in een steriele conische centrifugeerbuis van 15 milliliter en voeg zes microliters RNase-stockoplossing toe om een ​​eindconcentratie van 20 microgram per milliliter te verkrijgen. Incubeer het monster, voeg 2,5 milliliter isopropylalcohol toe aan de buis en draai de buis voorzichtig om om het DNA te bezinken, dat verschijnt als strengen van wit vlokkig materiaal. Breng met een grote boring pipetteerbuis het bezinksel over in een nieuwe centrifugeerbuis van 1,5 milliliter.Centrifugeer het bezinksel gedurende drie minuten bij 12.000 G bij vier graden Celsius. Gooi de supernatant voorzichtig weg. Was vervolgens het DNA-pellet door 500 microliter 70% ethanol toe te voegen.Centrifugeer het DNA gedurende een minuut bij 12.000 G en gooi de supernatant weg. Laat het DNA-pellet op kamertemperatuur drogen. Voeg 100 microliter DDH2O toe en incubeer het monster gedurende 15 minuten bij 65 graden Celsius om het DNA te hersuspenderen.Voer PCR uit in een reactiemengsel van 25 microliter met behulp van een DNA-polymerasekit. Voeg de reagentia toe aan een PCR-buis van 0,2 milliliter. Meng de inhoud voorzichtig en centrifugeer ze kort in een tafelcentrifuge.Plaats de buis in een thermische cycler. Voer de PCR gedurende 30 cycli uit met een denaturatiestap gedurende 30 seconden bij 94 graden Celsius, primer-inschakeling gedurende 30 seconden bij 58 graden Celsius en polymerase-extensie gedurende 45 seconden bij 72 graden Celsius. Bereid een 1,2% agarosegel voor door 1,2 gram agarosepoeder te mengen met 100 milliliter 0,5 XTBE in een magnetronbare kolf.Microgolf de oplossing gedurende twee minuten totdat de agarose volledig is opgelost. Koel de agarosemengsel af tot 55 graden Celsius. Voeg twee microliter ethidiumbromide-oplossing toe aan het agarosemengsel en meng voorzichtig.Giet het mengsel in een gellade tot ongeveer vijf tot zeven millimeter. Plaats vervolgens de kam. Laat de gel gedurende ten minste 30 minuten stollen.Nadat de gel is gestold, verwijdert u voorzichtig de kam. Plaats de gel en de lade in de elektroforesecel. Vul de elektroforesecel met 0,5 XTBE totdat de gel is bedekt.Laad voorzichtig twee microliter van een DNA-ladder van 100 basenparen in één spoor van de gel als moleculaire groottemarker. Laad de kleurstof en monstersamenstelling in de extra sporen. Schakel de stroomtoevoer in en laat de gel gedurende 25 minuten bij 100 volt draaien.Verwijder de gel uit de elektroforesecel. Visualiseer ten slotte de DNA-fragmenten onder UV-licht in een beeldvormingssysteem. Agarosegelelektroforese van twee patiënten en een gezonde persoon geeft banden van de verwachte groottes, waaronder een PCR-product van 454 basenparen voor exon vier van het TTR-gen.Sequentiechromatogrammen toonden een nucleotide T-substitutie voor G in exon vier van het TTR-gen, resulterend in een missense-mutatie en een alanine naar serine-substitutie op aminozuurpositie 97 bij twee patiënten. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de aanwezigheid van puntmutaties voor de diagnose van erfelijke transthyretine-amyloïdose kunt bevestigen.

genetic-analysis-hereditary-transthyretin-ala97ser-related

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

Met behulp van atoomkrachtmicroscopie in combinatie met biopanning-technologie hebben we een negatief en positief biopanning-systeem gemaakt om antilichamen te verkrijgen tegen ziektespecifieke eiwitvarianten die aanwezig zijn in elk biologisch materiaal, zelfs bij lage concentraties. We zijn erin geslaagd om antilichamen te verkrijgen voor TDP-43-eiwitvarianten die betrokken zijn bij Amyotrofe Laterale Sclerose.

Roman Atomic Force Microscopy Based Biopanning voor isolatie van morfologie specifieke reagentia tegen TDP-43 Varianten in Amyotrofische Lateraal Sclerose

Er wordt een reverse-genetics benadering gepresenteerd om genfamilies geassocieerd met menselijke ziekten te begrijpen, waarbij muis als modelsysteem wordt gebruikt, en het daaropvolgende muis fenotyperingsschema wordt beschreven. Omdat muizen met een defect in een gen van belang, HtrA2, Parkinson-symptomen vertoonden, is het fenotyperingsregime gericht op het identificeren van neurologische defecten.

Een Fenotypering regime voor genetisch gemodificeerde muizen gebruikt om genen die betrokken zijn in Human Ziekten van Aging Study

Dit protocol beschrijft een methode om de nucleocytoplasmatische transportsnelheid binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen nauwkeurig te meten door de real-time verandering in de nucleaire invoer van een NLS-NES-GFP eiwit te kwantificeren.

Assay voor het meten van nucleocytoplasmisch transport in realtime binnen motor neuronachtige NSC-34 cellen

Amyloïde afzetting is een kenmerk van verschillende ziekten en treft vele verschillende organen. Deze paper beschrijft de toepassing van de fluorescentie van de verlichte geconjugeerd oligothiophene in combinatie met fluorescentie microscopie technieken kleuring. Deze kleuringstechniek vertegenwoordigt een krachtige tool voor de detectie en verkenning van eiwit-aggregaten in zowel klinische en wetenschappelijke opstellingen.

Imaging amyloïde weefsels gekleurd met verlichte geconjugeerd Oligothiophenes door hyperspectrale Confocal Microscopie en fluorescentie levensduur Imaging

Gerichte volgende-generatie rangschikken is een tijd - en kostenbesparende aanpak die wordt steeds populairder in zowel ziekteonderzoek en klinische diagnostiek. Het protocol beschreven hier presenteert de complexe workflow vereist voor het rangschikken en het proces van de bioinformatica gebruikt ter identificatie van de genetische varianten die aan de ziekte bijdragen.

Next-generation Sequencing en Bioinformatics pijpleiding om te evalueren van genetische determinanten van constitutionele ziekte gericht

In de huidige studie, beschrijven we een methodologie voor het analyseren van het genotype van de C924T. Het protocol bestaat uit drie fasen: DNA-extractie, versterking van de Kettingreactie van de polymerase (PCR) en een analyse van de beperking fragment length polymorphism (RFLP) op agarose gel.

Een methode om te studeren het C924T polymorfisme van het Thromboxaan A2-Receptor gen

Aminozuur-niveau signal-to-noise analyse bepaalt de prevalentie van genetische variatie op de positie van een bepaald aminozuur genormaliseerd naar de genetische variatie van de achtergrond van een bepaalde populatie. Dit zorgt voor de identificatie van de variant "hotspots" binnen een eiwit-reeks (signaal) die stijgt tot boven de frequentie van de zeldzame varianten gevonden in een populatie (lawaai).

Bepaling van de waarschijnlijkheid van Variant pathogeniteit met behulp van aminozuur-niveau Signal-to-Noise analyse van genetische variatie

Op bloed gebaseerde biomarkers voor neurodegeneratieve ziekten zijn essentieel voor de uitvoering van grootschalige klinische studies. Een betrouwbare en gevalideerde bloedtest moet een klein monstervolume vereisen en een minder invasieve bemonsteringsmethode zijn, betaalbaar en reproduceerbaar. Dit document toont aan dat hoog-doorvoer capillaire elektroforese immunoassay voldoet aan criteria voor mogelijke biomarker ontwikkeling.

Gebruik van capillaire elektrofoforese immunoassay om te zoeken naar potentiële biomarkers van amyotrofische laterale sclerose in menselijke bloedplaatjes

Op basis van de familiale erfelijke cardiomyopathiefamilie die in ons klinische werk werd aangetroffen, creëerden we een C57BL / 6N-muismodel met een puntmutatie (G823E) bij de MYH7-locus van de muis via CRISPR / Cas9-gemedieerde genoomtechnologie om deze mutatie te verifiëren.

Onderzoek naar de pathogenese van MYH7-mutatie Gly823Glu bij familiaire hypertrofische cardiomyopathie met behulp van een muismodel

Hier presenteren we een protocol om de nieuwste versie van de Sequence Alignment to Predict Across Species Susceptibility (SeqAPASS) -tool van het Amerikaanse Environmental Protection Agency te gebruiken. Dit protocol demonstreert de toepassing van de online tool om snel eiwitbehoud te analyseren en aanpasbare en gemakkelijk interpreteerbare voorspellingen van chemische gevoeligheid tussen soorten te bieden.

Demonstratie van de sequentie-uitlijning om te voorspellen tussen soorten gevoeligheidsinstrument voor snelle beoordeling van eiwitbehoud

Hier beschrijven we een gistsysteem dat menselijke γ-secretase reconstrueert. Dit systeem maakt het mogelijk om mutaties die de activiteit beïnvloeden te identificeren en te bestuderen en om γ-secretaseremmers (GSI's) te screenen. Door gebruik te maken van het functieverlies van familiale mutanten voor de ziekte van Alzheimer, is het mogelijk om te screenen op γ-secretasemodulatoren (GSM's).

Saccharomyces cerevisiae Modellen van de ziekte van Alzheimer om genen, mutaties en chemicaliën te screenen die de productie van amyloïde bèta beïnvloeden door γ-secretase

Leer een betrouwbaar protocol voor het detecteren van de Ala97Ser-mutatie in erfelijke transthyretine-amyloidose met PCR en agarose gelelektroforese. Deze methode is geschikt voor routinematig klinisch gebruik.

Genetische analyse van erfelijke Transthyretin Ala97Ser gerelateerde amyloidose

Meer video's verkennen