Name: CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-18T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Leer CRISPR/Cas9-genoombewerking voor voorwaardelijke knockdown-mutanten van de menselijke malariaparasiet Plasmodium falciparum. Deze methode onthult eiwitfunctie en verbetert malariabestrijding.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Muthugapatti Kandasamy bij de Universiteit van Georgia (UGA) Biomedische microscopie kern voor technische bijstand en Jose-Juan Lopez-Rubio voor het delen van de pUF1-Cas9 en pL6 plasmiden. Dit werk werd gesteund door bogen stichting awards te D.W.C. en te H.M.K., UGA opstarten middelen V.M., subsidies uit de maart van dubbeltjes Stichting (Basil O'Connor Starter geleerde Research Award) V.M. en ons National Institutes of Health grants (R00AI099156 en R01AI130139) naar V.M. en (T32AI060546) naar H.M.K.

<ol><li>World Health Organization. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22World+Malaria+Report%22">World Malaria Report</a>. , World Health Organization. Geneva. (2017).</li>
<li>Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathogenic+basis+of+malaria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The pathogenic basis of malaria.</a> Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).</li>
<li>Florentin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PfClpC+Is+an+Essential+Clp+Chaperone+Required+for+Plastid+Integrity+and+Clp+Protease+Stability+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum.</a> Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).</li>
<li>Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+heat+shock+protein+110+stabilizes+the+asparagine+repeat-rich+parasite+proteome+during+malarial+fevers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers.</a> Nature Communications. 3, 1310(2012).</li>
<li>Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asparagine+repeat+function+in+a+Plasmodium+falciparum+protein+assessed+via+a+regulatable+fluorescent+affinity+tag%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+the+USA%22%5BJournal%5D)">Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).</li>
<li>Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEX+component+HSP101+mediates+export+of+diverse+malaria+effectors+into+host+erythrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes.</a> Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).</li>
<li>Ghorbal, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+in+the+human+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum+using+the+CRISPR-Cas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).</li>
<li>Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-Cas9-mediated+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum.</a> Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).</li>
<li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096(2014).</li>
<li>Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+in+Genome+Editing+and+Beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).</li>
<li>Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigenic+variation+and+the+generation+of+diversity+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites.</a> Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).</li>
<li>Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Repair+Mechanisms+and+Their+Biological+Roles+in+the+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).</li>
<li>Cobb, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Exported+Chaperone+PfHsp70x+Is+Dispensable+for+the+Plasmodium+falciparum+Intraerythrocytic+Life+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle.</a> mSphere. 2 (5), (2017).</li>
<li>Prommana, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+knockdown+of+Plasmodium+gene+expression+using+the+glmS+ribozyme%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme.</a> Public Library of Science One. 8 (8), e73783(2013).</li>
<li>Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+RNA-protein+modules+integrated+with+native+translation+mechanisms+to+control+gene+expression+in+malaria+parasites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites.</a> Nature Communications. 7, 10727(2016).</li>
<li>Li, M. Z., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+homologous+recombination+in+vitro+to+generate+recombinant+DNA+via+SLIC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC.</a> Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).</li>
<li>Drew, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+food+vacuole+plasmepsins+are+activated+by+falcipains%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).</li>
<li>Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -H., Su, X. -Z., Wellems, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfection+of+Plasmodium+falciparum+within+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).</li>
<li>Janse, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+efficiency+transfection+of+Plasmodium+berghei+facilitates+novel+selection+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Biochemical+Parasitology%22%5BJournal%5D)">High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures.</a> Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).</li>
<li>Counihan, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodium+falciparum+parasites+deploy+RhopH2+into+the+host+erythrocyte+to+obtain+nutrients%2C+grow+and+replicate%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate.</a> eLife. 6, (2017).</li>
<li>Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trafficking+of+plasmepsin+II+to+the+food+vacuole+of+the+malaria+parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum.</a> Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v2%3A+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Resesarch%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).</li>
<li>Peng, D., Tarleton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EuPaGDT%3A+a+web+tool+tailored+to+design+CRISPR+guide+RNAs+for+eukaryotic+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Genomes%22%5BJournal%5D)">EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens.</a> Microbial Genomes. 1 (4), e000033(2015).</li>
<li>Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Gene+Disruption+in+Diverse+Strains+of+Toxoplasma+gondii+Using+CRISPR%2FCAS9%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9.</a> mBio. 5 (3), (2014).</li>
<li>Janssen, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+modification+and+gene+knock+out+in+the+human-infective+parasite+Trichomonas+vaginalis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis.</a> Scientific Reports. 8 (1), 270(2018).</li>
<li>Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chaperonin+TRiC+forms+an+oligomeric+complex+in+the+malaria+parasite+cytosol%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol.</a> Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).</li>
<li>Brancucci, N. M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophosphatidylcholine+Regulates+Sexual+Stage+Differentiation+in+the+Human+Malaria+Parasite+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum.</a> Cell. , (2017).</li>
<li>Ng, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9-modified+pfmdr1+protects+Plasmodium+falciparum+asexual+blood+stages+and+gametocytes+against+a+class+of+piperazine-containing+compounds+but+potentiates+artemisinin-based+combination+therapy+partner+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs.</a> Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).</li>
<li>Lim, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UDP-galactose+and+acetyl-CoA+transporters+as+Plasmodium+multidrug+resistance+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes.</a> Nature Microbiology. , (2016).</li>
<li>Adjalley, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+Plasmodium+falciparum+sexual+development+reveals+potent+transmission+blocking+activity+by+methylene+blue%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).</li>
<li>Sidik, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Genome-wide+CRISPR+Screen+in+Toxoplasma+Identifies+Essential+Apicomplexan+Genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes.</a> Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).</li>
<li>Amberg-Johnson, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+inhibition+of+apicomplexan+FtsH1+disrupts+plastid+biogenesis+in+human+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22elife%22%5BJournal%5D)">Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens.</a> elife. 6, (2017).</li>
<li>Crawford, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-free+CRISPR%2FCas9+genome+editing+in+Plasmodium+falciparum+confirms+mutations+conferring+resistance+to+the+dihydroisoquinolone+clinical+candidate+SJ733%5BTitle%5D)+AND+%22Public+Library+of+Science+One%22%5BJournal%5D)">Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733.</a> Public Library of Science One. 12 (5), e0178163(2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Deimplementatie van CRISPR/Cas9 in P. falciparum heeft zowel verhoogde de efficiëntie van en verminderde van de hoeveelheid tijd die nodig is voor het wijzigen van de parasiet genoom, vergeleken met vorige methoden van genetische manipulatie. Dit uitgebreide protocol beschrijft de stappen die nodig zijn voor het genereren van voorwaardelijke mutanten met behulp van CRISPR/Cas9 in P. falciparum. Terwijl de methode hier is gericht specifiek voor de generatie van HA -glmS mutanten, kan deze strate...

Malaria is een verwoestende ziekte veroorzaakt door eencellige parasieten van het geslacht Plasmodium. P. falciparum, de meeste dodelijke menselijke malariaparasiet, veroorzaakt ongeveer 445.000 sterfgevallen per jaar, meestal bij kinderen onder de leeftijd van vijf1. Plasmodium parasieten hebben een ingewikkelde levenscyclus waarbij een mug vector en een gewervelde gastheer. Mensen raken eerst besmet wanneer een geïnfecteerde mug een bloed-maaltijd neemt. Vervolgens valt de parasiet binnen de lever waar het groeit, ontwikkelt en verdeelt voor ongeveer een week. Na dit proces, zijn de parasieten in de bloedbaan, waar ze ondergaan ongeslachtelijke replicatie in rode bloedcellen (RBC) uitgebracht. Groei van de parasieten binnen de RBC zijn rechtstreeks verantwoordelijk voor de klinische symptomen die gepaard gaan met malaria2.
Tot voor kort was de productie van transgene P. falciparum een moeizaam proces, waarbij verschillende rondes van de selectie van de drug die vele maanden nam en een hoge mislukkingstarief had. Deze tijdrovende procedure relieson breekt de generatie van willekeurige DNA in de regio van belang en de endogene capaciteit van de parasiet te herstellen zijn genoom wel homologe reparatie3,4,5,6 . Onlangs, geclusterd regelmatig Interspaced palindromische Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) genoom bewerken is met succes gebruikt in P. falciparum7,8. De invoering van deze nieuwe technologie in malaria onderzoek is cruciaal voor het bevorderen van begrip van de biologie van deze dodelijke parasieten van Plasmodium . CRISPR/Cas9 voorziet in specifieke doelgerichtheid van genen via gids RNAs (gRNAs), dat homoloog aan het gen van belang zijn. De gRNA/Cas9 complexe herkent het gen via de gRNA, en Cas9 introduceert dan een pauze van de dubbel-strand, dwingen de inleiding van herstelmechanismes in het organisme9,10. Omdat P. falciparum de machine om te herstellen van DNA-einden ontbreekt via niet-homologe einde deelname aan, het maakt gebruik van homologe recombinatie mechanismen en integreert transfected homologe DNA sjablonen om te herstellen van de Cas9/gRNA-veroorzaakte Tweepersoonskamer-strand break11,12.
Hier presenteren we een protocol voor het genereren van voorwaardelijke vechtpartij mutanten in P. falciparum met behulp van CRISPR/Cas9 genoom bewerken. Het protocol demonstreert het gebruik van de Ribozym van de glmS naar voorwaardelijk vechtpartij eiwitniveaus van PfHsp70x (PF3D7_0831700), een chaperone geëxporteerd door P. falciparum in gastheer RBC13,14. De glmS Ribozym wordt geactiveerd door behandeling met glucosamine (die wordt geconverteerd naar glucosamine-6-fosfaat in cellen) om te klieven zijn bijbehorende mRNA, wat leidt tot een verlaging van de eiwit-14. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor het gebruik van andere voorwaardelijke vechtpartij hulpmiddelen, zoals destabilisatie domeinen of RNA aptamers4,5,15. Onze gegevens-protocol het genereren van een plasmide van de reparatie die bestaat uit een hemagglutinine (HA)-tag en glmS Ribozym codering reeks geflankeerd door sequenties die zijn homoloog aan de PfHsp70x open leesraam (ORF) en de 3'-UTR. Ook beschrijven we de generatie van een tweede plasmide tot uitdrukking van de aandrijving van de gRNA. Deze twee plasmiden, samen met een derde die uitdrukking van Cas9, rijdt zijn transfected in RBC en gebruikt voor het wijzigen van het genoom van P. falciparum parasieten. Ten slotte, beschrijven we een polymerase-kettingreactie (PCR)-techniek om te controleren of de integratie van de tag en glmS Ribozym gebaseerd. Dit protocol is hoogst aanpasbaar voor de wijziging of de volledige knockout van alle genen van P. falciparum , verbetering van ons vermogen om het genereren van nieuwe inzichten in de biologie van de malariaparasiet.

<table><tbody><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>1652660</td><td></td></tr><tr><td>Gene Pulser Xcell Electroporator</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2086</td><td>We buy the ones that are individually wrapped</td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889-250g</td><td></td></tr><tr><td>DSM1</td><td>Gift from Akhil Vaidya lab</td><td>Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34</td><td></td></tr><tr><td>TPP Tissue Culture 6 Well Plates</td><td>MIDSCI</td><td>TP92006</td><td></td></tr><tr><td>TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate)</td><td>MIDSCI</td><td>TP93100</td><td></td></tr><tr><td>TPP Tissue Culture 96 Well Plates</td><td>MIDSCI</td><td>TP92096</td><td></td></tr><tr><td>TPP Tissue Culture 24 Well Plates</td><td>MIDSCI</td><td>TP92024</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7002S</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>#B7202S</td><td></td></tr><tr><td>BtgZI</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0703L</td><td></td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0157L</td><td></td></tr><tr><td>HindIII-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>#R3104S</td><td></td></tr><tr><td>Afe1</td><td>New England Biolabs</td><td>#R0652S</td><td></td></tr><tr><td>Nhe1-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>#R3131L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>#M0203S</td><td></td></tr><tr><td>500 mL Steritop bottle top filter unit</td><td>Millipore</td><td>SCGPU10RE</td><td>You can use any size that fits your needs</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378-100G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500g</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500g</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034-500g</td><td></td></tr><tr><td>pMK-U6</td><td>Generated by the Muralidharan Lab</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pHA-glmS</td><td>Generated by the Muralidharan Lab</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pUF1-Cas9</td><td>Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab</td><td>Ghorbal et al. Nature Biotech 2014</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5280-100G</td><td></td></tr><tr><td>Hypoxanthine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9636-25g</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Reagent</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1895-1G</td><td></td></tr><tr><td>PL6-eGFP BSD</td><td>Generated by the Muralidharan Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Puf1-cas9 eGFP gRNA</td><td>Generated by the Muralidharan Lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel and PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609.250</td><td></td></tr><tr><td>Albumax I</td><td>Life Technologies</td><td>N/A</td><td>You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best</td></tr><tr><td>Human Red Blood Cells</td><td>Interstate Blood Bank, Inc</td><td>Email or call them directly for ordering</td><td>We typically use O+ blood</td></tr><tr><td>3D7 parasite line</td><td>Available upon request</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Lysogeny Broth (LB)</td><td>Fisher</td><td>BP1426-2</td><td>You can make your own, it is not necessary to use exactly this</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Fisher</td><td>BP1760-25</td><td>We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C</td></tr><tr><td>Ampicilin</td><td>Clonetech</td><td>R050A</td><td></td></tr><tr><td>Anti-EF1alpha</td><td>Dr. Daniel Goldberg's Lab</td><td>Washington University in St. Louis</td><td>You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory</td></tr><tr><td>Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal</td><td>Made by Roche, sold by Sigma</td><td>11867423001</td><td>You can use your preferred anti-HA antibody</td></tr><tr><td>0.6 mL tubes</td><td>Fisher</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II)</td><td>Fisher</td><td>22-122-911</td><td>You can also use giemsa stain</td></tr><tr><td>Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in.</td><td>Fisher</td><td>12-544-3</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet p. falciparum

CRISPR/Cas9 Gene Editing to Make Conditional Mutants of Human Malaria Parasite P. falciparum

Malaria is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit wereldwijd. Deze ziekte, die voornamelijk degenen die leven in tropische en subtropische gebieden treft, wordt veroorzaakt door infectie met Plasmodium parasieten. De ontwikkeling van meer effectieve medicijnen tegen malaria kan versneld worden door het verbeteren van ons begrip van de biologie van deze complexe parasiet. Genetische manipulatie van deze parasieten is de sleutel tot het begrijpen van hun biologie; echter is historisch het genoom van P. falciparum moeilijk geweest om te manipuleren. Onlangs, CRISPR/Cas9 genoom bewerken is gebruikt in de malariaparasieten, waardoor voor eenvoudiger eiwit tagging, generatie van voorwaardelijke eiwit knockdowns, en de deletie van genen vertonen. CRISPR/Cas9 genoom bewerken heeft bewezen als een krachtig instrument voor het bevorderen van het gebied van malaria-onderzoek. Hier beschrijven we een CRISPR/Cas9-methode voor het genereren van glmS-op basis van voorwaardelijke vechtpartij mutanten in P. falciparum. Deze methode is zeer aangepast aan andere soorten genetische manipulaties, met inbegrip van eiwit tagging en gene uitsparingen.

Een schematische voorstelling van de plasmiden gebruikt in deze methode, evenals een voorbeeld van een mutatie van het schild worden weergegeven in Figuur 1. Als een voorbeeld van hoe te identificeren van mutant parasieten na transfectie, zijn resultaten van PCRs voor het controleren van de integratie van de HA -glmS construct afgebeeld in Figuur 2. Een representatief beeld van een klonen plaat is afgebeeld in <strong cl...

Beschrijven we een methode voor het genereren van glmS-op basis van voorwaardelijke vechtpartij mutanten in Plasmodium falciparum met behulp van CRISPR/Cas9 genoom bewerken.

CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum

Malaria is a significant cause of morbidity and mortality worldwide. This disease, which primarily affects those living in tropical and subtropical ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de biologie van de menselijke malariaparasiet, P.Falciparum, door te helpen om de eiwitfunctie te ontdekken door middel van voorwaardelijke knockdown. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt voor relatief eenvoudige generatie van voorwaardelijke mutanten in vergelijking met eerdere methoden. Om te beginnen, ga naar Chop Chop en selecteer Fasta Target'Under Target, plak de 200 basisparen van de drie prime end van de open lezing frame van een gen en 200 base paren vanaf het begin van de drie prime UTR van het gen.Klik onder In'select P.Falciparum' en selecteer CRISPR/Cas9'under Using'Next op Doelsites zoeken'Selecteer een gRNA-reeks uit de gepresenteerde opties, waarbij de voorkeur wordt gegeven aan de meest efficiënte gRNA die het dichtst bij de site van wijziging ligt en die de minste off-target sites heeft. Koop de gRNA-sequentie en de omgekeerde aanvulling als polyacrylamide gel elektroforese gezuiverde oligos. De gRNA-reeks die wordt gebruikt om PfH-sp70x te targeten, is te vinden in het tekstprotocol.Voeg 40 microgram per pMK-U6, pUF1-Cas9 en pHA-glmS DNA toe aan een steriele 1,5 millimeter centrifugebuis. Voeg een tiende van het volume van DNA van drie molaire natriumacetaat in water toe aan de buis en meng het goed met behulp van een vortex. Voeg vervolgens 2,5 keer het volume van 100 procent ethanol toe aan de buis en meng het goed met behulp van een vortex gedurende ten minste 30 seconden.Zet de buis op ijs of op min 20 graden Celsius gedurende 30 minuten. Dan, centrifuge de buis op 18, 300 keer G gedurende 30 minuten op vier graden Celsius. Verwijder na centrifugatie de supernatant voorzichtig uit de buis zonder de pellet te storen.Voeg drie keer het volume van 70 procent ethanol toe aan de buis en meng het kort met behulp van een vortex. Centrifuge de buis op 18, 300 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Nogmaals, verwijder voorzichtig de supernatant uit de buis zonder de pellet te storen.Laat de buis open en laat de pellet 15 minuten drogen. Bewaar het neergeslagen DNA op min 20 graden Celsius totdat het nodig is voor transfectie. Als u rbc's wilt transfecteren, bereidt u 1X cytomix-buffer voor, evenals onvolledige en volledige RPMI zoals beschreven in het tekstprotocol.Filter steriliseer de buffer met een filter van 0,22 micron. Voeg 380 microliter van de 1X cytomix toe aan het DNA en vortex om op te lossen. Laat het DNA 10 minuten in de 1X cytomix oplossen en draaikolken om de drie minuten gedurende 10 seconden.In een steriele, 15 milliliter conische buis, combineer 300 microliter van geïsoleerde menselijke RBC's in de onvolledige RPMI met vier milliliter 1X cytomix. Centrifuge de RBC's op 870 keer G gedurende drie minuten. Verwijder vervolgens de supernatant uit de RBC pellet.Scc-pellet opnieuw ophangen met het DNA-cytomixmengsel en breng deze over op een elektroporatie cuvette van 0,2 centimeter. Poreren van de RBC's met behulp van de voorwaarden in het tekstprotocol. Breng na elektroporatie de inhoud van de cuvette over naar een conische buis van 15 milliliter met vijf milliliter volledige RPMI.Centrifuge de buis op 870 keer G gedurende drie minuten bij 20 graden Celsius. Dan, decanteren de supernatant. Nu, opnieuw opschorten de pellet in vier milliliter van volledige RPMI en de overdracht naar een put in een zes-goed weefsel cultuur plaat.Voeg 400 microliters van een hoge schizontcultuur toe aan de overgedragen RBC's. Houd alle culturen op 37 graden Celsius onder drie procent zuurstof, drie procent CO2 en 94 procent stikstof. De volgende dag, was de cultuur met vier milliliter van volledige RPMI.Centrifuge de cultuur op 870 keer G gedurende drie minuten. Aspirate de supernatant. Schort de cultuur opnieuw op in vier milliliter van volledige RPMI.48 uur later, was de cultuur met vier milliliter van volledige RPMI. Stel vervolgens de cultuur opnieuw op in volledige RPMI met één micromolar DSM1 om te selecteren voor de Cas9 plasmid. Vervang na dit punt het kweekmedium door verse volledige RPMI plus elke 48 uur één micromolar DSM1.Blijf de culturen elke dag wassen met volledige RPMI totdat parasieten niet meer zichtbaar zijn door bloeduitstrijkje. Om een bloeduitstrijkje te maken, pipet 150 microliter van de cultuur in een 0,6 milliliter centrifuge buis. Na het pelleteren van de cellen door centrifugatie op 1, 700 keer G gedurende 30 seconden, aanzuigen uit de supernatant.Gebruik een pipet om de gepelde cellen over te brengen naar een glazen glijbaan. Met behulp van een tweede glazen dia gehouden in een hoek van 45 graden naar de eerste dia, smeer de bloeddruppel. Bevlek de glijbaan met behulp van een commercieel verkrijgbare kleuringkit volgens het protocol van de fabrikant.Bekijk de parasieten met behulp van 100 keer olie-onderdompeling doelstelling. Begin vijf dagen na de transfectie, verwijder twee milliliter van de cultuur met RBCs opnieuw opgehangen in de cultuur medium. Voeg terug twee milliliter vers medium en bloed op twee procent hematocriet.Voeg vers bloed op deze manier een keer per week tot parasiet weer verschijnen, zoals bepaald door dunne bloeduitstrijkje. Uitvoeren van seriële verdunningen van de parasietcultuur om een uiteindelijke concentratie van 0,5 parasieten per 200 microliter te bereiken. Voeg 200 microliter van de verdunde cultuur toe aan de putten van een 96-put weefselkweekplaat.Behoud de kloonplaat totdat parasieten detecteerbaar zijn in de putten. Vervang elke 48 uur het medium in de 96-put plaat door vers medium. Eenmaal per week, vanaf vijf dagen na het begin van de kloonplaat, verwijder 100 microliter uit elke put en voeg 100 microliters vers medium plus bloed terug.Om putten met parasieten te identificeren, plaatst u de 96-putplaat ongeveer 20 minuten onder een hoek van 45 graden, waardoor het bloed zich onder een hoek van de plaat kan vestigen. Plaats vervolgens de 96-put plaat op een lichtbak. Merk op dat de putten met parasieten media bevatten die geel van kleur zijn, vergeleken met de roze media van parasietvrije putten, als gevolg van verzuring van het medium door de parasieten.Met behulp van een serologische pipet verplaatst u de inhoud van de parasiethoudende putten naar een 24-bron weefselkweekplaat om uitbreiding van de parasieten mogelijk te maken. Controleer deze kloonparasietenlijnen met behulp van PCR-analyse op de juiste integratie. De resultaten van een immunofluorescentietest worden hier getoond, waaruit de succesvolle HA-tagging van PfH-sp70x blijkt.PfH-sp70x glmS parasieten werden vastgesteld en gekleurd met DAPI als een kern marker, evenals antilichamen tegen HA. Membraan-geassocieerde histidine rijke eiwit een, een marker van eiwit export naar de gastheer RBC. Een western blot-analyse van pfh-sp70x-eiwitniveau na behandeling met glucosamine wordt hier weergegeven. Zoals verwacht daalt het eiwitgehalte tijdens de duur van de behandeling.Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van parasitologie om fundamentele vragen in de biologie van de malariaparasiet te onderzoeken. Het is belangrijk om te onthouden dat P.Falciparum is een door bloed overgedragen ziekteverwekker en passende persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden gedragen tijdens het uitvoeren van deze procedure.

crisprcas9-gene-editing-to-make-conditional-mutants-human-malaria

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Details worden gepresenteerd over hoe QTL mapping met een genoomkaart op basis van een genoom sequentie kan worden gebruikt om een ​​drug resistentie gen in Toxoplasma gondii te identificeren en hoe dit kan worden gecontroleerd met het CRISPR / Cas9 systeem dat efficiënt een genomisch doel bewerkt, in dit geval de Drug resistentie gen.

QTL Mapping en CRISPR / Cas9 Editing om een ​​Drug Resistance Gene te identificeren<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Gerichte gene bewerken met behulp van CRISPR/Cas9, heeft het inzicht in de biologische functies van genen aanzienlijk vergemakkelijkt. Hier, gebruiken we de methode van de CRISPR/Cas9 voor model calreticulin mutaties in cytokine-afhankelijke hematopoietische cellen om hun oncogene activiteit te bestuderen.

Met behulp van CRISPR/Cas9 Gene bewerken om te onderzoeken de oncogene activiteit van Mutant Calreticulin in Cytokine afhankelijke hematopoietische cellen

Hier beschrijven we een protocol om een gen knock-out in de extracellulaire amastigote van Trypanosoma cruzi te introduceren, met behulp van het crispr/Cas9-systeem. De groei fenotype kan worden opgevolgd door de celtelling van de Axenische amastigote cultuur of door proliferatie van intracellulaire amastigotes na de invasie van de cel van de host.

Introductie van een gen knock-out direct in het Amastigote stadium van Trypanosoma cruzi met behulp van het crispr/Cas9 systeem

CRISPR/Cas9 wordt steeds vaker gebruikt om genfunctie in niet-modelorganismen te karakteriseren. Dit protocol beschrijft hoe knock-out lijnen van Culex pipienste genereren, van het bereiden van injectiemengsels tot het verkrijgen en injecteren van muggenembryo's, evenals hoe geïnjecteerde muggen en hun nakomelingen op te wekken, te kruisen en te screenen op gewenste mutaties.

Embryo's van Culex-muggen voorbereiden en injecteren om null-mutaties te genereren met CRISPR/Cas9

Dit protocol beschrijft de stappen van CRISPR/Cas9 gerichte mutagenese bij zandvliegen: embryoverzameling, injectie, insectenopfok en identificatie, evenals selectie van mutaties van belang.

Zandvlieg (Phlebotomus papatasi) Embryo Microinjection voor CRISPR/Cas9 Mutagenese

Het doel van dit protocol is om naadloze CRISPR/Cas9-bewerking van het C. elegans-genoom mogelijk te maken met behulp van geassembleerde ribonucleoproteïnecomplexen en de dpy-10 co-CRISPR-marker voor screening. Dit protocol kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan genetische modificaties in C. elegans te maken, waaronder inserties, deleties, genvervangingen en codonsubstituties.

CRISPR/Cas9 Editing van het C. elegans rbm-3.2 Gen met behulp van de dpy-10 Co-CRISPR Screening Marker en Geassembleerde Ribonucleoproteïne Complexen.

Het protocol beschrijft hoe locatiegerichte modificaties in het genoom van Anopheles malariamuggen kunnen worden bereikt met behulp van het φC31-systeem . De beschreven modificaties omvatten zowel de integratie als de uitwisseling van transgene cassettes in het genoom van attP-dragende koppelingslijnen.

Site-Directed φC31-gemedieerde integratie en cassette-uitwisseling in Anopheles Vectors of Malaria

Dit artikel beschrijft een protocol voor snelle identificatie van indels geïnduceerd door CRISPR /Cas9 en selectie van mutante lijnen in de mug Aedes aegypti met behulp van hoge resolutie smeltanalyse.

Indel Detection na CRISPR/Cas9 Mutagenese met behulp van Hoge resolutie Melt Analysis in de Mosquito Aedes aegypti

Dit protocol beschrijft hoe efficiënte adenine-basisbewerking zonder PAM-beperking kan worden uitgevoerd om een nauwkeurig zebravisziektemodel te construeren met behulp van zSpRY-ABE8e.

Efficiënte PAM-loze basisbewerking voor zebravismodellering van menselijke genetische ziekten met zSpRY-ABE8e

Chemische genetica omvat de vervanging van een poortwachterresidu door een aminozuur dat een andere zijketen bevat op de doellocus. Hier hebben we een mutante parasiet gegenereerd die een hypomorf allel van cdpk1 bevat en compenserende routes geïdentificeerd die door de parasiet in de mutante achtergrond zijn aangenomen.

Inzicht in de ontwikkeling van compenserende routes in een mutante malariaparasiet die een hypomorf allel van plantachtige kinasen herbergt

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor genoombewerking door middel van embryonale micro-injectie in de mug A. aegypti met behulp van de CRISPR-Cas9-technologie.

Genoombewerking in de gelekoortsmug Aedes aegypti met behulp van CRISPR-Cas9

Leer CRISPR/Cas9-genoombewerking voor voorwaardelijke knockdown-mutanten van de menselijke malariaparasiet Plasmodium falciparum. Deze methode onthult eiwitfunctie en verbetert malariabestrijding.

CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum

Meer video's verkennen