CRISPR/Cas9 Gene bewerken te maken voorwaardelijke mutanten van menselijke malariaparasiet P. falciparum

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de biologie van de menselijke malariaparasiet, P.Falciparum, door te helpen om de eiwitfunctie te ontdekken door middel van voorwaardelijke knockdown. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt voor relatief eenvoudige generatie van voorwaardelijke mutanten in vergelijking met eerdere methoden. Om te beginnen, ga naar Chop Chop en selecteer Fasta Target'Under Target, plak de 200 basisparen van de drie prime end van de open lezing frame van een gen en 200 base paren vanaf het begin van de drie prime UTR van het gen.

Klik onder In'select P.Falciparum' en selecteer CRISPR/Cas9'under Using'Next op Doelsites zoeken'Selecteer een gRNA-reeks uit de gepresenteerde opties, waarbij de voorkeur wordt gegeven aan de meest efficiënte gRNA die het dichtst bij de site van wijziging ligt en die de minste off-target sites heeft. Koop de gRNA-sequentie en de omgekeerde aanvulling als polyacrylamide gel elektroforese gezuiverde oligos. De gRNA-reeks die wordt gebruikt om PfH-sp70x te targeten, is te vinden in het tekstprotocol.

Voeg 40 microgram per pMK-U6, pUF1-Cas9 en pHA-glmS DNA toe aan een steriele 1,5 millimeter centrifugebuis. Voeg een tiende van het volume van DNA van drie molaire natriumacetaat in water toe aan de buis en meng het goed met behulp van een vortex. Voeg vervolgens 2,5 keer het volume van 100 procent ethanol toe aan de buis en meng het goed met behulp van een vortex gedurende ten minste 30 seconden.

Zet de buis op ijs of op min 20 graden Celsius gedurende 30 minuten. Dan, centrifuge de buis op 18, 300 keer G gedurende 30 minuten op vier graden Celsius. Verwijder na centrifugatie de supernatant voorzichtig uit de buis zonder de pellet te storen.

Voeg drie keer het volume van 70 procent ethanol toe aan de buis en meng het kort met behulp van een vortex. Centrifuge de buis op 18, 300 keer G gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius. Nogmaals, verwijder voorzichtig de supernatant uit de buis zonder de pellet te storen.

Laat de buis open en laat de pellet 15 minuten drogen. Bewaar het neergeslagen DNA op min 20 graden Celsius totdat het nodig is voor transfectie. Als u rbc's wilt transfecteren, bereidt u 1X cytomix-buffer voor, evenals onvolledige en volledige RPMI zoals beschreven in het tekstprotocol.

Filter steriliseer de buffer met een filter van 0,22 micron. Voeg 380 microliter van de 1X cytomix toe aan het DNA en vortex om op te lossen. Laat het DNA 10 minuten in de 1X cytomix oplossen en draaikolken om de drie minuten gedurende 10 seconden.

In een steriele, 15 milliliter conische buis, combineer 300 microliter van geïsoleerde menselijke RBC's in de onvolledige RPMI met vier milliliter 1X cytomix. Centrifuge de RBC's op 870 keer G gedurende drie minuten. Verwijder vervolgens de supernatant uit de RBC pellet.

Scc-pellet opnieuw ophangen met het DNA-cytomixmengsel en breng deze over op een elektroporatie cuvette van 0,2 centimeter. Poreren van de RBC's met behulp van de voorwaarden in het tekstprotocol. Breng na elektroporatie de inhoud van de cuvette over naar een conische buis van 15 milliliter met vijf milliliter volledige RPMI.

Centrifuge de buis op 870 keer G gedurende drie minuten bij 20 graden Celsius. Dan, decanteren de supernatant. Nu, opnieuw opschorten de pellet in vier milliliter van volledige RPMI en de overdracht naar een put in een zes-goed weefsel cultuur plaat.

Voeg 400 microliters van een hoge schizontcultuur toe aan de overgedragen RBC's. Houd alle culturen op 37 graden Celsius onder drie procent zuurstof, drie procent CO2 en 94 procent stikstof. De volgende dag, was de cultuur met vier milliliter van volledige RPMI.

Centrifuge de cultuur op 870 keer G gedurende drie minuten. Aspirate de supernatant. Schort de cultuur opnieuw op in vier milliliter van volledige RPMI.

48 uur later, was de cultuur met vier milliliter van volledige RPMI. Stel vervolgens de cultuur opnieuw op in volledige RPMI met één micromolar DSM1 om te selecteren voor de Cas9 plasmid. Vervang na dit punt het kweekmedium door verse volledige RPMI plus elke 48 uur één micromolar DSM1.

Blijf de culturen elke dag wassen met volledige RPMI totdat parasieten niet meer zichtbaar zijn door bloeduitstrijkje. Om een bloeduitstrijkje te maken, pipet 150 microliter van de cultuur in een 0,6 milliliter centrifuge buis. Na het pelleteren van de cellen door centrifugatie op 1, 700 keer G gedurende 30 seconden, aanzuigen uit de supernatant.

Gebruik een pipet om de gepelde cellen over te brengen naar een glazen glijbaan. Met behulp van een tweede glazen dia gehouden in een hoek van 45 graden naar de eerste dia, smeer de bloeddruppel. Bevlek de glijbaan met behulp van een commercieel verkrijgbare kleuringkit volgens het protocol van de fabrikant.

Bekijk de parasieten met behulp van 100 keer olie-onderdompeling doelstelling. Begin vijf dagen na de transfectie, verwijder twee milliliter van de cultuur met RBCs opnieuw opgehangen in de cultuur medium. Voeg terug twee milliliter vers medium en bloed op twee procent hematocriet.

Voeg vers bloed op deze manier een keer per week tot parasiet weer verschijnen, zoals bepaald door dunne bloeduitstrijkje. Uitvoeren van seriële verdunningen van de parasietcultuur om een uiteindelijke concentratie van 0,5 parasieten per 200 microliter te bereiken. Voeg 200 microliter van de verdunde cultuur toe aan de putten van een 96-put weefselkweekplaat.

Behoud de kloonplaat totdat parasieten detecteerbaar zijn in de putten. Vervang elke 48 uur het medium in de 96-put plaat door vers medium. Eenmaal per week, vanaf vijf dagen na het begin van de kloonplaat, verwijder 100 microliter uit elke put en voeg 100 microliters vers medium plus bloed terug.

Om putten met parasieten te identificeren, plaatst u de 96-putplaat ongeveer 20 minuten onder een hoek van 45 graden, waardoor het bloed zich onder een hoek van de plaat kan vestigen. Plaats vervolgens de 96-put plaat op een lichtbak. Merk op dat de putten met parasieten media bevatten die geel van kleur zijn, vergeleken met de roze media van parasietvrije putten, als gevolg van verzuring van het medium door de parasieten.

Met behulp van een serologische pipet verplaatst u de inhoud van de parasiethoudende putten naar een 24-bron weefselkweekplaat om uitbreiding van de parasieten mogelijk te maken. Controleer deze kloonparasietenlijnen met behulp van PCR-analyse op de juiste integratie. De resultaten van een immunofluorescentietest worden hier getoond, waaruit de succesvolle HA-tagging van PfH-sp70x blijkt.

PfH-sp70x glmS parasieten werden vastgesteld en gekleurd met DAPI als een kern marker, evenals antilichamen tegen HA. Membraan-geassocieerde histidine rijke eiwit een, een marker van eiwit export naar de gastheer RBC. Een western blot-analyse van pfh-sp70x-eiwitniveau na behandeling met glucosamine wordt hier weergegeven. Zoals verwacht daalt het eiwitgehalte tijdens de duur van de behandeling.

Deze techniek maakt de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van parasitologie om fundamentele vragen in de biologie van de malariaparasiet te onderzoeken. Het is belangrijk om te onthouden dat P.Falciparum is een door bloed overgedragen ziekteverwekker en passende persoonlijke beschermingsmiddelen moeten worden gedragen tijdens het uitvoeren van deze procedure.