Analyse van intrinsieke wanorde van de AtHIRD11 en bindende naar metaalionen door capillaire gelelektroforese en affiniteit capillaire elektroforese

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de tektoniek van intrinsiek ongeordende eiwitten, zoals conformationele veranderingen als gevolg van metaalijzerbinding. Het grote voordeel van deze techniek is dat er heel weinig apparatuur nodig is en de resultaten zeer snel verkregen kunnen worden. Matthias Stein, een afgestudeerde student uit mijn laboratorium, zal de procedure demonstreren.

Om te beginnen, gebruik een glazen snijder op een glazen plaat om een blote fused silica capillair met een polyamide buitenlaag en een binnendiameter van 50 micron in lengtes van 33 en 30 centimeter te snijden. Gebruik een pen om het midden van een detectievenster van een centimeter breed te markeren op een afstand van 24,5 centimeter vanaf een uiteinde van de capillair voor het CGE-experiment en op 21,5 centimeter vanaf een uiteinde van de capillair voor het ACE-experiment. Gebruik een brander om de polyamide buitenlaag 0,5 centimeter voor en na elke markering af te branden.

Gebruik de brander ook om een centimeter van de coating aan beide uiteinden van de capillairen te verwijderen. Gebruik vervolgens ethanol en een zachte doek om de uiteinden van de capillairen en de detectievensters te reinigen. Installeer een capillair in het CE-systeem met het detectievenster dicht bij de uitlaat.

Na het bereiden van oplossingen, volgens het tekstprotocol, gebruik een oplossing van 250 micromolair calciumchloride om een spuit van 10 milliliter te vullen. Bevestig vervolgens een 0,2 micron PVDF-filter aan de spuit en duw 2 milliliter van de oplossing door het filter om het weg te gooien. Gebruik de resterende calciumchloride in de spuit om 10 flesjes tot het maximaal toegestane volume te vullen.

Label elk flesje als 250 micromolair calciumchloride inlaatflesje. Vul vervolgens, met behulp van de calciumchloride-oplossing, 10 flesjes halfvol. Markeer elk als 250 micromolair calciumchloride uitlaatflesje.

Vul vervolgens met andere oplossingen met metaalzouten, de flesjes op een vergelijkbare manier. Gebruik bovendien voor elk paar inlaat- en uitlaatflesjes 30 micromolair Tris-buffer om een vergelijkbare set inlaat- en uitlaatflesjes te bereiden. Vul met 60 micromolair acetanilide EOF-marker 10 flesjes.

Gebruik vervolgens de monsteroplossing van één milligram per milliliter om één flesje te vullen. Na het voorbereiden van de analyse, volgens het tekstprotocol, voer de scheiding uit door de monsteroplossing voor de CGE-experimenten hydrodynamisch te injecteren en 0,1 bar gedurende vier minuten op de inlaat aan te brengen. Breng vervolgens negatieve 16,5 kilovolt en een druk van 2,0 bar gedurende 25 minuten aan op beide uiteinden van de capillair.

Na het voorbereiden van de methode voor de metingen zonder liganden, bereid de methode voor de metingen met liganden voor door eerst 0,1 molair EDTA-oplossing te gebruiken om de capillair gedurende 1 minuut bij 2,5 bar te spoelen. Gebruik vervolgens gedeïoniseerd water om de capillair te spoelen. Equilibreer vervolgens de capillair door ligandoplossing te gebruiken om deze gedurende 1,5 minuten bij 2,5 bar te spoelen.

Injecteer vervolgens de acetanilide-oplossing bij 0,05 bar gedurende 6 seconden en verwissel de inlaat- en uitlaatflesjes naar de bufferflesjes met ligand. Breng 0,05 bar gedurende 2,4 seconden aan om de acetanilide-oplossing verder vanaf de punt van de capillair te duwen. Breng 10,0 kilovolt gedurende 6 minuten aan en detecteer de acetanilide-piek bij een golflengte van 200 nanometer.

Na het spoelen van de capillair met EDTA gedeïoniseerd water en de ligandoplossing, injecteer vervolgens het eiwitmonster en verwissel de inlaat- en uitlaatflesjes naar verse ligand bevattende bufferflesjes. Herhaal afwisselend metingen met en zonder liganden. Herhaal vervolgens de methode met behulp van de aardalkali-ligandoplossingen.

Gebruik tenslotte de volgende oplossingen om dezelfde methode uit te voeren. Bereken vervolgens de verandering in ladingsgrootteratio's voor de verschillende eiwit-metaalioneninteracties. Hier is het elektroferogram voor het AtHIRD11-monster verkregen tijdens de CGE-experimenten.

De peptidegrootte neemt van links naar rechts toe. Piek nummer vier heeft de grootste massa en geeft het intacte eiwit aan. De kleinere pieken, twee en drie, vertegenwoordigen kleinere onzuiverheden.

Deze figuur vertegenwoordigt het elektroferogram voor acetanilide tijdens de ACE-experimenten. De acetanilide-oplossing vertoont slechts één hoge piek, aangezien deze geen onzuiverheden mag hebben. De detectietijd voor het piekmaximum geeft de migratietijd van de elektro-osmotische stroom aan en wordt gebruikt voor de berekening van de interactie.

Dit elektroferogram van het AtHIRD11-monster tijdens het ACE-experiment werd uitgevoerd in afwezigheid van SDS en metaalionen. Naast de twee onzuiverheden uit het CGE-elektroferogram, zijn er ten minste vijf pieken, die gerelateerd zijn aan het eiwit zelf, aanwezig. Een grafische evaluatie van de gemeten migratietijdverschuivingen in aanwezigheid van de verschillende metaalionen voor piek zes, wordt hier getoond.

Het wordt weergegeven door de berekende waarde Delta R over RF. Elk resultaat geeft aan hoe sterk een verschuiving heeft plaatsgevonden door zijn waarde en zijn teken, zoals aangegeven door de algehele verandering in lading van de eiwit-metaalionencomplexen. Eenmaal beheerst, kan de techniek voor één interactiepartner in acht uur worden uitgevoerd, inclusief de CGE-interactie, als deze goed wordt uitgevoerd. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden om de eiwitoplossingen te verversen voor langdurige metingen, omdat degradatieproducten in de loop van de tijd kunnen toenemen en om de Tris-bufferoplossingen te verversen om meer nauwkeurige resultaten te verkrijgen.

Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u een capillair kunt snijden en reinigen, evenals een affiniteits capillaire elektroforese methode kunt instellen, om het bindingsgedrag van intrinsiek ongeordende eiwitten te evalueren.