Optimalisatie van Laser-Capture Microdissection voor de isolatie van darmen Ganglia van menselijk weefsel vers bevroren
June 14th, 2018
Het doel van dit protocol is het verkrijgen van hoge-integriteit RNA monsters van darmen ganglia geïsoleerd van nietgefixeerde, vers gereseceerd menselijke intestinale weefsel met behulp van de laser vangt microdissection (LCM). Dit protocol omvat voorbereiding van monsters van menselijke intestinale weefsels, cryosectioning, ethanolbevattend kleuring en uitdroging, LCM, flash-bevroren en RNA extractie.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over het enterische zenuwstelsel, zoals het expressieprofiel van enterische ganglia in de darmen van volwassen mensen. Het grootste voordeel van deze techniek is dat het kan worden gebruikt om hoge opbrengsten van RNA uit humane enterische ganglia te verkrijgen met maximale behoud van de RNA-kwaliteit. Begin met darmweefsel gesneden in lengtes van 20 centimeter.
Verwijder eerst het vetweefsel en bindweefsel. Vermijd het snijden van de serosa, wat kan leiden tot structurele schade aan het myenterische plexus. Maak vervolgens een longitudinale incisie over de hele lengte van het bijgesneden monster, bij voorkeur op de plaats van bevestiging van de mesenteria.
Vervolgens worden de taeniae coli uit de dikke darm verwijderd en weggegooid, zodat het weefsel zich kan vlakken. Spreid nu de darm uit, mucosa zijde naar beneden, op een gekoelde snijplank. Snijd vervolgens 1,25 centimeter brede stroken over de volledige lengte van het weefsel.
Breng elk stuk over in een gekoelde weefselopslagoplossing voor tijdelijke opslag. Snijd vervolgens elke strook in segmenten van twee tot 1,5 centimeter lang. Nadat een strook in segmenten is gesneden, dep de segmenten droog.
Het is belangrijk dat het weefsel erg droog is, zodat er geen ijskristallen op het weefsel ontstaan wanneer het wordt bevroren. Schik nu de gedroogd weefsel, mucosa zijde omhoog, op een koude, wegwerpbare plastic mal. Vervolgens vlakt u elk stuk af met gebogen pincetten om opgesloten luchtbellen te verwijderen.
Het weefsel zal uitzetten terwijl het wordt vlakgemaakt. Beoordeel de dikte van de weefselsegmenten na het vlakmaken voor het invriezen. Duw indien nodig de randen van het monster naar binnen totdat het darmmonster de oorspronkelijke dikte benadert.
Breng nu de geladen basismal naar een slurry van droog ijs en 2-methylbutaan. Het weefsel moet binnen 30 tot 60 seconden volledig bevriezen. Droog vervolgens onmiddellijk de bodem van de mal met koude doekjes die op droog ijs zijn bewaard.
Controleer nu het monster. Let op eventuele monsters die er niet plat uitzien. Wikkel vervolgens de mal in aluminiumfolie die vooraf is gelabeld en gekoeld voor gebruik.
Bedek vervolgens de folie met een laag plasticfolie om uitdroging tot een minimum te beperken. Houd de monsters op ijs totdat ze kunnen worden bewaard bij min 80 graden Celsius. Nadat u de benodigde materialen hebt voorbereid, giet u een 3 tot 5 millimeter bergje TFM op een grote cryostaat monsterhouder en brengt u het darmmonster onmiddellijk over, serosa zijde omhoog, op de TFM.
Na enkele seconden op kamertemperatuur, brengt u de monsterhouder over naar droog ijs en bedekt u deze met poedervormig droog ijs. Zorg ervoor dat de TFM vóór het snijden onder het vlak van het myenterische plexus ligt. Monteer vervolgens de monsterhouder in de cryostaat monsterkop en lijn het monster uit met de cryostaatmes.
Maak het vlak van het myenterische plexus evenwijdig aan het snijmes. Maak nu acht micronseringen door de serosa en longitudinale spier totdat u het myenterische plexus bereikt. Om het myenterische plexus te lokaliseren, monteert u een monster en kleurt u het met een waterige kleurstof, zoals 1% kristallen violet.
Om verder te gaan, identificeert u de overgang tussen de longitudinale en circulaire spierlagen. Bij het begin van de sectie zal de serosa worden gemarkeerd door de aanwezigheid van bindweefsel. Er kan ook nog wat mesenterisch vet aanwezig zijn langs de serosa.
Vervolgens wordt de laag van de buitenste longitudinale spier zichtbaar. Zodra de grens tussen de longitudinale en circulaire spierlagen is bereikt, zal een deel van de enterische ganglia worden waargenomen. In de volgende secties zal het myenterische plexus zeer duidelijk worden met grote gebieden van ganglia in een enkele sectie. Verzamel nu seriële secties voor de laser-capture microdissectie.
Koel PEN-schuiven in de cryostaat gedurende vijf tot 10 seconden en gebruik ze om de secties te monteren. De beste secties zullen veel neuronen en gliacellen bevatten. Ga vervolgens verder met het kleuren en vervolgens dehydrateren van de secties zoals beschreven in het tekstprotocol.
Voorbereiding: plaats een cartridge met LCM-doppen in de LCM-microscoopstandaard. Laad vervolgens de monsterschuif op de standaard en verwerf een overzichtsafbeelding van de dia. Identificeer de gewenste locatie voor LCM en laad een dop op de dia.
Richt vervolgens de infraroodlaser uit en pas het vermogen en de duur van de laser aan voor een opvangstip van 20 tot 30 micron in diameter. Omcirkel vervolgens de gewenste ganglia die moeten worden verzameld. Zorg ervoor dat u binnen de grenzen van het verzamelbare gebied op de dop blijft, dat als een groene cirkel wordt weergegeven.
Voor elk van de met een UV-snijsporing omlijnde ganglia, pas de IR-spots aan zodat er ten minste één IR-spot elke 100 tot 500 micron is om ervoor te zorgen dat alle ganglia worden verzameld wanneer de dop van het monster wordt getild. Druk vervolgens op de IR UV Cut knop om door te gaan met het verzamelen van alle gemarkeerde ganglia. Nadat het verzamelen is voltooid, verplaatst u de dop naar een nieuwe locatie en herhaalt u het verzamelproces.
Dit kan gedurende 60 tot 80 minuten worden herhaald. Wanneer de LCM-dop is geladen met voldoende ganglia, brengt u deze over naar een kwaliteitscontrolestation. Als er puin op de dop aanwezig is, veegt u dit weg met een fijne penseeltip die is voorbereid voor RNA-gebruik.
Gebruik een pipettentip voor eventueel moeilijk te verwijderen puin. Bevestig vervolgens de dop op een 0,5 milliliter microcentrifugebuisje gevuld met 230 microliter RNA-lysebuffer. Draai de dop om, vortex kort en incubeer vervolgens het monster op kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
Centrifugeer vervolgens het monster gedurende vijf minuten bij 5.000 g of sneller en breng vervolgens het microcentrifugebuisje over naar droog ijs. Het monster is nu klaar voor de RNA-extract
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Deze studie schetst een protocol voor het extraheren van hoogwaardig RNA uit enterische ganglia geïsoleerd uit vers-geresecteerd menselijk darmweefsel met behulp van laser capture microdissectie (LCM). De methode heeft tot doel de expressieprofielen van het enterische zenuwstelsel in de menselijke darmen te onderzoeken, waardoor ons begrip van neurale functies binnen het maag-darmkanaal wordt verbeterd.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Moleculair Biologie
- Gastro-enterologie
Achtergrond
- Het enterische zenuwstelsel speelt een cruciale rol in de gastro-intestinale functie.
- Hoogwaardig RNA is essentieel voor het bestuderen van genexpressieprofielen.
- Laser capture microdissectie maakt nauwkeurige isolatie van cellulaire structuren mogelijk.
- Deze techniek vergemakkelijkt gedetailleerde moleculaire analyses van intact weefsel.
Doel van de studie
- Om hoge opbrengsten van RNA uit menselijke enterische ganglia te verkrijgen.
- Om de RNA-kwaliteit te behouden met minimale weefselschade.
- Om genexpressieprofielen in het menselijk enterisch zenuwstelsel te beoordelen.
Gebruikte methoden
- Laser capture microdissectie (LCM) van enterische ganglia uit menselijke weefselmonsters.
- Frisch-geresecteerd darmweefsel werd verwerkt om ganglia te isoleren.
- Kritieke stappen omvatten cryosectionering, kleuring en dehydratie.
- RNA-extractie volgde de LCM-technieken om hoge RNA-integriteit te bereiken.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol leverde meer dan 1 nanogram hoogwaardig RNA op voor sequencing.
- RNA-integriteitsnummers gaven uitstekende RNA-kwaliteit aan, geschikt voor RNA-Seq.
- Meer dan 95% van de monsters was voldoende voor sequencinganalyses.
Conclusies
- Deze studie demonstreert een effectieve methode voor het isoleren van RNA uit menselijke enterische ganglia.
- De resultaten maken diepere inzichten mogelijk in de moleculaire mechanismen van het enterische zenuwstelsel.
- Deze methode heeft implicaties voor onderzoek naar gastro-intestinale aandoeningen en neurale functie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Laser-capture microdissection (LCM) enables precise isolation of enteric ganglia from human intestinal tissue, providing high-integrity RNA for transcriptomic analysis. This approach supports target validation in gastrointestinal neuroscience by delivering disease-relevant molecular data from primary human tissue. The method reduces biological noise and enhances predictive confidence in early discovery workflows focused on enteric nervous system pathways.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating pure populations of enteric ganglia for RNA-seq analysis.
- Operational Value: Preserves RNA integrity while minimizing contamination from surrounding tissue layers.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking through direct measurement of gene expression in disease-relevant human neural tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, high-quality RNA inputs suitable for reproducible transcriptomic assays.
- Operational Value: Uses PEN-membrane slides and ethanol-compatible dyes to improve capture efficiency and RNA yield.
- Scientific Value: Enables quantitative dependent variable measurements (e.g., RNA integrity number) for assay qualification.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant human tissue data that bridges discovery and preclinical validation.
- Operational Value: Yields sufficient RNA quantity (>1 ng per sample) for downstream sequencing applications.
- Scientific Value: Supports translational biomarker discovery by enabling profiling of enteric nervous system targets in human tissue.
Pipeline & Workflow Integration
The LCM workflow fits within the discovery biology phase, enabling hypothesis testing and pathway clarification prior to lead identification. It generates quantitative molecular readouts that inform go/no-go decisions in target selection. The method produces reusable, standardized tissue preparations that support enterprise-scale screening campaigns.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing by isolating pure neuronal populations for molecular profiling.
- Screening: Delivers standardized, high-integrity RNA samples enabling reliable compound effect measurements.
- Analytics: Provides RNA integrity number (RIN) and yield metrics to assess sample quality before sequencing.
- Translational Research: Connects human tissue data to preclinical models through conserved gene expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable protocol for isolating neural tissue across multiple tissue blocks and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, staining, and LCM parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling rapid acquisition of human-validated molecular data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets based on human enteric nervous system expression profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, cryosectioning, and laser-capture microdissection.
- Dependent on cryostat, LCM system, and RNA-compatible staining reagents (e.g., Cresyl Violet).
- Necessitates standardized protocols for tissue flattening, freezing, and section orientation.
- Must account for tissue variability across donors and intestinal regions when scaling.
- Limited by RNA degradation risks if samples are not processed rapidly or kept sufficiently dry.
