Licht vel fluorescentie microscopie 4-dimensionale beelden van de gevolgen van het moduleren van Shear Stress op de ontwikkelingslanden Zebrafish hart
10 augustus 2018
Hier presenteren we een protocol om te visualiseren ontwikkeling van harten in zebrafish in 4 dimensies (4-D). 4-D imaging, via licht-blad fluorescentie microscopie (LSFM), neemt de 3-dimensionale (3-D) beelden na verloop van tijd te reconstrueren ontwikkelende harten. Laten we kwalitatief en kwantitatief dat schuifspanning activeert endocardial Notch signalering tijdens de ontwikkeling van de zaal, die cardiale trabeculation bevordert.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van de mechanobiologie van de hartontwikkeling, zoals de modulatie van afschuifspanning op harttrabekeculatie via notch-signalering met behulp van een 4D-lichtbladmicroscoop. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een dunne sectie van het monster verlicht met een vlak van vijf micrometer, wat leidt tot minder fotobleken en fotoschade. Bovendien stelt ons computationele algoritme ons in staat om een 4D-slaand zebravishart te reconstrueren.
De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de diagnose van aangeboren hartziekten, omdat het de invivo sequentiële visualisatie van de harttrabekeculatie in een vroeg ontwikkelingsstadium tot aan het latere fenotype mogelijk maakt. Over het algemeen zullen mensen die nieuw zijn in deze techniek vinden dat het moeilijk is om zich in drie dimensies te verplaatsen over tijd. Bovendien kost het tijd om het systeem te maken en nauwkeurig uit te lijnen.
Om te beginnen, scheidt u de mannelijke en vrouwelijke zebravissen in de kweektanks door een scheidingswand te gebruiken. Til vervolgens de scheidingswand op en laat de mannelijke en vrouwelijke zebravissen paren. Verzamel de zebravis-embryo's en injecteer morpholino-oligo in het embryo om trabekeculatie te remmen.
Bereid vervolgens een een procent agarosegel voor door één gram agarose toe te voegen aan 100 milliliter gedistilleerd water en verwarm het totdat alle agarose is opgelost. Laat de agarose afkoelen en gebruik vervolgens een 20 microliter pipet om een kleine plastic buis te vullen met een van de voorbereide embryo's en agarose. Bevestig de buis op het microscooptafel en gebruik het tienvoudige objectief.
Stel het objectief in met behulp van de knop zodat de bovenkant van het embryo scherp staat. Maak beelden van het hele vis-embryo over meerdere hartslagcycli met een lichtbladdikte van vijf micrometer. Verzamel 500 xy-frames met een belichtingstijd van tien milliseconden.
Beweeg vervolgens de tafel één micron in de z-as naar een nieuwe laag en herhaal de beeldvormingsprocedure. Blijf 500 frames per z-vlak beelden totdat het hele hart volledig is afgebeeld. Open vervolgens de beeldverwerkingssoftware en begin de beelden in 3D te stapelen.
Om dit te bereiken, klikt u eerst op open gegevens. Selecteer hier alle afbeeldingen die in 3D moeten worden gestapeld en selecteer vervolgens laden. Voeg vervolgens het voxelgrootte van 0,65 bij 0,65 bij een micrometer toe en klik op oké.
Het invoeren van de juiste voxelgrootte is cruciaal voor een nauwkeurige analyse van de 3D-afbeeldingen. Klik nu op de multiplanaire weergave en visualiseer de 3D-afbeelding. Klik met de rechtermuisknop op het blauwe slice one dot tiff-vak, selecteer weergave en klik vervolgens op volran.
In het bewerkingsmenu selecteert u opties en bewerk vervolgens kleurenkaart. Pas de kleur aan met behulp van de vakken en klik vervolgens op oké. Terwijl u nog in de beeldverwerkingssoftware bent, klikt u op bestand en opent u de tijdreeksgegevens.
Selecteer de 3D-tiffs die zojuist zijn gemaakt door op laden te klikken en voer dezelfde voxelgrootte in als eerder. Klik met de rechtermuisknop op het blauwe slice one dot tiff-vak en selecteer vervolgens weergave gevolgd door volran. Klik nu op bewerken.
Selecteer opties. Selecteer vervolgens bewerk kleurenkaart. Pas de kleur aan met behulp van de vakken en klik vervolgens op oké.
Klik vervolgens met de rechtermuisknop op de tijdreekscontrole, klik op filmmaker en druk op de afspeelknop om de film te bekijken. Om af te ronden, voegt u een bestandsnaam toe, framegrootte, framefrequentie, kwaliteit gelijk aan één en voert u monoscopisch in. Klik vervolgens op toepassen.
Exporteer ten slotte de video. Biomechanische krachten, zoals hemodynamische afschuifspanning, zijn nauw verbonden met de hartmorfogenese. Hier werd lichtbladfluorescentiemicroscopie gebruikt om de trabeculair randjes die uitsteken in het ventrikelholte te visualiseren op 75 uur na bevruchting.
Op 100 uur na bevruchting is een trabeculair netwerk duidelijk te zien. In een embryo dat is behandeld met de gata1aMO-microinjectie, worden hematopoëse en viscositeit met 90 procent verminderd. Deze verminderde viscositeit verzwakte de hemodynamische afschuifspanning, wat resulteerde in een vertraagde initiatie en een minder dicht trabeculair netwerk.
Deze vertraging en dichtheid van het trabeculair netwerk kon worden hersteld door de notch-gerelateerde genexpressie op te reguleren, waardoor de trabekulaire formatie werd gered op 75 uur na bevruchting en op 100 uur na bevruchting. Dus, gata1a-morfolino-oligonucleotiden verminderden hemodynamische krachten, wat leidde tot de onderdrukking van notch-signalering, terwijl Nrg1-mRNA-redding notch-gerelateerde genen op regelde en trabekeculatie herstartte. Eenmaal onder de knie, kan deze beeldtechniek worden voltooid in ongeveer twee uur als het goed wordt uitgevoerd.
Na de ontwikkeling ervan, heeft deze techniek de weg geëffend voor onderzoekers op het gebied van hartontwikkeling om de factoren in het notch-gen te bestuderen, die verantwoordelijk zijn voor de juiste vorming van trabekeculatie in zebravissen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u beelden kunt verkrijgen met behulp van selectieve vlakverlichting microscopie en 4D-beeldbestanden kunt maken. Vergeet niet dat het werken met lasers uiterst gevaarlijk kan zijn.
En voorzorgsmaatregelen, zoals het dragen van geschikte brillen, moeten altijd worden genomen tijdens deze procedure.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel presenteert een protocol voor het visualiseren van zich ontwikkelende harten in zebravissen met behulp van 4-D lichtblad-fluorescentiemicroscopie (LSFM). De methode maakt het mogelijk om de hartontwikkeling in de loop van de tijd te reconstrueren, waardoor de rol van schuifspanning bij het activeren van endocardiaal Notch-signalering tijdens de ontwikkeling van de hartkamers wordt onthuld.
Belangrijke studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Ontwikkelingsbiologie
- Cardiac mechanobiologie
- Beeldtechnieken
Achtergrond
- Het begrijpen van hartontwikkeling is cruciaal voor het diagnosticeren van aangeboren hartziekten.
- Schuifspanning beïnvloedt de harttrabeculatie door middel van Notch-signalering.
- 4-D beeldvorming biedt inzichten in dynamische biologische processen.
- Lichtbladmicroscopie minimaliseert fotobleking en schade.
Doel van de studie
- Om hartontwikkeling in zebravissen in real-time te visualiseren.
- Om de effecten van schuifspanning op harttrabeculatie te onderzoeken.
- Om een computationeel algoritme te ontwikkelen voor 4-D hartreconstructie.
Gebruikte methoden
- 4-D lichtblad-fluorescentiemicroscopie (LSFM).
- Reconstructie van kloppende zebravisharten met behulp van computationele algoritmen.
- Sequentiële visualisatie van hartontwikkelingsstadia.
- Analyse van de effecten van schuifspanning op Notch-signalering.
Belangrijkste resultaten
- Schuifspanning activeert endocardiale Notch-signalering tijdens de ontwikkeling van de hartkamers.
- De 4-D beeldtechniek maakt gedetailleerde observatie van harttrabeculatie mogelijk.
- Verminderde fotobleking en schade verbetert de beeldkwaliteit.
- De methode helpt bij het begrijpen van mechanismen van aangeboren hartziekten.
Conclusies
- De 4-D LSFM-techniek is een krachtig hulpmiddel voor het bestuderen van hartontwikkeling.
- De verkregen inzichten kunnen leiden tot betere diagnostische methoden voor aangeboren hartziekten.
- Toekomstige toepassingen kunnen zich uitstrekken tot andere gebieden van de ontwikkelingsbiologie.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Understanding hemodynamic forces in cardiac development provides mechanistic insights into congenital heart disease pathways, supporting target validation in preclinical models. Light-sheet fluorescence microscopy enables quantitative, dynamic visualization of shear stress effects on Notch signaling, a pathway implicated in ventricular non-compaction. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking biomechanical inputs to molecular outputs in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the causal relationship between hemodynamic shear stress and Notch signaling in trabeculation formation.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of genetic and pharmacological modulators of cardiac morphogenesis.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing how reduced shear stress down-regulates Notch target genes and attenuates trabeculation.
- Operational Value: Facilitates rescue experiments, such as Nrg1 mRNA co-injection, to confirm target pathway specificity and reversibility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative 4-D readouts of trabecular density and initiation timing for dose-response analysis.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols across experimental conditions using synchronized light-sheet acquisition and voxel-based reconstruction.
- Scientific Value: Enables shear stress modulation via gata1a-MO to create controlled hypodynamic conditions for assay validation.
- Operational Value: Produces scalable, reproducible 3D+time datasets suitable for high-content analysis pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects endothelial Notch gene expression under pulsatile flow to in vivo trabeculation phenotypes, strengthening translational continuity.
- Operational Value: Provides a preclinical zebrafish model for studying Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy mechanisms.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating molecular rescue (e.g., Nrg1) with phenotypic recovery of trabeculation.
- Operational Value: Supports cross-functional collaboration through shared 4-D visualization platforms for cardiology, genetics, and bioengineering teams.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of mechanotransduction pathways in cardiac development, bridging phenotypic screening to target validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how shear stress modulates Notch signaling during ventricular chamber formation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on trabecular network dynamics for compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Generates synchronized 4-D image stacks with voxel-scale precision, enabling statistical comparison of hemodynamic conditions.
- Translational Research: Links in vivo trabeculation phenotypes to in vitro endothelial flow responses, supporting biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying hemodynamic influences across developmental and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological pathway interpretation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through synchronized 4-D acquisition and computational reconstruction.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early phenotypic assessment of cardiac morphogenesis modifiers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets involved in shear stress-Notch-trabeculation axes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, microinjection techniques, and light-sheet microscopy alignment.
- Dependent on specialized instrumentation including selective plane illumination microscopy and high-speed sCMOS cameras.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition parameters, voxel sizing, and time-series synchronization.
- Involves adaptation considerations when translating protocols across different genetic backgrounds or disease models.
- Limited by the physical accessibility of the embryonic heart and the need for precise temporal sampling across cardiac cycles.
