Identificatie van merkers van de virulentie van Mycobacterium abscessus voor intracellulaire replicatie in fagocyten

Mutant bibliotheek screening en transcriptomische studies van intracellulaire pathogenen kunnen helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over genomische en regelgevende aanpassingen van ziekteverwekkers van belang die worden gebruikt om te overleven in de gastheer. De belangrijkste voordelen van deze technieken zijn dat het grootschalige onderzoekstechnieken zijn en dat ze een objectief inzicht geven in de aanpassing aan het intracellulaire leven. De implicaties van deze technieken breiden zich uit tot de therapie van Mycobacterium abscessus die associëren met deze ziekte door het geven van inzicht in potentiële doelen voor vaccintherapie.

Begin met het kweken van amoebe Acanthamoeba castellani, of Ac, in 30 milliliter Peptone Yeast Glucose medium in 75 vierkante centimeter weefselkweekkolven bij kamertemperatuur. Na een uur gebruik maken van een 25 milliliter pipet om de supernatant te verwijderen, en was de cellen drie keer met 10 milliliter Ac buffer zonder koolstof of stikstof per wasbeurt. Na de laatste wasbeurt, los de amoebe van de bodem van de kolf met een enkele krachtige schudden, en pas de cellen in een Falcon buis, om een vijf keer 10 aan de vijf amoebe per mil concentratie in verse Ac buffer.

Zaad vijf keer 10 tot de vier amoebe per put in een 96-put plaat. Plaats de plaat op 32 graden celsius gedurende een uur zonder te schudden, zodat de drijvende amoebe tropho-zoites zich aan de putten kunnen hechten. Ondertussen, warm de bacteriën op ijs, en voeg vijf microliter van de ontdooide bacteriën aan elke put aan het einde van de incubatie.

Na 1,5 uur bij 32 graden Celsius, gooi de supernatant door het omkeren van de plaat op een stapel steriel gaas in een gesteriliseerde metalen lade onder een rookkap. Was elke put drie keer met 200 microliter verse Ac medium per put. Na de laatste wasbeurt, incubeer de co-cultuur met 20 microliters van vers medium aangevuld met amikacine per put, om eventuele resterende extracellulaire mycobacteriën te elimineren voor twee uur.

Gevolgd door drie wasbeurten in vers Ac medium, zoals net aangetoond. Voeg vervolgens 200 microliters medium toe, aangevuld met verse amikacine aan elke put, gevolgd door de toevoeging van vijf keer 10 aan de zeven warmte geïnactiveerde Escherichia coli-bacteriën. Na 48 uur lyse de cellen met 10 microliter van 10% natrium dodecylsulfaat per goed, gedurende 30 minuten bij 32 graden Celsius, en verspreid vijf microliter van het lysaat op Columbia Agar platen met 5% schapenbloed.

Verdun de lysates verder door 25 microliter steriel water op elke druppel toe te voegen. Als alle lysaten zijn verguld, verzegel dan de platen met plastic paraffinefilm en broed de culturen drie tot vier dagen uit bij 37 graden Celsius. Wanneer kolonies verschijnen op de platen, foto van de culturen en identificeren van de mutanten aangetast voor intracellulaire groei door de deposito's met het laagste aantal bacteriële kolonies.

Voor intracellulaire mycobacteriën RNA extractie, eerst groeien M.abscessus in 7H9 medium aangevuld met glycerol en glucose aan de mid-exponentiële fase in 50 milliliter buizen bij 120 RPM. Aan het einde van de cultuur, was de bacteriën twee keer met 10 milliliter Ac buffer per wasbeurt, en meet de O.D.600 om de bacteriën concentratie te schatten. Voeg vervolgens 8,5 keer 10 toe aan de acht mycobacteriën tot 8,5 keer 10 aan de zes amoebe in 10 milliliter vers Ac-medium voor een incubatietijd van een uur bij 30 graden Celsius en 80 RPM.

Aan het einde van de incubatie, oogst de cellen door centrifugatie, en was de pellet drie keer in 10 milliliter verse Ac buffer per wasbeurt onder dezelfde centrifuge voorwaarden. Dan opnieuw opschorten van de cellen in 10 milliliter verse Ac buffer aangevuld met amikacine om eventuele extracellulaire bacteriën te elimineren, en de cellen in te broeden voor vier uur op 30 graden Celsius en 80 RPM, gevolgd door twee wasbeurten in verse Ac buffer. Na de laatste wasbeurt, opnieuw opschorten de geïnfecteerde amoebe in vier milliliter koude oplossing drie, aangevuld met 280 microliters van beta mercaptoethanol om de amoebe verstoren op ijs gedurende 10 minuten.

Aan het einde van de incubatie, centrifugeren de cel lysaat om de vrijgekomen intracellulaire bacteriën pellet, en opnieuw opschorten van de bacteriële pellet in een milliliter koude oplossing drie. Het is belangrijk om alle supernatant te verwijderen om besmetting met amoebe RNA of proteases te vermijden die de steekproeven zouden kunnen gemaakt hebben. Oogst de vrijgekomen bacteriën met een tweede centrifugatie en schort de pellet opnieuw op in een milliliter extractiebuffer.

Dan incubeer gedurende 24 uur bij negatieve 80 graden Celsius. Breng de mycobacteriële oplossing over in twee milliliter schroefbuizen met zirkoniumkralen tot het 500 microlitergradatiemerk en bewaar de buizen nog eens 24 uur bij negatieve 80 graden Celsius om RNA syn-activering en celontbinding te vergemakkelijken. Op de dag van de analyse ontdooit u de monsters op ijs en lyse de cellen met twee rondes van homogenisatie bij 6000 RPM gedurende 25 seconden, gevolgd door één ronde homogenisatie bij 6000 RPM gedurende 20 seconden.

Tussen elke ronde van homogenisatie, koel de monsters op ijs voor een minuut om RNA afbraak te voorkomen. Na de derde ronde van homogenisatie, koel de monsters op ijs gedurende 20 minuten, en voeg 200 microliter van chloroform verdund in isoamyl alcohol aan elke buis. Vortex voor een minuut, dan centrifugeren de monsters, en voeg 0,8 milliliter koude isopropanol aan de waterige fase voor een twee tot drie uur incubatie bij negatieve 20 graden Celsius.

Aan het einde van de incubatie, centrifugeren de monsters opnieuw, en was de pellets in 500 microliters van koude 70%ethanol zonder te mengen. Verwijder vervolgens onmiddellijk de ethanol door middel van centrifugatie. Aspirate de supernatant voor het drogen van de pellets in een centrifugale concentrator, en opnieuw op te schorten de pellets in 100 microliters van DNA / RNA-vrij water.

Mycobacteriële MRNA extractie zoals aangetoond, maakt de evaluatie van geïnduceerde en onderdrukte genfamilies door het groeperen van de genen op basis van hun rol in het reageren op een omgeving beperkt in zijn bron van voedingsstoffen en mineralen, of een hypoxische of een zure omgeving. In de weerstand tegen oxidatieve en nitrosatieve stress, of in de expressie van virulentiefactoren in reactie op milieubemoebe. Tijdens een poging tot deze procedures, is het belangrijk om te onthouden om de cultuur en RNA isolatie van de gecontroleerde en geïnfecteerde monsters uit te voeren op hetzelfde moment om batch-effecten te voorkomen.

Na deze procedure kunnen andere methoden zoals dubbele RNA-sequencing worden voorgevormd om aanvullende vragen over interacties met gastpathogen te beantwoorden. Na de ontwikkeling maakte deze techniek de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van microbiologie naar mycobacteria virulentie in het amoebe host model. Vergeet niet dat het werken met amoebe zeer gevaarlijk kan zijn, omdat de amoebe zou kunnen transformeren in cysten als u de stappen die in de procedure worden beschreven niet volgt.