Kwantificeren van de kolonisatie van Vibrio cholerae en diarree in het volwassen Zebrafish Model

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het vibrio cholerae-veld, zoals hoe de vibrio cholerae zich in de Quiet Coast koloniseert en concurreert met de darmmicrobiota om een niche te vestigen. Het grote voordeel van deze techniek is dat vissen een natuurlijke vibrio cholerae-gastheer zijn, zodat we de volledige vibrio cholerae-levenscyclus kunnen bestuderen. De procedure zal worden gedemonstreerd door Dhrubajyoti Nag, een postdoc uit mijn laboratorium en Paul Breen, een Ph.D.-student uit mijn laboratorium.

Nadat de V.cholerae-culturen zijn voorbereid, inoculeert u de zebravis door middel van immersie. Plaats eerst vier of vijf zebravissen in een beker van 400 milliliter met 200 milliliter steriele infectiewater. Voeg vervolgens één milliliter V.cholerae-cultuur toe voor de gewenste infectieconcentratie.

Bedek vervolgens de beker met een geperforeerd deksel. Nadat alle bekers zijn voorbereid, brengt u ze over naar een glazen voorkantincubator ingesteld op 28 graden Celsius. Voor een tijdelijke blootstelling, na ongeveer zes uur, giet u het bekerwater door een visnet om de vissen te verzamelen. Het besmette water moet worden weggegooid in bleekmiddel om de bacteriën te doden.

Plaats vervolgens de vissen gedurende vijf minuten in 200 milliliter steriele infectiewater. Na vijf minuten laat u dit water door een visnet lopen, waarbij het water in bleekmiddel wordt weggegooid. Nu kunnen de vissen in een nieuwe schone beker met 200 milliliter steriele infectiewater worden geplaatst.

Wanneer het experiment het gewenste eindpunt heeft bereikt, neemt u een monster van 15 milliliter van het infectiewater voor diagnostische doeleinden. Verzamel vervolgens de vissen en doe het besmette water op de juiste manier weg. Richt de buikzijde omhoog en zet het lichaam vast met een speld door de onderkaak en nog een speld net achter de anus.

Richt beide spelden weg van het lichaam. Veeg vervolgens het buikoppervlak van de vis af met 70%ethanol. Steriliseer vervolgens een scalpel en Vannas-schaar door 70%ethanol en een vlam te gebruiken.

Maak nu met het scalpel een kleine lengte-incisie in de buik die de schubben doorboort, maar snijd niet dieper dan de huid. Vervolgens, met de schaar, verlengt u de incisie voorzichtig langs de lengte van het lichaam, niet dieper snijdend dan de huid. Vermijd het snijden van de anus.

Maak vervolgens twee zijsneden richting het hoofd om de opening te vergroten. Speld vervolgens de huid aan elke kant van de laterale incisies op het dissectieoppervlak, waarbij de spelden uitwaarts worden geplaatst, weg van het lichaam. Het darmkanaal zou nu zichtbaar moeten zijn als een zeer dunne, bleke buis.

Gebruik nu twee paar vlammen gesteriliseerde pincetten om voorzichtig het hele darmkanaal te verwijderen, dat behoorlijk kwetsbaar kan zijn. Breng het weefsel over in een homogenisatiebuis met glaskralen en één milliliter koude buffer. Homogeniseer vervolgens de weefsels zoals beschreven in het tekstprotocol en kwantificeer de darmkolonisatieniveaus.

Maak vervolgens seriële verdunningen van het darmhomogenaat en buffer. Bereid voor elke vis vijf of zes tienvoudige verdunningen in volumes van één milliliter. Vorm de buisjes om te mengen.

Plateer vervolgens 100 tot 200 microliter van elke verdunning op LB-agarplaten met streptomycine en X-gal. Bewaar de platen bij 30 graden Celsius gedurende 16 tot 18 uur. Na de overnachtelijke incubatie telt u de V.cholerae-kolonies op de platen.

Deze bacteriën produceren typisch lichtblauwe kolonies op LB-medium met X-gal. Als er verschillende koloniemorfologiën worden waargenomen, plakt u enkele kolonies van elke verschillende morfologie op een andere TCBS-plaat. Op TCBS produceert V.cholerae grote, licht afgeplatte gele kolonies met ondoorzichtige centra en transparante periferieën.

Om de mucineniveaus in visdiarree te bepalen, voert u een test uit op een 96-wellsplaat. Laad in drievoud 100 microliter infectiewater voor elke testvoorwaarde, inclusief een blanco, in de putjes. Meng vervolgens 50 microliter verse 0,1% periodezuuroplossing in elke testput.

Gebruik pijpetten om te mengen. Wikkel vervolgens de plaat strak in plastic en bewaar de plaat bij 37 graden Celsius gedurende één tot anderhalf uur. Koel de plaat na de incubatie af tot kamertemperatuur.

Voeg in elke put 100 microliter Fuchsin-oplossing toe en meng met pijpetten. Wikkel de plaat nu weer in en zet deze op een rocker bij kamertemperatuur. Lees de plaat in ongeveer 20 minuten op 560 nanometer met behulp van een plaatlezer.

Om de reactie veroorzaakt door mucine in oplossing te kwantificeren. Gebruik de Bradford-test om eiwitniveaus in visdiarree te meten. Meng 66 microliter van een van de BSA-standaarden of 66 microliter infectiewater met 1.000 microliter Bradford-testreagens in een wegwerpcuvet.

Incubeer de monsters vervolgens twee minuten bij kamertemperatuur. Lees vervolgens de absorptie bij 660 nanometer op een spectrofotometer. Een eenvoudige maatstaf voor de hoeveelheid diarree is de turbiditeit in het water gemeten bij 600 nanometer.

Meng het water goed, voeg één milliliter toe aan een wegwerpcuvet en neem een meting. Gebruik voor een baseline, blanco meting, schoon infectiewater. De uitgescheiden V.cholerae-bacteriën kunnen ook worden gemeten.

Dit kan worden gedaan met vissen die naar schoon water zijn verplaatst na te zijn geïnoculeerd. Maak seriële verdunningen van een aliquot van het tankwater zoals eerder beschreven. Plateer vervolgens de verdunningen op selectieve media en bewaar de platen bij 30 graden Celsius gedurende 24 uur.

Later telt u de kolonies zoals eerder beschreven en bepaalt u vervolgens de CFU. Groepen zebravissen die in 200 milliliter water werden gehuisvest, werden geïnoculeerd met vijf miljoen CFU van een pandemie cholerae. Na zes uur in het met bacteriën besmette water, verplaatsen de vissen zich gedurende 18