Name: Methodologie voor nauwkeurige detectie van mitochondriaal DNA methylatie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Leer een bisulfietsequencingprotocol en bio-informatica-pijplijn voor nauwkeurige kwantificering van mitochondriaal DNA-methylatie. Deze methode lineariseert mtDNA met BamHI-vertering voor betrouwbare resultaten in mito-epigenetisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De Novo Nordisk Stichting Centrum voor metabole basisonderzoek is een onafhankelijke onderzoekscentrum aan de Universiteit van Kopenhagen gedeeltelijk gefinancierd door een onbeperkte donatie van de Novo Nordisk Foundation.

1. restrictie-enzym behandeling
<ol><li>Linearize mtDNA door de behandeling van de totale menselijke DNA met de restrictie-enzym BamHI, dat op positie 14258 in de menselijke mitochondriaal DNA snijdt. Opmerking: Voor muis DNA, gebruikt u de restrictie-enzym BglII onder identieke omstandigheden zoals hieronder.</li>
	<li>Voor elk monster waar mtDNA methylering is om te worden beoordeeld, bereiden van één 0,2 mL reactiebuis en toevoegen van de volgende mix: 3 μg genomic DNA (gekwantificeerd door fluorometry), 15 μL Buffer 3, 3 μL BamHI en water tot van 150 μl</li>
	<li>Plaatsen van de buizen in een thermische cycler gedurende 4 uur bij 37 ° C.</li>
</ol>2. Bisulfiet Omzetting
<ol><li>BamHI-behandelde DNA met behulp van natrium bisulfiet zoals elders beschreven29converteren.</li>
	<li>200-500 ng BamHI-behandelde DNA gebruiken voor elke reactie van de conversie in een totaal volume van 20 μL. Het DNA-herstel is 50-70%.</li>
	<li>Elueer de DNA bisulfiet-omgezet in 10 μL elutie buffer.</li>
	<li>Kwantificeren van de single-stranded DNA door fluorometry.</li>
	<li>Optioneel: Slaan bisulfiet-geconverteerde DNA bij-20 ° C alvorens de rest van het protocol. Voor langdurige opslag, opslaan bisulfiet-geconverteerde DNA bij-80 ° C</li>
</ol>3. ontwerp van bisulfiet Sequencing Primers
<ol><li>Het ontwerpen van inleidingen voor bisulfiet sequencing met behulp van de online hulpmiddelen Methprimer30 en3231,BiSearch. Nota: Methprimer en BiSearch toestaan te zoeken voor primer bindende opeenvolgingen in genomic opeenvolgingen waar cytosines worden omgezet in thymines, op dezelfde manier tot na bisulfiet behandeling.</li>
	<li>Voor optimale en onbevooroordeelde versterking, Vermijd apr dinucleotides in de inleidingen en de grootte van de amplicon tussen 100-300 bp ontwerpen.</li>
	<li>Ervoor zorgen dat ontworpen primers specifiek voor het mitochondriaal DNA met BiSearch de functie Primer zoeken. Plaats de reeds ontworpen bisulfiet geconverteerd inleidingen, Vink het vakje bisulfiet en omvatten een verwijzing genoom en PCR parameters. Opmerking: Een lijst van mogelijke PCR producten worden getoond.</li>
	<li>Kopieer de top 1-5 primer sequenties en plak ze in een bestelformulier voor oligonucleotide synthese. Opmerking: Een lijst van mens en muis mtDNA primer sequenties die is gevalideerd in het laboratorium wordt weergegeven in tabel 1.</li>
	<li>Test inleidingen met behulp van bisulfiet geconverteerd PCR na agarose gelelektroforese zoals beschreven in stap 4. Test en optimaliseren van alle primerparen afzonderlijk en controleer dat de grootte van de juiste amplicon wordt weergegeven op de agarose gel. Opmerking: Als multiplexing inleidingen nodig zijn, toevoegen meerdere inleidingen op een single van PCR reactie en visualiseren van de PCR producten op agarose gelelektroforese of, op een meer ontbindende methode zoals polyacrylamide gelelektroforese, te onderscheiden van vergelijkbare producten grootte.</li>
</ol>4. bisulfiet geconverteerd PCR en Gel extractie
<ol><li>Uitvoeren om te versterken van de regio's van belang, PCR met behulp van een warme start Taq polymerase. Kort, mix 100 ng geconverteerd DNA, 500 µM gevoel en anti-gevoel inleidingen, 1 µL dNTP mix (10 µM van elke dNTP) en polymerase op 7.5 U/reactie in een totaal volume van 50 µL. PCR uitvoeren met de volgende voorwaarden: 5 min bij 95 ° C (60 s 94 ° C; 60 s 55 ° C *; 60 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 cycli; 10 min 72 ° C. Inleidingen hetzij afzonderlijk gebruiken of multiplex.</li>
	<li>Optioneel: Wanneer multiplexing inleidingen, gebruik 200 ng geconverteerd DNA en fietsen oorzaken: 5 min 95 ° C (60 s 94 ° C; 90 s 55 ° C *; 90 s 72 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 35 cycli; 10 min 72 ° C. Opmerking: De temperatuur kan variëren afhankelijk van de smelttemperatuur van inleidingen.</li>
	<li>Onderwerp PCR producten gel elektroforese op 2% agarose op 100 volt.</li>
	<li>Onder zachte UV-licht, pak van PCR producten met een scalpel en toevoegen aan slangen. Niet blootstellen PCR producten aan buitensporige UV-licht om DNA-schade te voorkomen. Vermijd blootstellingstijd meer dan 30 s.</li>
	<li>De PCR-producten met behulp van gel zuivering zoals eerder beschreven3zuiveren.</li>
	<li>Kwantificeren van de gezuiverde DNA uit stap 4.5 met behulp van fluorometry. Gaat u verder met stap 5 of winkel monsters bij-20 ° C.</li>
</ol>5. bisulfiet Sequencing bibliotheek voorbereiding
<ol><li>Bibliotheek bereiding van bisulfiet-geconverteerde PCR producten uitvoeren. Optioneel: multiplex PCR producten in dit stadium.</li>
	<li>Einde-reparatie met behulp van maximaal 100 uitvoeren ng van PCR product. 3 µL einde prep enzym en 6.5 µL einde reparatie reactie buffer (10 x) toevoegen aan 55,5 µL PCR product in een 0,2 mL-buis. Plaats en incubeer buis in een thermische cycler gedurende 30 minuten bij 20 ° C, gevolgd door 30 minuten bij 65 ° C.</li>
	<li>Sequencing adapters afbinden door het mengen van de einde-gerepareerd DNA met 15 µL Blunt/TA ligase mix, 2.5 µL adapter en 1 µL afbinding versterker. Als met behulp van < 100 ng PCR product als input, Verdun adapter 10 keer.</li>
	<li>Plaats van de mix (stap 5.3) in een thermische cycler en incubeer 15 min bij 20 ° C. De thermische cycler onderbreken en voeg 3 µl gebruiker enzym aan de buis. Mengen en plaats de buis terug in de thermische cycler en incubeer 15 min bij 37 ° C.</li>
	<li>Grootte selecteren het DNA adapter-afgebonden met vaste fase omkeerbare immobilisatie (SPRI) kralen met verschillende verhoudingen van kralen aan DNA afhankelijk van de grootte van PCR product.</li>
	<li>13.5 µL H2O aan adapter-afgebonden DNA uit stap 5.4 en 55 µL geresuspendeerde SPRI kralen toevoegen. Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min en plaats buis op een magnetische voet. Wanneer de oplossing duidelijk is, het supernatant overbrengen in een nieuwe buis en negeren van de buis met de kralen. Opmerking: Het supernatant bevat het DNA adapter-afgebonden en grote ongewenste fragmenten zijn gebonden aan de afgedankte kralen.</li>
	<li>Vanuit stap 5.6 25 µL geresuspendeerde SPRI kralen toevoegen aan het supernatant, meng en laat 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken. Plaats de buis op de magnetische stand en verwijder het supernatant wanneer de oplossing duidelijk is. Opmerking: De verwijderde supernatans bevat ongewenste DNA, terwijl de adapter-afgebonden DNA is gebonden aan kralen.</li>
	<li>Terwijl de buis op de magnetische stand is, voeg toe 200 µL 80% ethanol (vers bereid) om te wassen van de kralen. Incubeer 30 s en verwijderen en negeren de bovendrijvende substantie. Herhaal deze stap voor een totaal van 2 wasbeurten.</li>
	<li>Lucht droog kralen voor 5 min terwijl de buis op magnetische stand met een open deksel is.</li>
	<li>Verwijderen van de buis van de magneet, Elueer van het DNA in 23 µL elutie buffer en meng. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 2 minuten.</li>
	<li>Plaats de buis op een magnetische standaard en als de oplossing duidelijk is, 2 µL overbrengen in een 96-Wells PCR plaat voor de pre-PCR versterking (stap 5.14).</li>
	<li>Breng de rest ongeveer 21 µL tot een nieuwe 0,2 mL koker voor PCR versterking (stap 5.17). Opmerking: Zorg dat niet alle kralen overdragen zoals kralen enzymatische reacties van volgende stappen kunnen remmen.</li>
	<li>Ga door naar stap 5.14 of winkel monsters bij-20 ° C.</li>
	<li>Uitvoeren van pre-PCR versterking door RT-qPCR te schatten het aantal cycli dat nodig om de adapter-afgebonden DNA te vergroten. Per reactie toevoegen de volgende handelingen uit in de 96-Wells-PCR plaat met 2 µL DNA (stap 5.11): 0.4 µL Index primer 0.4 µL universele PCR primer, 7.2 µL H2O, 10 µL RT-qPCR master mix.</li>
	<li>Plaats de plaat in een real-time PCR-machine en de plaat die aan de volgende voorwaarden onderworpen: 30 bij 98 ° C s (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> 20 cycli; 5 min 65 ° C.</li>
	<li>Schatten van het aantal cycli van versterking nodig voor elk monster door een Ct-waarde met de Ct-waarden van de versterking van de pre-RT-qPCR overeenkomt met het einde van de lineaire fase van de PCR reactie af te trekken.</li>
	<li>De adapter-afgebonden DNA uit stap 5.12 versterken door het mengen van: 21 µL DNA, 25 µL PCR master mix, 1 µL Index primer, 1 µL universele PCR primers en 2 µL H2O. In een thermische cycler, elke steekproef aan de volgende voorwaarden onderworpen: 30 bij 98 ° C s (10 s 98 ° C; 75 s 65 ° C) <img alt="arrow" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq2.jpg"> [berekende Ct vanaf stap 5.16] cycli; 5 min 65 ° C. Opmerking: Vergeet niet om slechts één Index primer per monster om multiplexing mogelijk te maken. De index wordt ingevoegd tijdens de PCR.</li>
	<li>Zuiveren van de versterkte DNA SPRI-kralen en elueer in 22 µL elutie buffer.</li>
	<li>Controle van bibliotheek kwaliteit door gel elektroforese of alternatieve methode. Zoek naar de juiste bibliotheek piek maten (PCR product grootte plus adapter).</li>
	<li>Schatting van de gemiddelde basenpaar grootte van de bibliotheek product(en) door uitstrijkje analyse: In geavanceerde globale instellingen, dubbelklik op "tabel" onder uitstrijkje analyse. De regio van 100-1000 bp definiëren en klik op OK. Onder Regio tabelde gedefinieerde regio verschijnt en gemiddelde grootte van de bibliotheek (bp) wordt berekend.</li>
	<li>Kwantificeren bibliotheken door fluorometry. Gaat u verder met stap 6 of winkel bibliotheken bij-20 ° C.</li>
</ol>6. volgende generatie Sequencing
<ol><li>Bereken de concentratie van de nM van bibliotheken met behulp van de formule: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57772/57772eq1.jpg">
</li>
	<li>Verdun bibliotheken aan de dezelfde nM concentratie BV 2 nM (Kies 4 nM, 2 nM, 1 nM, of 0,5 nM afhankelijk van concentraties van de bibliotheek). Het zwembad van alle bibliotheken om een pool van 2 nM bibliotheken.</li>
	<li>Denatureren en Verdun bibliotheken na de sequencing instrument gids. Kortom: de 2 nM zwembad denatureren door toevoeging van 0,2 N NaOH en Incubeer bij kamertemperatuur voor 5 min. Dilute het gedenatureerde zwembad tot een uiteindelijke verdunning van 10 pM. Denatureren en Verdun een verkrijgbare Control library naar een uiteindelijke verdunning van 12.5 pM. Meng tot een nieuwe koker, het zwembad 10 pM met 20% 12.5 pM Control library. Opmerking: Bisulfiet Omzetting introduceert zeer lage complexiteit. 20% controle bibliotheek spike-in zal leiden tot betere rangschikken.</li>
	<li>Voer een 150 bp gekoppeld-einde sequencing met behulp van een diepe sequencing-instrument.</li>
</ol>7. computationele analyse - schatting Methylation niveaus
<ol><li>Genereren .fastq bestanden (hier sample1_R1.fastq.gz en sample1_R2.fastq.gz genoemd), het genereren van een index Bismark (Altmark) van het volledige genoom van belang (hier in een map met de naam bismarkIndex) en ervoor te zorgen dat de genomic volgorde van chrM beschikbaar in fasta is formaat (hier in een map met de naam chrM).</li>
	<li>Vooraf verwerken leest Schakel adapters en bias geïntroduceerd door de inleidingen: gebruik het hulpprogramma Trim_galore33. Verwijder twee nucleotiden aan het einde 5' van de voorwaartse en omgekeerde luidt. trim_galore--clip_R1 2--clip_R2 2 -o. /--trim1--gekoppeld sample1_R1.fastq.gz sample1_R2.fastq.gz</li>
	<li>Uitlijnen van voorbewerkte leest aan het hele genoom van Bismark (Altmark)34 Bismark (Altmark)--Zwaluwstaart--bam -o. /. / bismarkIndex / -1./sample1_R1_val_1.fq.gz -2./sample1_R2_val_2.fq.gz Opmerking: Als een ander aligner wordt gebruikt, zorg ervoor dat leest die uniek kunnen niet worden uitgelijnd worden genegeerd.</li>
	<li>Uittreksel leest toewijzing aan het chromosoom M, hier met behulp van Samtools35 samtools sorteren -l 0 - O BAM -o sample1_sorted.bam sample1_R1_val_1_bismark_bt2_pe.BAM samtools index sample1_sorted.bam samtools bekijken -u sample1_sorted.bam chrM | samtools sorteren - n - O BAM -o sample1_chrM.bam</li>
	<li>Haal de methylering informatie bismark_methylation_extractor -p--CX--cytosine_report--uitgebreide--genome_folder. / chrM./sample1_chrM.bam</li>
	<li>De .bedGraph, de cov of de CX_report.txt-bestanden gebruiken voor verdere analyse. Het sample1_chrM.CX_report.txt-bestand gebruikt voor visualisatie en testen.</li>
	<li>Uitvoeren verder knippen in de pre-processing stap, als meerdere regio's zijn ondervraagd en een primer vertekening zichtbaar in de percelen van de M-bias gegenereerd tijdens de toewijzing kan worden Raadpleeg de documentatie van de Bismark (Altmark) voor meer informatie.</li>
</ol>8. rekenkundige analyse - Test van verschillen
<ol><li>Ervoor zorgen dat het bestand CX_report.txt 7 kolommen, chromosoom (hier chrM), positie, strand, aantal gemethyleerd leest, aantal unmethylated leest, C context en omliggende sequentie, voor elke C op chromosoom M bevat.</li>
	<li>Aangezien de CX_report chrM in zijn geheel dekt, Controleer de subset aan de regio('s) die wordt versterkt.</li>
	<li>Gebruik niet-parametrische tests voor verschillen tussen monsters, zoals een vissers de exacte test voor individuele C's of een teken-voor een hele regio. Opmerking: Kwantificering vaak worden dicht bij methylation van 0%, dat is de reden waarom het uitgaande van normaliteit niet geschikt is.</li>
	<li>Ook voor visualisatie, visualiseren van quantiles of berekenen binomiale aandeel betrouwbaarheidsintervallen.</li>
</ol>

<ol><li>Falkenberg, M., Larsson, N. -G., Gustafsson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+and+transcription+in+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA replication and transcription in mammalian mitochondria.</a> Annu Rev Biochem. 76, 679-699 (2007).</li>
<li>Kolesar, J. E., Wang, C. Y., Taguchi, Y. V., Chou, S. -H., Kaufman, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+intact+mitochondrial+DNA+agarose+electrophoresis+reveals+the+structural+complexity+of+the+mammalian+mitochondrial+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional intact mitochondrial DNA agarose electrophoresis reveals the structural complexity of the mammalian mitochondrial genome.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e58(2013).</li>
<li>Mechta, M., Ingerslev, L. R., Fabre, O., Picard, M., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+Suggesting+Absence+of+Mitochondrial+DNA+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Evidence Suggesting Absence of Mitochondrial DNA Methylation.</a> Front Genet. 8, 166(2017).</li>
<li>Ehrlich, M., Gama-Sosa, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amount+and+distribution+of+5-methylcytosine+in+human+DNA+from+different+types+of+tissues+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Amount and distribution of 5-methylcytosine in human DNA from different types of tissues of cells.</a> Nucleic Acids Res. 10 (8), 2709-2721 (1982).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li>
<li>Yan, J., Zierath, J. R., Barres, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+non-CpG+methylation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Evidence for non-CpG methylation in mammals.</a> Exp Cell Res. 317 (18), 2555-2561 (2011).</li>
<li>Patil, V., Ward, R. L., Hesson, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evidence+for+functional+non-CpG+methylation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">The evidence for functional non-CpG methylation in mammalian cells.</a> Epigenetics. 9 (6), 823-828 (2014).</li>
<li>Nass, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+methylation+of+mitochondrial+and+nuclear+DNA+in+cultured+mouse%2C+hamser+and+virus+trasnforemd+hamser+cells+in+vivo+and+in+vitro+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential methylation of mitochondrial and nuclear DNA in cultured mouse, hamser and virus trasnforemd hamser cells in vivo and in vitro methylation.</a> J Mol Biol. 80 (1), 155-175 (1973).</li>
<li>Shock, L. S., Thakkar, P. V., Peterson, E. J., Moran, R. G., Taylor, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+methyltransferase+1%2C+cytosine+methylation%2C+and+cytosine+hydroxymethylation+in+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">DNA methyltransferase 1, cytosine methylation, and cytosine hydroxymethylation in mammalian mitochondria.</a> PNAS. 108 (9), 3630-3635 (2011).</li>
<li>Bellizzi, D., D'Aquila, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Control+Region+of+Mitochondrial+DNA+Shows+an+Unusual+CpG+and+Non-CpG+Methylation+Pattern%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Res%22%5BJournal%5D)">The Control Region of Mitochondrial DNA Shows an Unusual CpG and Non-CpG Methylation Pattern.</a> DNA Res. 20 (6), 537-547 (2013).</li>
<li>Jia, Y., Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Low-Protein+Diet+Affects+Epigenetic+Regulation+of+Hepatic+Mitochondrial+DNA+Transcription+in+a+Sex-Specific+Manner+in+Newborn+Piglets+Associated+with+GR+Binding+to+Its+Promoter%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Maternal Low-Protein Diet Affects Epigenetic Regulation of Hepatic Mitochondrial DNA Transcription in a Sex-Specific Manner in Newborn Piglets Associated with GR Binding to Its Promoter.</a> PLoS ONE. 8 (5), e63855(2013).</li>
<li>Jia, Y., Song, H., Gao, G., Cai, D., Yang, X., Zhao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+Betaine+Supplementation+during+Gestation+Enhances+Expression+of+mtDNA-Encoded+Genes+through+D-Loop+DNA+Hypomethylation+in+the+Skeletal+Muscle+of+Newborn+Piglets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Agric+Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Maternal Betaine Supplementation during Gestation Enhances Expression of mtDNA-Encoded Genes through D-Loop DNA Hypomethylation in the Skeletal Muscle of Newborn Piglets.</a> J Agric Food Chem. 63 (46), 10152-10160 (2015).</li>
<li>Infantino, V., Castegna, A., Iacobazzi, F., Spera, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairment+of+methyl+cycle+affects+mitochondrial+methyl+availability+and+glutathione+level+in+Down%27s+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">Impairment of methyl cycle affects mitochondrial methyl availability and glutathione level in Down's syndrome.</a> Mol Genet Metab. 102 (3), 378-382 (2011).</li>
<li>Chen, H., Dzitoyeva, S., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+valproic+acid+on+mitochondrial+epigenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Effect of valproic acid on mitochondrial epigenetics.</a> Eur J Pharmacol. 690 (1-3), 51-59 (2012).</li>
<li>Dzitoyeva, S., Chen, H., Manev, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+5-hydroxymethylcytosine+in+brain+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on 5-hydroxymethylcytosine in brain mitochondria.</a> Neurobiol Aging. 33 (12), 2881-2891 (2012).</li>
<li>Menga, A., Palmieri, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SLC25A26+overexpression+impairs+cell+function+via+mtDNA+hypermethylation+and+rewiring+of+methyl+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">SLC25A26 overexpression impairs cell function via mtDNA hypermethylation and rewiring of methyl metabolism.</a> FEBS J. 284 (6), 967-984 (2017).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> PNAS. 89 (5), 1827-1831 (1992).</li>
<li>Byun, H. -M., Panni, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+airborne+pollutants+on+mitochondrial+DNA+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Effects of airborne pollutants on mitochondrial DNA Methylation.</a> Part Fibre Toxicol. 10 (1), 1(2013).</li>
<li>Janssen, B. G., Byun, H. -M., Gyselaers, W., Lefebvre, W., Baccarelli, A. A., Nawrot, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Placental+mitochondrial+methylation+and+exposure+to+airborne+particulate+matter+in+the+early+life+environment%3A+An+ENVIRONAGE+birth+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Placental mitochondrial methylation and exposure to airborne particulate matter in the early life environment: An ENVIRONAGE birth cohort study.</a> Epigenetics. 10 (6), 536-544 (2015).</li>
<li>Zheng, L. D., Linarelli, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+is+associated+with+epigenetic+and+genetic+regulation+of+mitochondrial+DNA+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance is associated with epigenetic and genetic regulation of mitochondrial DNA in obese humans.</a> Clin Epigenetics. 7 (1), 1739(2015).</li>
<li>Byun, H. -M., Colicino, E., Trevisi, L., Fan, T., Christiani, D. C., Baccarelli, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Air+Pollution+and+Blood+Mitochondrial+DNA+Methylation+on+Markers+of+Heart+Rate+Variability%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Effects of Air Pollution and Blood Mitochondrial DNA Methylation on Markers of Heart Rate Variability.</a> J Am Heart Assoc. 5 (4), (2016).</li>
<li>Bianchessi, V., Vinci, M. C., et al. Mitochondrion. MITOCH. 27 (C), 40-47 (2016).</li>
<li>Wijst, M. G. P., van Tilburg, A. Y., Ruiters, M. H. J., Rots, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+mitochondria-targeted+DNA+methylation+identifies+GpC+methylation%2C+not+CpG+methylation%2C+as+potential+regulator+of+mitochondrial+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Experimental mitochondria-targeted DNA methylation identifies GpC methylation, not CpG methylation, as potential regulator of mitochondrial gene expression.</a> Sci Rep. 7 (1), 177(2017).</li>
<li>Wong, M., Gertz, B., Chestnut, B. A., Martin, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNMT3A+and+DNA+methylation+in+skeletal+muscle+and+CNS+of+transgenic+mouse+models+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Front+cellr+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNMT3A and DNA methylation in skeletal muscle and CNS of transgenic mouse models of ALS.</a> Front cellr Neurosci. 7, 279(2013).</li>
<li>Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-methylcytidylic+acid%3A+absence+from+mitochondrial+DNA+of+frogs+and+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">5-methylcytidylic acid: absence from mitochondrial DNA of frogs and HeLa cells.</a> Science. 184 (4132), 80-81 (1974).</li>
<li>Gama-Sosa, M. A. <a target="_blank" href="http://www.worldcat.org/title/levels-and-distribution-of-5-methylcytosine-in-chordate-dna/oclc/15059352">Levels and distribution of 5-methylcytosine in Chordate DNA</a>. , 1-201 (1985).</li>
<li>Hong, E. E., Okitsu, C. Y., Smith, A. D., Hsieh, C. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regionally+specific+and+genome-wide+analyses+conclusively+demonstrate+the+absence+of+CpG+methylation+in+human+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regionally specific and genome-wide analyses conclusively demonstrate the absence of CpG methylation in human mitochondrial DNA.</a> Mol Cell Biol. 33 (14), 2683-2690 (2013).</li>
<li>Liu, B., Du, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CpG+methylation+patterns+ofhuman+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">CpG methylation patterns ofhuman mitochondrial DNA.</a> Nature Publishing Group. , 1-10 (2016).</li>
<li>Donkin, I., Versteyhe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+Bariatric+Surgery+Drive+Epigenetic+Variation+of+Spermatozoa+in+Humans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Obesity and Bariatric Surgery Drive Epigenetic Variation of Spermatozoa in Humans.</a> Cell Metab. 23 (2), 369-378 (2016).</li>
<li>Li, L. C., Dahiya, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MethPrimer%3A+designing+primers+for+methylation+PCRs%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MethPrimer: designing primers for methylation PCRs.</a> Bioinformatics. 18 (11), 1427-1431 (2002).</li>
<li>Tusnády, G. E., Simon, I., Váradi, A., Arányi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BiSearch%3A+primer-design+and+search+tool+for+PCR+on+bisulfite-treated+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">BiSearch: primer-design and search tool for PCR on bisulfite-treated genomes.</a> Nucleic Acids Res. 33 (1), e9(2005).</li>
<li>Arányi, T., Váradi, A., Simon, I., Tusnády, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BiSearch+web+server%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The BiSearch web server.</a> BMC bioinformatics. 7, 431(2006).</li>
<li>Krueger, F. Trim Galore!. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/</a> (2018).</li>
<li>Krueger, F., Andrews, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bismark%3A+a+flexible+aligner+and+methylation+caller+for+Bisulfite-Seq+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications.</a> Bioinformatics. 27 (11), 1571-1572 (2011).</li>
<li>Li, H., Handsaker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sequence+Alignment%2FMap+format+and+SAMtools%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li>
<li>Ramos, A., Barbena, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+insertions+of+mitochondrial+origin%3A+Database+updating+and+usefulness+in+cancer+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Nuclear insertions of mitochondrial origin: Database updating and usefulness in cancer studies.</a> Mitochondrion. 11 (6), 946-953 (2011).</li>
<li>Warnecke, P. M., Stirzaker, C., Song, J., Grunau, C., Melki, J. R., Clark, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+resolution+of+artifacts+in+bisulfite+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Identification and resolution of artifacts in bisulfite sequencing.</a> Methods (San Diego, Calif). 27 (2), 101-107 (2002).</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen te verklaren.

Wij bieden hier een bisulfiet-sequencing-protocol die speciaal bedoeld is om te ondervragen mtDNA methylering. De verschillen met bisulfiet-sequencing protocollen die worden gebruikt voor genomic DNA ligt in het gebruik van een voorafgaande restrictie-enzym spijsvertering stap en een analyse van bioinformatic uitspraak uit de valse positieve die voortvloeien uit NUMT sequenties.
Wij bieden een protocol Voorkom bisulfiet-sequencing artefacten bij het onderzoeken van mtDNA methylering. Bisulfiet...

Het mitochondriaal genoom is een circulaire, double-stranded structuur van ongeveer 16,5-kilo base (kb) lang, die deel uitmaken van een zware en een lichte onderdeel. Het mitochondriaal genoom is aanwezig in meerdere exemplaren binnen elke cel, maternally-geërfd, en codeert van essentiële componenten van de respiratoire keten complexen1. Gelijkaardig aan bacteriële genoom en in tegenstelling tot het nucleair genoom, het mitochondriaal genoom is georganiseerd in talrijke secundaire en tertiaire structuren, zoals in opgerolde en supercoiled structuren2, die toegang tijdens sequencing bemoeilijken kan experimenten-3.
In de kern is methylation van DNA een uitgebreid bestudeerde epigenetische teken dat een rol in tal van processen, met name in de regulatie van genexpressie speelt. Methylation van DNA doet zich voor in zoogdieren genomen, hoofdzakelijk op de 5-positie van de pyrimidine-ring van deoxycytidines, meestal op CG dinucleotides (of APR). Cytosine methylering komt voor bij 70% van alle apr in het genoom van somatische cellen en ~ 1% van het totaal dat DNA bases4. DNA-methyleringen is ook beschreven in niet-CpG contexten, zoals CpC, CpA en CpT en bestaan in verschillende hoeveelheden in nucleaire DNA, met waarden van maximaal 25% van alle methylated cytosines in embryonale stamcellen5,6,7.
Terwijl cytosine methylering van het nucleair genoom is geaccepteerd, is het bestaan van mitochondriale methylation van DNA (mtDNA) nog steeds controversieel. De eerste studie behandelende mtDNA methylering werd uitgevoerd in gekweekte cellen waar mtDNA methylering gemakkelijk waargenomen is, hoewel op een lager niveau in vergelijking met nucleaire DNA8. In zowel menselijke als lymfkliertest cellen, werd mtDNA methylering ook ontdekt op een laag niveau (2-5%). Met behulp van tests te vertrouwen op 5 methylcytosine vangen zoals gemethyleerd DNA immunoprecipitation (MeDIP) gevolgd door kwantitatieve PCR, mtDNA methylation is ook aangetroffen in verschillende muis en mens en cellen lijnen9,10, 11,12. Met behulp van antilichamen tegen 5-methylcytosine in een ELISA-test of de massaspectrometrie, werden aanzienlijke niveaus van methylation van DNA ontdekt van gezuiverde mitochondriale breuken13,14,15, 16. de meeste van de tests in de bovengenoemde studies echter gebruikt technieken die niet zijn ontworpen voor een absolute kwantificering van methylation van DNA op de enkele base-resolutie.
Kwantitatieve en ontbindende methylation van DNA analyse kan worden bereikt door een techniek genaamd "bisulfiet sequencing", die profiteert van de eigenschap van natrium bisulfiet unmethylated cytosine omzetten in uracil in single-stranded DNA context17 . Met bisulfiet sequencing, is een constellatie van studies de aanwezigheid van cytosine Methyleren aan verschillende niveaus geconstateerd. Methylation mtDNA in de D-loop-regio, de 12S of de 16S-regio is gemakkelijk waargenomen in menselijke18,19,20,21,22,23 en muis24 weefsels en cellen, echter met een intrigerende variabiliteit, van 1-20% van de totale cytosines over studies.
In vergelijking met die talrijke studies hebben alleen een paar studies, met inbegrip van onze fractie, betwist de aanwezigheid van mtDNA methylering3,25,26,27 of vraagtekens bij de biologische relevantie van zeer lage niveaus van mtDNA niveaus (onder 2%)28. Onlangs meldden we de waarneming van een potentiële bisulfiet-sequencing artefact in hele mitochondriale bisulfiet sequencing3. We aangetoond dat de secundaire structuur van mitochondriaal DNA kan leiden tot valse positieven in bisulfiet sequencing, waardoor overschatting van methylering niveaus. Wij bieden hier een protocol om te voorkomen dat een artefact van Bisulfiet-Omzetting van mtDNA. Dit protocol maakt gebruik van een eenvoudige enzymatische spijsvertering van DNA te verstoren mtDNA secondaire structuren en volledige toegang toe tot bisulfiet volgens een bisulfiet sequencing protocol. Daarnaast bieden wij een begeleidende bioinformatic pijpleiding voor de analyse van bisulfiet sequencing.

```html
<table><tbody><tr><td>BamHI</td><td>New England BioLabs</td><td># R0136</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA methylation-lightning kit</td><td>Zymo Research</td><td># D5030&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qubit ssDNA assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q10212</td><td></td></tr><tr><td>Qubit assay tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q32856</td><td></td></tr><tr><td>HotStarTaq plus DNA polymerase kit</td><td>Qiagen</td><td># 203603&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td># 28704</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra DNA Library Kit voor Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7370S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligoes voor Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td># E7335S</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td># A63881</td><td></td></tr><tr><td>High Sensitivity DNA chip</td><td>Agilent</td><td># 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Qubit high sensitivity dsDNA assay</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33230</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq reagent kit v2 300 cycles</td><td>Illumina</td><td># MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>PhiX control v3</td><td>Illumina</td><td># FC-110-3001</td><td></td></tr><tr><td>Natriumhydroxide&nbsp;</td><td>Sigma</td><td># S5881</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000</td><td>Biorad</td><td># 1851148</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Real-Time PCR detectiesysteem</td><td>Biorad&nbsp;</td><td>#1855195</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Fluorometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td># Q33226</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent</td><td># G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq instrument</td><td>Illumina</td><td># SY-410-1003</td><td></td></tr></tbody></table>
```

methodologie voor nauwkeurige detectie van mitochondriaal dna methylatie

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Kwantificering van methylation van DNA kan worden bereikt met behulp van bisulfiet sequencing, die profiteert van de eigenschap van natrium bisulfiet unmethylated cytosine omzetten in uracil, in een context van single-stranded DNA. Bisulfiet sequencing kan worden gericht (met behulp van PCR) of uitgevoerd op het hele genoom en biedt absolute kwantificering van cytosine Methyleren aan de enkele base-resolutie. Gezien de verschillende aard van nucleaire- en mitochondriaal DNA, met name in de secundaire structuur, moeten aanpassingen van bisulfiet sequencing methoden voor onderzoek van cytosine methylering in mtDNA worden gemaakt. Secundaire en tertiaire structuur van mtDNA kan inderdaad leiden tot bisulfiet artefacten leidt tot vals-positieven te wijten aan de slechte toegang onvolledig denaturatie van bisulfiet naar single-stranded DNA sequencing. Hier beschrijven we een protocol met behulp van een enzymatische spijsvertering van DNA met BamHI in combinatie met bioinformatic analyse pijpleiding om nauwkeurige kwantificering van cytosine methylering niveaus in mtDNA. Bovendien, wij bieden richtlijnen voor het ontwerpen van het Bisulfiet sequencing primers specifiek voor mtDNA, (NUMTs) ingevoegd om te voorkomen dat ongewenste nucleaire mitochondriale segmenten richten het nucleair genoom.

Twee stappen in dit protocol zijn cruciaal bij het onderzoeken van mtDNA methylering. 1) de opening van de secundaire structuur en 2) het ontwerp van mitochondriaal DNA-specifieke primers.
Door het verteren van het menselijke genomic DNA met de restrictie-enzym BamHI (Figuur 1), de mitochondriale DNA-structuur zal worden gesneden op nucleotide positie 14,258 en de secundaire structuur zal worden geo...

Hier presenteren we een protocol zodat nauwkeurige kwantificering van mitochondriale methylation van DNA (mtDNA). In dit protocol beschrijven we een enzymatische spijsvertering van DNA met BamHI in combinatie met een bioinformatic analyse pijpleiding die kan worden gebruikt om te voorkomen dat overschatting van mtDNA methylering niveaus veroorzaakt door de secundaire structuur van mtDNA.

Methodologie voor nauwkeurige detectie van mitochondriaal DNA methylatie

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Het algemene doel van dit bisulfiet-sequencing protocol en bio-informaticapijplijn is om een nauwkeurige kwantificering van mitochondriale DNA-methylatie te bereiken. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het mito-epigenetische veld, zoals verandert mitochondriale DNA-methylatie menselijke ziekten? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het een nauwkeurige kwantificering van mitochondriale DNA-methylatie mogelijk maakt.Een cruciale stap bij het onderzoek naar mitochondriale DNA-methylatie is het lineariseren van het mitochondriale DNA door BamH1-digestie vóór behandeling met natriumbisulfiet. De BamH1 restrictie-enzymplaats wordt weergegeven in deze kaart van het menselijke mitochondriale genoom. Ook getoond zijn de vijf regio's van het mitochondriale genoom die door bisulfiet-sequencing worden onderzocht.Verplaatsingslus, tRNA fenylalanine, en 12S-ribosoom, 16S-ribosoom, NADH-dehydrogenase 5, cytochroom B mRNA-coderend gen. Na het ontwerpen van de primers voor bisulfiet-sequencing, met behulp van online tools zoals beschreven in het tekstprotocol, wordt de primerspecificiteit ten opzichte van het mitochondriale genoom geverifieerd met behulp van BiSearch. Primersequenties worden toegevoegd aan de BiSearch-functie primerzoek.Het bisulfiet-vakje wordt gecontroleerd en een referentiegeenoom wordt geselecteerd. De zoekresultaten tonen potentiële PCR-producten die gegenereerd zijn op zin en antizins kettingen. Om de regio's van belang uit het bisulfiet-geconverteerde mitochondriale genoom te versterken, voert u PCR uit met behulp van een Hot-start Taq-polymerase.Als u de primers afzonderlijk gebruikt, mengt u 100 nanogram geconverteerd DNA, 500 micromolar van zin en antizins primers, één microliter dNTP-mix en polymerase op 7,5 eenheden per reactie in een totaal volume van 50 microliter. Voer de PCR uit met de volgende omstandigheden: vijf minuten bij 95 graden Celsius, één minuut bij 94 graden Celsius, één minuut bij 55 graden Celsius, één minuut bij 72 graden Celsius gedurende 35 cycli, gevolgd door 10 minuten bij 72 graden Celsius. Voor multiplexing van primers, gebruik 200 nanogram geconverteerd DNA in de volgende cyclische omstandigheden: vijf minuten bij 95 graden Celsius, één minuut bij 94 graden Celsius, 1,5 minuten bij 55 graden Celsius en 1,5 minuten bij 72 graden Celsius gedurende 35 cycli, gevolgd door 10 minuten bij 72 graden Celsius.Wanneer de PCR voltooid is, voer gelelektroforese uit op de PCR-producten, met behulp van 2% agarose bij 100 volt. Extractie van de PCR-producten uit de agarosegel moet gebeuren op een manier die UV-blootstelling en het risico op DNA-schade minimaliseert. Maak een foto van de gel onder UV-licht.Markeer vervolgens snel rond het PCR-product met een scalpel en zet het UV-licht uit. Snijd vervolgens het PCR-product langzaam zonder blootstelling aan UV-licht. Plaats de gelplakken in microcentrifugebuisjes en zuiver de PCR-producten met behulp van gelzuivering zoals beschreven in het tekstprotocol.Kwantificeer het gezuiverde DNA met behulp van fluorometrie. Bewaar de monsters bij 20 graden Celsius, indien niet onmiddellijk doorgaat naar bisulfiet-sequencing bibliotheekvoorbereiding. Begin de bibliotheekvoorbereiding van bisulfiet-geconverteerde PCR-producten door end repair uit te voeren met behulp van maximaal 100 nanogram PCR-product.Voeg aan elke 0,2 milliliter buis 55,5 microliter PCR-product, drie microliter end prep-enzym en 6,5 microliter 10X end repair reactiebuffer toe. Incubeer de buizen in een thermocycler bij 20 graden Celsius gedurende 30 minuten, gevolgd door 65 graden Celsius gedurende 30 minuten. Lig vervolgens sequencing adapters door de end-gerepareerde DNA te mengen met 15 microliter Blunt/TA ligase mix, 2,5 microliter adapter en één microliter ligatie-versterker.Plaats het mengsel in een thermocycler en incubeer gedurende 15 minuten bij 20 graden Celsius. Pauzeer de thermocycler en voeg 3 microliter USER-enzym toe aan elke buis. Meng en plaats de buizen terug in de thermocycler en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 graden Celsius.Selecteer de grootte van de adapter-geligatiseerde DNA met behulp van solid phase reversible immobilisatie of SPRI. Voeg aan het adapter-geligatiseerde DNA 13,5 microliter water en 55 microliter gesuspendeerde SPRI-kralen toe. Incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Plaats de buizen op een magnetische standaard. Wanneer de oplossing helder is, draag de supernatant, die de adapter-geligatiseerde DNA bevat, over naar een nieuwe buis en gooi de buis met de kralen weg. Voeg 25 microliter gesuspendeerde SPRI-kralen toe aan de supernatant; meng en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Plaats de buizen op de magnetische standaard en gooi de supernatant weg wanneer de oplossing helder is. Het adapter-geligatiseerde DNA is nu aan de kralen gebonden. Terwijl de buizen op de magnetische standaard staan, voeg 200 microliter vers bereide 80% ethanol toe aan elke buis en incubeer gedurende 30 seconden om de kralen te wassen.Verwijder en gooi de supernatant weg. Herhaal deze ethanol-wasstap in totaal twee keer. Verwijder de ethanol uit de tweede was en laat de kralen in de lucht drogen door de buizen op de magnetische standaard te laten staan, met de dop open, gedurende vijf minuten.Na vijf minuten verwijdert u de buizen van de magnetische standaard, voegt u 23 microliter DNA-elutiebuffer toe aan de kralen en mengt u. Incubeer gedurende twee minuten bij kamertemperatuur. Plaats de buizen op de magnetische standaard totdat de oplossing helder is.Breng vervolgens twee microliter van de oplossing over naar een 96-Well PCR-plaat voor de pre-PCR-amplificatie. Terwijl u de kralen zorgvuldig vermijdt, brengt u de rest van de oplossing over naar een nieuwe 0,2 milliliter buis voor PCR-amplificatie. Voer pre-PCR-amplificatie uit door RT-qPCR om het aantal cycli dat nodig is om het adapter-geligatiseerde DNA te verster

methodology-for-accurate-detection-of-mitochondrial-dna-methylation

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Deze video toont het protocol voor gemethyleerd DNA immunoprecipitatie (MeDIP). MeDIP is een twee dagen procedure die selectief gemethyleerd DNA-fragmenten extracten van een genomische DNA-monster met behulp van antilichamen met specificiteit voor 5-methylcytosine (anti-5 mC).

Gemethyleerd DNA Immunoprecipitatie

De gouden standaard voor DNA methylatie analyse is genomische sequentie van bisulfiet omgezet DNA. Deze methode maakt gebruik van de verhoogde gevoeligheid van cytosine in vergelijking met 5-methylcytosine (5-MEC) tegen desaminering bisulfiet onder zure omstandigheden. Niet-gemethyleerd cytosines kunnen worden onderscheiden van gemethyleerd cytosines na PCR-amplificatie van het doel genomisch DNA.

DNA-methylatie: bisulfiet Wijziging en Analyse

Een gestroomlijnde workflow om DNA-methylatie en expressie van genen veranderingen te bestuderen op de jeugd stress wordt weergegeven. Vanaf moeder scheiding van pasgeboren muizen en isolatie van discrete hersenweefsel vertegenwoordigen wij een protocol van DNA en RNA tegelijk isoleren van hersenweefsel ponsen voor latere bisulfiet sequencing en RT-PCR analyse.

Geoptimaliseerd Analyse van DNA-methylatie en Gene Expression uit kleine, anatomisch gedefinieerde gebieden van de hersenen

This video describes the technique of dot-blot to determine the level of DNA methylation in human chondrocytes in vitro via the blotting of DNA samples on a nylon membrane and the subsequent visualization using monoclonal antibodies. This helps to determine the chondrocytes' phenotype at various stages in culture.

5-Methylcytosine Dot Blot to Determine the Extent of DNA Methylation

Verbeterde Gereduceerde Representatie Bisulfiet Sequencing is een methode voor de voorbereiding van sequencingbibliotheken voor DNA-methylatieanalyse op basis van restrictie-enzymdigestie gecombineerd met cytosine bisulfietconversie. Dit protocol vereist 50 ng aan uitgangsmateriaal en levert data met base-paarresolutie op GC-rijke genomische regio's.

Verbeterde Verminderde Vertegenwoordiging bisulfietsequencing voor de Beoordeling van DNA-methylatie bij Base Pair Resolutie

Bisulfiet amplicon sequentiebepaling (BSAS) is een methode voor het kwantificeren van cytosinemethylatie in gerichte genomische regio's van belang. Deze methode maakt gebruik van bisulfietconversie in combinatie met PCR-amplificatie van doelregio's vóór next-generation sequencing om absolute kwantificering van DNA-methylatie op een basisspecifiek niveau te produceren.

Gerichte DNA methylatie analyse van next-generation sequencing

DNA-methyltransferasen zijn potentiële doelwitten van kankergeneesmiddelen. Hier wordt een protocol gepresenteerd om kleine moleculen te beoordelen op DNA-methyltransferaseremming. Deze test maakt gebruik van een endonuclease om DNA-methylatie te koppelen aan fluorescentiegeneratie en maakt het mogelijk om enzymactiviteit in realtime te volgen.

Continue fluorescentie-gebaseerde endonuclease-gekoppelde DNA-methylatietest om te screenen op DNA-methyltransferaseremmers

Hier presenteren we een protocol voor het meten van absolute mitochondriale (mt) DNA-kopienummer en mtDNA-deletie heteroplasmieniveaus in enkele cellen.

Het meten van eencellig mitochondriaal DNA-kopienummer en heteroplasmie met behulp van digitale druppelpolymerasekettingreactie

Pyrosequencing assays maken de robuuste en snelle genotypering van mitochondriaal DNA single nucleotide polymorfismen in heteroplasmatische cellen of weefsels mogelijk.

Genotypering van enkelvoudige nucleotidepolymorfismen in het mitochondriale genoom door pyrosequencing

Een procedure voor het bestuderen van de dynamiek van mitochondriaal DNA (mtDNA) metabolisme in cellen met behulp van een multi-well plaatformaat en geautomatiseerde immunofluorescentie beeldvorming om mtDNA-synthese en -distributie te detecteren en te kwantificeren, wordt beschreven. Dit kan verder worden gebruikt om de effecten van verschillende remmers, cellulaire stress en gen-uitschakeling op het mtDNA-metabolisme te onderzoeken.

High-throughput image-based kwantificering van mitochondriale DNA-synthese en -distributie

Leer een bisulfietsequencingprotocol en bio-informatica-pijplijn voor nauwkeurige kwantificering van mitochondriaal DNA-methylatie. Deze methode lineariseert mtDNA met BamHI-vertering voor betrouwbare resultaten in mito-epigenetisch onderzoek.

Methodologie voor nauwkeurige detectie van mitochondriaal DNA methylatie

Meer video's verkennen