Één molecuul fluorescentie In Situ hybridisatie (smFISH) analyse in Budding vegetatieve groei van gist en meiose
25 mei 2018
Dit enkel molecuul fluorescentie in situ hybridisatie protocol is geoptimaliseerd voor het kwantificeren van het aantal molecules van RNA in ontluikende gist tijdens de vegetatieve groei en meiose.
Het algemene doel van deze geoptimaliseerde enkele molecuul RNA in situ hybridisatie, of smFISH, is om individuele RNA-moleculen per cel te detecteren en te kwantificeren tijdens de vegetatieve groei en meiose van knopgisten. Deze methode onthult cel-tot-cel variabiliteit in genexpressie op subcellulaire RNA-lokalisatie en is daarom een krachtige techniek om genregulatie te bestuderen. Afgezien van de unieke informatie die kan worden onthuld door smFISH, is het belangrijkste voordeel van de techniek dat deze, eenmaal geoptimaliseerd, robuust en zeer reproduceerbaar is.
Een meiotische cultuur zal worden gebruikt voor de demonstratie van dit protocol. Om de cultuur in 3% formaldehyde te fixeren, voegt u 1840 microliters van de cultuur toe aan 160 microliters van 37% formaldehyde in een twee milliliter microcentrifugebuisje. Draai ongeveer vijf keer om te mengen.
Plaats de buis op een roltrommel op kamertemperatuur gedurende 20 minuten. Na 20 minuten, ga door met fixeren bij vier graden Celsius met rotatie overnacht. Op de volgende dag, bereid de vertering voor door eerst 200 millimolair vanadyl ribonucleoside complexen, of VRC, te ontdooien bij 65 graden Celsius gedurende ten minste 10 minuten.
Om de verteringsmastermix voor te bereiden, pipet eerste 2125 microliters buffer B in een 15 milliliter buis. Vervolgens vortex de warme VRC gedurende vijf seconden om het volledig te resuspenderen en voeg 200 microliters van VRC toe aan de 15 milliliter buis. De mix zou licht bruin groen van kleur moeten zijn.
Centrifugeer de meiotische steekproef bij 21.000 x g gedurende anderhalve minuut bij kamertemperatuur. Aspireer de supernatant voorzichtig, plaats de vacuümtip aan de andere kant van de pellet om verstoring van de pellet te voorkomen. Resuspendeer de cellen in anderhalve milliliter koude buffer B door op en neer te pipetten om te mengen.
Centrifugeer bij 21.000 x g gedurende anderhalve minuut. Verwijder de bulk van de vloeistof door vacuüm aspiratie, waarbij ongeveer 100 microliters achterblijft. Resuspendeer de cellen in anderhalve milliliter koude buffer B. Centrifugeer de steekproeven, verwijder de vloeistof en resuspendeer de cellen opnieuw in anderhalve milliliter koude buffer B.
Centrifugeer bij 21.000 x g gedurende anderhalve minuut. Aspireer de vloeistof volledig door op en neer te pipetten. Resuspendeer de cellen in 425 microliters verteringsmastermix en vortex kort.
Voeg vijf microliters zymolyase toe aan de buis en vortex gedurende twee tot drie seconden om te mengen. Plaats de buis op een roltrommel en verteer bij 30 graden Celsius gedurende 15 tot 30 minuten. Na 15 minuten, controleer de cellen door middel van microscopie elke vijf minuten en stop de vertering wanneer ongeveer 80% van de cellen niet-transparant en niet-brekingskrachtig lijkt.
Centrifugeer de buis bij 376 x g gedurende drie minuten. Verwijder de supernatant volledig. Resuspendeer de cellen voorzichtig met een milliliter buffer B door een tot twee keer op en neer te pipetten om te mengen.
Centrifugeer de buis en verwijder de buffer. Resuspendeer de cellen voorzichtig in een milliliter 70% ethanol en incubeer bij kamertemperatuur gedurende drie en een half tot vier uur. Om de hybridisatieprocedure te beginnen, centrifugeer de buis met cellen bij 376 x g gedurende drie minuten.
Verwijder 500 microliters van de 70% ethanol uit de buis. Pipet voorzichtig op en neer om de resterende cellen te resuspenderen en breng de cellen over naar een laag adhesieve buis. Het overbrengen van het monster naar een laag adhesieve buis is cruciaal om overtollige celverliezen tijdens de daaropvolgende formamide wasbeurten te voorkomen.
Centrifugeer de laag adhesieve buis en verwijder alle ethanol. Voeg een milliliter 10% formamide wasbuffer toe aan de buis en pipet voorzichtig twee tot drie keer op en neer om de cellen te resuspenderen. Laat de cellen ongeveer 20 minuten bij kamertemperatuur staan terwijl de hybridisatieoplossingen worden voorbereid, zoals beschreven in het tekstprotocol.
Centrifugeer het monster en verwijder de supernatant in gevaarlijk afval. Voeg ten minste 50 microliters van elke hybridisatieoplossing toe aan de buis en flikker de buis om te mengen. Incubeer bij 30 graden Celsius op een roltrommel gedurende ten minste 16 uur in het donker.
Wanneer de hybridisatie voltooid is, plaats de buis met cellen in een met folie bedekte doos om te beschermen tegen licht. Centrifugeer het monster bij 376 x g gedurende drie minuten. Verwijder de supernatant in gevaarlijk afval door te pipetten.
Resuspendeer het monster in een milliliter 10% formamide wasbuffer door voorzichtig twee tot drie keer op en neer te pipetten. Plaats de buis met cellen terug in een met folie bedekte doos om te beschermen tegen licht en incubeer bij 30 graden Celsius gedurende 30 minuten. Na 30 minuten, centrifugeer het monster.
Verwijder de supernatant tot gevaarlijk afval door te pipetten, waarbij ongeveer 50 microliters overblijft. Resuspendeer het monster in een milliliter DAPI oplossing door voorzichtig twee tot drie keer op en neer te pipetten. Plaats de buis met cellen opnieuw in de met folie bedekte doos en incubeer bij 30 graden Celsius gedurende 30 minuten.
Centrifugeer het monster en verwijder de supernatant volledig door te pipetten. Voor monsters die niet onmiddellijk worden beeldvormd, resuspendeer het pellet in 50 microliters GLOX buffer zonder enzymen. Pipet drie tot vier keer op en neer om te mengen.
Bewaar in de met folie bedekte doos bij vier graden Celsius tot u klaar bent om te beeldvormen. Voor monsters die onmiddellijk worden beeldvormd, voeg 15 tot 20 microliters GLOX buffer met enzymen toe. Pipet vijf microliters op een dekglas en plaats het dekglas op een dia.
Plaats een laboratoriumdoekje bovenop de dia waar het dekglas is geplaatst. Druk voorzichtig op het doekje om de dia vast te zetten. Plaats de dia in een doos bedekt met aluminiumfolie voor overdracht naar de microscoopruimte.
Dit protocol werd gebruikt om de expressie
Overzicht
Dit geoptimaliseerde protocol voor single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) kwantificeert RNA-moleculen in buddinggist tijdens vegetatieve groei en meiose. De methode brengt de cel-tot-cel variabiliteit in genexpressie en de subcellulaire RNA-lokalisatie in kaart.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschappen
- Celbiologie
- Genregulatie
Achtergrond
- Single molecule RNA in situ hybridisatie maakt de detectie van individuele RNA-moleculen mogelijk.
- Deze techniek biedt inzicht in de variabiliteit van genexpressie.
- Het is bijzonder nuttig voor het bestuderen van bakkersgist.
- Het protocol is robuust en reproduceerbaar zodra het is geoptimaliseerd.
Doel van de studie
- Om RNA-moleculen in gistcellen te detecteren en te kwantificeren.
- Om genexpressie tijdens verschillende groeifasen te onderzoeken.
- Om de expressie van specifieke genen, zoals NDC80, te analyseren.
Gebruikte methoden
- Fixatie van gistculturen met formaldehyde.
- Bereiding van de digestie-mastermix voor celpermeabilisatie.
- Hybridisatie van RNA-sondes met specifieke mRNA-isovormen als doelwit.
- Microscopie voor visualisatie van RNA-moleculen.
Belangrijkste resultaten
- Er werden verschillende smFISH-spots geïdentificeerd voor diverse RNA-isoformen.
- Er werd variabiliteit tussen cellen waargenomen in de expressie van NDC80.
- De methode kwantificeerde met succes RNA tijdens vegetatieve groei en meiose.
- Geoptimaliseerde condities maakten een duidelijke visualisatie van de RNA-lokalisatie mogelijk.
Conclusies
- smFISH is een krachtig instrument voor het bestuderen van genregulatie in gist.
- Het protocol kan worden toegepast op diverse genen en condities.
- De resultaten dragen bij aan het begrip van RNA-dynamiek in cellulaire processen.
Veelgestelde Vragen
Industriële relevantie voor leidinggevenden
Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) maakt directe kwantificering van RNA-moleculen op resolutie van individuele cellen mogelijk, wat cruciaal inzicht biedt in de heterogeniteit van genexpressie en de subcellulaire lokalisatie van transcripten. Deze mogelijkheid is essentieel voor het verminderen van risico's bij vroege ontdekkingshypothesen en het verfijnen van targetvalidatie in gistmodellen die relevant zijn voor eukaryote genregulatie. Robuuste, reproduceerbare smFISH-workflows ondersteunen het voorspellende vertrouwen en de translationele continuïteit binnen R&D-portfolio's.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Maakt directe analyse van variabiliteit in genexpressie op single-celniveau mogelijk.
- Ondersteunt functionele validatie van transcript-isoformen en regulatiemechanismen.
- Faciliteert mechanistische risicoreductie door subcellular RNA-lokalisatie op te lossen.
- Levert kwantitatieve gegevens ter ondersteuning van targetselectie en triagebeslissingen.
Screening & Assayontwikkeling
- Bereidt gevalideerde gist-systemen voor voor downstream screening van modulatoren van genregulatie.
- Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare kwantitatieve RNA-metingen voor assay-ontwikkeling.
- Maakt robuuste detectie van transcript-isovormen mogelijk voor workflows voor verbindingsevaluatie.
- Ondersteunt schaalbaarheid en hergebruik van het platform in genexpressiestudies.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Lijnt bevindingen uit gistmodellen uit met bredere paradigma's van eukaryote genregulatie.
- Biedt continuïteit vanaf de ontdekking tot de preklinische validatie van biomarkers voor genexpressie.
- Vermindert biologische risico's door transcriptdynamiek in ziekterelevante systemen te verduidelijken.
- Maakt risico-gecorrigeerde verdere ontwikkeling van doelwitten voor genregulatie mogelijk.
Integratie van Pipeline & Workflow
smFISH-analyse integreert in het ontdekkingscontinuüm, van vroege hypothesetesten tot lead-identificatie en preklinische validatie, in het bijzonder voor studies naar genregulatie en transcript-isovormen in gistmodellen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en het verduidelijken van signaalpaden door het kwantificeren van transcriptovervloed en lokalisatie.
- Screening: Biedt assay-klare, reproduceerbare RNA-kwantificering op enkelcelniveau voor screeningplatforms.
- Analytiek: Levert kwantitatieve, statistisch robuuste metingen voor het vergelijken van genexpressie onder verschillende condities.
- Translationeel onderzoek: Slaat een brug tussen inzichten uit gistmodellen en preklinische biomarkerstrategieën wanneer transcriptdynamiek geconserveerd is.
- Bedrijfsmatige herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbare, gestandaardiseerde workflow voor genexpressieanalyse op enkelcelniveau binnen R&D-programma's.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen en vermindert mechanistische ambiguïteit in studies naar genregulatie.
- Operationele waarde: Levert gestandaardiseerde, reproduceerbare en schaalbare RNA-kwantificatie op single-cell niveau.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen en kapitaalefficiëntie door biologie op transcriptniveau in een vroeg stadium te verduidelijken.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering en verdere ontwikkeling van targets voor genregulatie mogelijk.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in gistgenetica, RNA-biologie en fluorescentiemicroscopie.
- Vereist toegang tot hoogwaardige beeldvormingsinstrumentatie en analysesoftware.
- Maakt cross-team standaardisatie van sonde-ontwerp en hybridisatiecondities noodzakelijk.
- Aanpassing kan nodig zijn voor verschillende giststammen of groeicondities.
- Optimalisatie van de digestie en sondeconcentratie is cruciaal voor de signaal-ruisverhouding en datakwaliteit.
