Opsporing van antilichamen die de cellulaire opname van enzym vervangende therapieën met een test van cel-gebaseerde neutraliseren

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van immunogeniciteit en bioanalyse over de impact van neutraliserende antilichamen op de veiligheid, werkzaamheid en farmacokinetische en farmacodynamische profielen van geneesmiddelen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het een gevoelige en biologisch relevante cel-gebaseerde methode biedt voor het meten van geneesmiddel-specifieke neutraliserende antilichamen op een semi-kwantitatieve manier. In deze techniek komen fluorfoorgemarte enzymen via de binding van een mannose-6-fosfaatrest aan de kation-onafhankelijke mannose-6-fosfaatreceptor of CI-M6PR in Jurkat-cellen terecht.

Neutraliserende antilichamen die de interactie van het enzymreceptor voorkomen, veroorzaken een afname van de fluorescentie, zoals gemeten door middel van flowcytometrie. Om te beginnen, zaait u 7,5 maal 10 tot de vierde Jurkat-cellen in 100 microliter celgroeimedium per put in een 96-well ronde bodemcelcultuurplaat voor een incubatie van 14 tot 20 uur bij 37 graden Celsius en 5% koolstofdioxide met 95% vochtigheid. Verdun de assaymonsters eerst in serumvrij medium met een verhouding van één tot 2,5.

Voeg vervolgens 60 microliter van elk monster toe aan de juiste putten van een 96-well witte ronde bodem niet-bindende polypropyleenplaat. Dit wordt de monsterincubatieplaat. Voor monsters die positief zijn getest en bevestigd moeten worden, schudt u een flesje Enzymvervangende Therapie of ERT-kralen en voegt u het juiste aantal kralen toe aan een 15 milliliter conische buis voor een andere schudbeurt.

Plaats vervolgens de buis gedurende twee minuten in een magnetische buisstandaard en verwijder voorzichtig het supernatant. Na de vierde wassing, voegt u 100 microliter kralen toe aan de juiste putten van een nieuwe witte 96-well ronde bodem niet-bindende polypropyleenplaat. Wanneer alle kralen zijn geplaatst, plaatst u de plaat op een 96-well zij-gerande magneet en laat u de kralen een pellet vormen voordat u voorzichtig het heldere supernatant verwijdert.

Voeg vervolgens 140 microliter van elk monster toe aan de juiste putten en sluit de plaat af met plastic film voor schudbeurt gedurende ten minste 60 minuten op een rotatieschudder bij ongeveer 800 RPM bij kamertemperatuur. Plaats vervolgens de bevestigingsplaat op de 96-well zij-gerande magneet om de kralen een andere pellet te laten vormen en voeg 60 microliter monster toe aan de juiste putten van een 96-well witte ronde bodem niet-bindende polypropyleen monsterincubatieplaat. Voor monsters die zijn gescreend en positief zijn bevestigd, kan een titerserie worden uitgevoerd.

Om een titerserie voor te bereiden, verdunt u het monster in de gepoolde matrix voldoende keren om het vooraf bepaalde titer-snijpunt te overschrijden en voegt u 60 microliter van elk verdund monster toe aan de juiste putten van de monsterincubatieplaat en 60 microliter van de juiste concentraties fluorfoorgemarte ERT aan de juiste putten van een nieuwe 96-well witte ronde bodem niet-bindende polypropyleenplaat volgens het tekstprotocol. Pipet vervolgens de fluorfoorgelabelde ERT-monsteroplossing verschillende keren om te mengen en wikkel de platen in folie voor een incubatie van 14 tot 20 uur bij twee tot acht graden Celsius. De volgende ochtend, verwarmt u de monsterplaten in een 37 graden Celsius parelbad gedurende 10 tot 15 minuten en controleert u de geplateerde cellen op een omgekeerde microscoop om te bevestigen dat de cellen gezond zijn en gelijkmatig over de putten zijn verdeeld.

Wanneer de platen zijn opgewarmd, voegt u 100 microliter monster en fluorfoorgemarte ERT-mengsel toe aan de celplaat volgens de experimentele plaatkaart en brengt u de cellen terug naar de celcultuurincubator voor nog eens drie uur en vijftien minuten. Aan het einde van de incubatie, pellet de cellen door centrifugatie en bevestig de aanwezigheid van een pellet op de bodem van elke put. Houd de plaat onder een hoek van 30 tot 45 graden, verwijder voorzichtig het supernatant in elke put zonder de pellets te verstoren en was de cellen drie keer in 200 microliter DPBS per put per centrifugatie.

Na de laatste wassing, voegt u 100 microliter live dood kleurstof toe aan elke put voor een incubatie van 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Aan het einde van de incubatie, pellet de cellen door centrifugatie en was de cellen met 200 microliter DPBS per put. Resuspendeer de gewassen pellets in 100 microliter van twee tot acht graden Celsius 1% paraformaldehyde per put en sluit de plaat voor voorzichtig pulseren met de vortex.

Vervolgens wikkelt u de plaat in folie voor een 10-minuten fixatie bij twee tot acht graden Celsius. Om de celviabiliteit door middel van flowcytometrie te analyseren, mengt u de cellen met 50 microliter DPBS per put om een enkele celsuspensie te verkrijgen en leest u de cellen op een flowcytometer volgens standaard flowcytometrie protocollen. Fluorfoorgeconjugeerd ERT-opname kan vervolgens worden beoordeeld op basis van de mediane fluorescentie-intensiteit of MFI van de levende enkele cellen.

Voordat ze in de assay worden getest, wordt een experimentele screeningsdrempel berekend als een drempel voor het bepalen van de positieve en negatieve monsters. In dit voorbeeld worden kwaliteitscontroles getoond die zijn aangevuld met hoge of lage hoeveelheden neutraliserende antilichamen. Positieve monsters worden vervolgens getest in een bevestigingsassay met behulp van geneesmiddel-geconjugeerde magnetische kralen om het geneesmiddel-specifieke antilichaam uit de monsters te verwijderen.

Monsters met een herstelratio groter dan de bevestigingsdrempel worden als positief beschouwd. Monsters die positief zijn getest en bevestigd, worden serieel verdund en getest in de titerassay om de relatieve titer van neutraliserende antilichamen in elk monster te bepalen. Titer is de geïnterpoleerde waarde tussen twee verdunningen die het titer-snijpunt overschrijden.

Hier getoond, de MFI's van levende enkele cellen beoordeeld fluorfoorgeconjugeerd ERT-opname. Bijvoorbeeld, in dit experiment, remde de matrix die is aangevuld met het positieve control