Name: Beoordeling van weerstand tegen Tyrosine Kinase remmers door een ondervraging van signaaltransductie trajecten door antilichaam Arrays (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Ontdek hoe antilichaam arrays signaaltransductieveranderingen identificeren in kankercellen. Deze methode geeft snelle inzichten in fosforyleringstoestanden en therapieresistentie mechanismen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We zijn dankbaar voor de genereuze financiële steun van de Lawrence J. Ellison Instituut voor Transformatieve geneeskunde van USC (een geschenk aan David Agus). Wij waarderen de steun van herfst Beemer en Lisa Flashner die leiden tot de generatie en de publicatie van dit manuscript. Wij danken Laura Ng voor haar administratieve ondersteuning.

1. eiwit extractie
<ol><li>Plaat 5 x 106 cellen op een 10 mm weefselkweek plaat (of kolf) in een weefselkweek kap. Cellen tellen op het moment van beplating met een automatische cel teller of hemocytometer. Anderzijds schatten de telling van de cel.</li>
	<li>Spoel de cellen geteeld op de 10 mm plaat (of kolf) grondig 3 x met 10 mL-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH = 7.4). Zorg ervoor dat alle PBS verwijderen voordat u de lysis-buffermengsel toevoegt. Opmerking: De lysis-buffermengsel is meestal voorzien van de kit. Als dat niet het geval is, gebruik dan een radioimmunoprecipitation assay buffer (RIPA), of elke andere cellysis-buffermengsel met een cocktail van protease en phosphatase inhibitors.</li>
	<li>1 x 107 cellen/mL van cellen in de lysis-buffermengsel lyse door toevoeging van de juiste hoeveelheid buffer naar de cellen en schrapen de cellen met een cel schraper in de lysis-buffermengsel. (bijvoorbeeldvoor HeLa cellen en MiaPaCa-2, gebruik 600 µL per 10 cm plaat).</li>
	<li>Pipetteer de lysate op en neer (ongeveer 10 x) en het overbrengen naar een nieuwe 1,5 mL-buis.</li>
	<li>Incubeer de lysates gedurende 30 minuten bij 4 ° C, bij voorkeur op een rocker/shaker. Druk op de lysate door een injectiespuit met een naald 27 G voor 10 x om een juiste verstoring van de cell membrane(s). Als alternatief, bewerk ultrasone trillingen ten de lysate. Bewaar de lysates bij-20 ° C of gebruik ze onmiddellijk.</li>
	<li>Centrifugeer het lysate bij 14.000 x g bij 4 ° C gedurende 15 minuten en het supernatant overbrengen in een schone 1,5 mL-buis.</li>
	<li>Kwantificeren van het bedrag van de totale proteïne door bicinchoninic zuur assay (BCA)20 of een equivalent zoals Lowry of Bradford en verder met ten minste 50-400 μg. Gebruik de eiwitten onmiddellijk of aliquot en bevriezen/winkel hen bij-70 ° C (Vermijd meerdere bevriezen-ontdooien cycli).</li>
</ol>2. menselijke Phosphokinase matrix
<ol><li>Breng alle reagentia op kamertemperatuur voordat u begint (gedurende ongeveer 1 uur). Opmerking: Alle reagentia en kunststof slijtage zijn inbegrepen in de kit.</li>
	<li>Alle de reagentia fresh (matrix buffers) voor te bereiden voordat u de procedure volgens de instructies van de fabrikant (afhankelijk van de keuze van doelen/arrays, de instructies kunnen verschillen).</li>
	<li>Reconstrueren de detectie antilichaam cocktails in 100 μl van gedeïoniseerd water of volg de instructies van de fabrikant moeten ze verschillen voor de 1,5 mL proefbuis geboden.</li>
	<li>1 x wassen buffer bereid door verdunning van 40 mL 25 x was buffer in 960 mL gedeïoniseerd water en meng ze door het omkeren. Opmerking: Kristallen ontbinden bij kamertemperatuur. De buffer kan geel worden na verloop van tijd, maar zal nog steeds werken.</li>
	<li>Pipetteer 1 mL van matrix buffer 1 in ieder putje van een 8-well multi lade (of 2 mL in een 4-well multi lade).</li>
	<li>Met flat-tip pincet, verwijder de matrix membranen tussen de beschermende platen en plaats hen in de putjes. Zorg ervoor dat de nummers op het membraan zijn naar boven zijn gericht. Opmerking: Bij onderdompeling, de kleurstof op het membraan zal verdwijnen.</li>
	<li>Bedek de tray met een deksel en Incubeer het op een rockende platform shaker gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Dit is de membraan blokkerende stap.</li>
	<li>Tijdens de incubatietijd, bereiden de eiwitsteekproeven. 50 – 100 μg totaal eiwit toevoegen. Verdun de lysate, hebben een maximumvolume van 334 μL, met lysis-buffermengsel tot een eindvolume van 1 mL. Opmerking: 50 – 100 μg totaal eiwit meestal volstaat.</li>
	<li>Gecombineerd matrix buffer 1 zorgvuldig en Incubeer de membranen met 1 mL van de monsters 's nachts bij 2-8 ° C op een rockende platform shaker. Opmerking: Geen touch/kras de membranen.</li>
	<li>De volgende dag was de array door het zorgvuldig verwijderen van elke array en plaatsen het in individuele plastic bakjes (ongeveer 8 x 11 cm2) met 20 mL voor 1 x wassen buffer. Het wassen van de membranen 3 x 10 min op een rockende platform in 1 x wassen buffer bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Pipetteer 20 μL van het gereconstitueerde antilichaam cocktail van stap 2.3 tot en met 1 mL 1 x matrix buffer 2. 1 mL van deze oplossing toevoegen aan elke 8-goed om te worden gebruikt.</li>
	<li>Verwijder voorzichtig de membranen vanuit de lade wassen. DEP de onderste rand op de papieren handdoeken te verwijderen alle overtollige was buffer en breng hen terug in de lade met de antilichaam-cocktails. Dekking van de lade, met het deksel en het gedurende 2 uur bij kamertemperatuur op een rockende platform uit te broeden. Grondig spoelen van de gebruikte schaaltjes met dH2O en droog ze voor later gebruik.</li>
	<li>Verwijder elke array voorzichtig en plaats ze terug in de schone afzonderlijke plastic verpakkingen (ongeveer 8 x 11 cm2) met 20 mL voor 1 x wassen buffer. Was ze 3 x 10 min met de buffer wassen op een rockende platform bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Daar-HRP (voorzien van de kit) of streptavidine-belichting fluorescerende kleurstof (voor een meer kwantitatieve detectie) 1:1,000 in 1 x matrix buffer 2 in een reageerbuis 15 mL verdund.</li>
	<li>De membranen terug in de gerechten van de 8-well met de HP-oplossing en broeden ze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op een rockende platform (als met behulp van fluorescentie, wikkel het Dienblad in aluminiumfolie om te voorkomen dat de eventuele blootstelling aan licht).</li>
	<li>Verwijder de overtollige buffer door het plaatsen van het membraan tussen de 2 stukken van 5 mm 3 M papier. Incubeer de gedroogde membranen met een HRP detectie oplossing (mix de twee chemiluminescentie oplossingen 1:1) voor 3 min en plaats het membraan in een doorzichtige plastic vel beschermer voor beeldbewerking met een X-ray film/chemiluminescentie imager. Opmerking: Gedroogde membrane(s) kunnen ook worden geplaatst in een fluorescerende imager te detecteren het fluorescent signaal; het minimaliseren van de lichte blootstelling aan het membraan voor imaging. Voor een kwantificering van de X-ray film of imager bestanden, Vermijd overmatige blootstelling. Meeste chemiluminescentie/TL imagers hebben een functie om te voorkomen dat een verzadiging van het signaal.</li>
</ol>3. de gegevensanalyse
<ol><li>ImageJ, een beeld processing programma21, Download en installeer de software.</li>
	<li>ImageJ openen door te dubbelklikken op het 'ImageJ pictogram'. Selecteert de afbeelding die moet worden geanalyseerd door te klikken op 'Bestand' in de menubalk, dan Selecteer 'Open' uit het drop-down menu en blader de computerbestanden voor het imago van belang. Klik op het bestand om het te openen.</li>
	<li>Het omkeren van de afbeelding voor de analyse (zwarte vlekken op de witte achtergrond van witte vlekken op een zwarte achtergrond) door in de menubalk op 'Edit' te klikken en te selecteren 'Omkeren' uit het drop-down menu.</li>
	<li>Selecteer de 'oval pictogram' op de werkbalk (de tweede optie in de werkbalk ImageJ). Teken een cirkel/ovaal door te klikken op de foto (zwarte cross) en de muis te bewegen. Aanpassen van de grootte/vorm van de cirkel/ovaal te omsingelen de puntjes op de stip vlek.</li>
	<li>Klik op 'Analyseren' in de menubalk en selecteer vervolgens "Maatregel" in het drop-down menu automatisch een nieuw venster te openen met de waarden van het geselecteerde gebied (gebied, gemiddelde, minimum en maximum).</li>
	<li>De cirkelvormige zone verplaatsen door te slepen de cirkel van het centrum (zet de punt van het recht van de pijl in het midden) en plaats het rond het volgende gedeelte van de meting (dot). Meten van alle plekken van belang, de positieve controle en de negatieve controle de achtergrond voor de analyse. Opmerking: De negatieve controle is de PBS, de achtergrond is een onderdeel van het membraan zonder enige plek (enig onderdeel zal doen) en de positieve controle is een controle door de fabrikant opgegeven.</li>
	<li>Selecteer de PBS negatieve controle plekjes en aftrekken van de waarde van elke vlek. Het gemiddelde van de intensiteit van elk paar van dubbele spots die elke receptor tyrosine kinase (RTK) vertegenwoordigt. Elke gemiddelde intensiteit kan worden gerelateerd aan het besturingselement voor het berekenen van de verandering van de vouw.</li>
</ol>

<ol><li>Knauer, D. J., Smith, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+biological+activity+of+multiplication-stimulating+activity+by+binding+to+its+carrier+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Inhibition of biological activity of multiplication-stimulating activity by binding to its carrier protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77 (12), 7252-7256 (1980).</li>
<li>Glossmann, H., Presek, P., Eigenbrodt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin+inhibits+tyrosine+phosphorylation+by+the+cyclic+nucleotide-independent%2C+transforming+protein+kinase%2C+pp60src%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedebergs+Archives+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Quercetin inhibits tyrosine phosphorylation by the cyclic nucleotide-independent, transforming protein kinase, pp60src.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology. 317 (1), 100-102 (1981).</li>
<li>Di Fiore, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+human+EGF+receptor+confers+an+EGF-dependent+transformed+phenotype+to+NIH+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the human EGF receptor confers an EGF-dependent transformed phenotype to NIH 3T3 cells.</a> Cell. 51 (6), 1063-1070 (1987).</li>
<li>Maguire, H. C., Greene, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neu+%28c-erbB-2%29+oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">The neu (c-erbB-2) oncogene.</a> Seminars in Oncology. 16 (2), 148-155 (1989).</li>
<li>Busse, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+G%281%29+arrest+induced+by+inhibition+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+tyrosine+kinase+requires+up-regulation+of+p27%28KIP1%29+independent+of+MAPK+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible G(1) arrest induced by inhibition of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase requires up-regulation of p27(KIP1) independent of MAPK activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (10), 6987-6995 (2000).</li>
<li>Kondapaka, B. S., Reddy, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+kinase+inhibitor+as+a+novel+signal+transduction+and+antiproliferative+agent%3A+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Tyrosine kinase inhibitor as a novel signal transduction and antiproliferative agent: prostate cancer.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 117 (1), 53-58 (1996).</li>
<li>Cao, F., Zhang, L., Wang, S., Zhong, D., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%5BEffectiveness+of+EGFR-TKIs+versus+chemotherapy+as+first-line+treatment+for+advanced+non-small+cell+lung+cancer%3A+a+meta-analysis%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Zhongguo+Fei+Ai+Za+Zhi%22%5BJournal%5D)">[Effectiveness of EGFR-TKIs versus chemotherapy as first-line treatment for advanced non-small cell lung cancer: a meta-analysis].</a> Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 18 (3), 146-154 (2015).</li>
<li>Dulbecco, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+turning+point+in+cancer+research%3A+sequencing+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A turning point in cancer research: sequencing the human genome.</a> Science. 231 (4742), 1055-1056 (1986).</li>
<li>Barinaga, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DoE+provides+funds+for+human+genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">DoE provides funds for human genome sequencing.</a> Nature. 331 (6152), 103(1988).</li>
<li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li>
<li>McCain, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer+genome+atlas%3A+new+weapon+in+old+war%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Healthcare%22%5BJournal%5D)">The cancer genome atlas: new weapon in old war?</a> Biotechnology Healthcare. 3 (2), 46-51 (2006).</li>
<li>Weinstein, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cancer+Genome+Atlas+Pan-Cancer+analysis+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">The Cancer Genome Atlas Pan-Cancer analysis project.</a> Nature Genetics. 45 (10), 1113-1120 (2013).</li>
<li>Carlson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+Generation+Sequencing%3A+The+Next+Iteration+of+Personalized+Medicine%3A+Next+generation+sequencing%2C+along+with+expanding+databases+like+The+Cancer+Genome+Atlas%2C+has+the+potential+to+aid+rational+drug+discovery+and+streamline+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Healthcare%22%5BJournal%5D)">Next Generation Sequencing: The Next Iteration of Personalized Medicine: Next generation sequencing, along with expanding databases like The Cancer Genome Atlas, has the potential to aid rational drug discovery and streamline clinical trials.</a> Biotechnology Healthcare. 9 (2), 21-25 (2012).</li>
<li>Huang, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+antibody+arrays%3A+a+promising+tool+to+identify+molecular+targets+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Combinatorial+Chemistry+%26+High+Throughput+Screening%22%5BJournal%5D)">Cytokine antibody arrays: a promising tool to identify molecular targets for drug discovery.</a> Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 6 (8), 769-775 (2003).</li>
<li>Kopf, E., Zharhary, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+arrays--an+emerging+tool+in+cancer+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Antibody arrays--an emerging tool in cancer proteomics.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39 (7-8), 1305-1317 (2007).</li>
<li>Rani, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+changes+in+phosphorylation+of+receptor+tyrosine+kinases%3A+antibody+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of changes in phosphorylation of receptor tyrosine kinases: antibody arrays.</a> Methods in Molecular Biology. 1233, 15-23 (2015).</li>
<li>Kani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JUN-Mediated+Downregulation+of+EGFR+Signaling+Is+Associated+with+Resistance+to+Gefitinib+in+EGFR-mutant+NSCLC+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">JUN-Mediated Downregulation of EGFR Signaling Is Associated with Resistance to Gefitinib in EGFR-mutant NSCLC Cell Lines.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16 (8), 1645-1657 (2017).</li>
<li>Brivanlou, A. H., Darnell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+and+the+control+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Signal transduction and the control of gene expression.</a> Science. 295 (5556), 813-818 (2002).</li>
<li>Rikova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+phosphotyrosine+signaling+identifies+oncogenic+kinases+in+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global survey of phosphotyrosine signaling identifies oncogenic kinases in lung cancer.</a> Cell. 131 (6), 1190-1203 (2007).</li>
<li>Chen, V. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+stage+and+clinical%2Fprognostic+factors+for+colon+and+rectal+cancer+from+SEER+registries%3A+AJCC+and+collaborative+stage+data+collection+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Analysis of stage and clinical/prognostic factors for colon and rectal cancer from SEER registries: AJCC and collaborative stage data collection system.</a> Cancer. 120, Suppl 23. 3793-3806 (2014).</li>
<li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ImageJ2%3A+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).</li>
<li>Ward, J. H. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/01621459.1963.10500845">Hierarchical Grouping to Optimize an Objective Function.</a> Journal of the American Statistical Association. 58 (301), 236-244 (1963).</li>
<li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21376230">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li>
<li>Griffin, J., et al. Array-based quantitative, automated analysis of protein glycosylation. Glycobiology. 14 (11), 1205-1206 (2004).</li>
<li>Zhou, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+ubiquitin+target+proteins+using+cell-based+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of ubiquitin target proteins using cell-based arrays.</a> Journal of Proteome Research. 6 (11), 4397-4406 (2007).</li>
<li>McGarry, T., Biniecka, M., Veale, D. J., Fearon, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2C+oxidative+stress+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Hypoxia, oxidative stress and inflammation.</a> Free Radical Biology and Medicine. , In Press (2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Benaderingen die vele biologische uitlezingen combineren zijn inherent meer nauwkeurige representaties van de cellulaire machines in een experiment uitgevoerd. De komst van phospho-antilichaam matrices kan een snelle karakterisering van het patroon van wijzigingen die mogelijk meer informatief dan de status van de wijziging van elk één eiwit. De algemene workflow voor de toepassing van phospho-antilichaam matrices is gebaseerd op een wijziging in de serine en threonine tyrosine. In het volgende voorbeeld gericht op het k...

Klinische deimplementatie van de gerichte tyrosine kinase remmers (TKI) veranderd de behandeling van kanker door artsen voorzien van effectieve instrumenten te richten op de specifieke proteïnen die schijf neoplastische transformatie. Deze stoffen remmen of blokkeren de fosforylering van eiwitten doelwit van tyrosine kinases1,2. TKIs werden ontwikkeld, gedeeltelijk omdat genetische wijzigingen in verschillende sleutel signalering genen zijn voldoende om station kanker initiatie en progressie [bijvoorbeeld, epidermale groeifactor receptor (EGFR), oncogen tyrosine-proteïne kinase Src (SRC), BCR-ABL en menselijke epidermale groeifactor receptor 2 (HER2)]3,4. De impact van TKIs op de celcyclus5 en de moleculaire signalering trajecten6 vertegenwoordigt een transformatie van de irrelevante naar de moleculair begeleide kankerbehandeling. Het belangrijkste voordeel van TKIs ten opzichte van chemotherapie is de verhoogde respons en het lager risico van toxiciteit voor gezonde cellen7. Dientengevolge, is er toegenomen aandacht voor het onderzoek en de ontwikkeling van roman TKIs.
Toegang tot de resultaten van het genoom sequentiebepaling begonnen met het Human Genome Project8,9,10 en blijft vandaag met verschillende volgende-generatie (NextGen) kanker sequencing inspanningen [bijvoorbeeldde kanker genoom Atlas (TCGA)11,12]. Dit heeft inspireerde vele experimentele methodologieën die gelijktijdige informatie verschaffen over duizenden genen en/of verstrekken van onbevooroordeelde momentopnamen van genen of eiwitten door biologische verstoringen13gemoduleerd. Aangezien de verordening van de cellulaire functie op meerdere niveaus, van de transcriptie van genen de posttranslationele wijziging van eiwitten en hun activiteit gebeurt, zal een volledig inzicht in de gebeurtenissen controleren de cellulaire functie uiteindelijk moeten een integratie van gegevens uit verschillende biologische uitlezingen. De mogelijkheid om te controleren de boodschapper-RNA (mRNA) niveaus van duizenden genen met een eencellige gen-resolutie is de mogelijkheid om gevolgtrekkingen over de genfunctie en interacties op de schaal van een geheel-genoom toegenomen. De interpretatie van gen expressie arrays zullen echter altijd inherent niet compleet zonder de integratie van andere niveaus van verordening: namelijk de eiwitniveaus voor expressie, de eiwit wijziging Staten en het eiwit posttranslationele wijzigingen (fosforylering, ubiquitylation, methylering, enz.). Hier beschrijven we het nut van antilichaam arrays als middel om te ondervragen posttranslationele modificaties van belangrijke onderdelen van de signalering als een functie van de verschillende omstandigheden in een enkele experiment14,15,, 16.
Phospho-antilichaam arrays kunnen worden gebruikt om te onderscheiden en analyseren van wijzigingen in het signaaltransductie trajecten16. Dit kunnen voortvloeien uit een genetische modificatie of behandelingen van cellijnen met kinase-remmers, chemotherapeutica, stress veroorzaakt door glucose ontbering, hypoxie of serum honger. Opmerking, resistentie tegen geneesmiddelen of een specifiek gen up- of Downregulatie kan ook leiden tot wijzigingen in de signaaltransductie trajecten17.
Resistentie tegen geneesmiddelen, bijvoorbeeld, kan ontstaan van mutaties voor de drug target om te voorkomen dat de gevoeligheid. In longkanker, bekend EGFR mutaties maken de kanker insusceptible aan bepaalde TKIs, maar meer vatbaar zijn voor anderen. Alternatief signalering trajecten kan worden geactiveerd bij mutatie17. Als een bredere toepassing voor de identificatie van het signaaltransductie trajecten die betrokken zijn bij weerstand en hypoxie, enz, phospho-antilichaam matrices meer inzicht verschaffen, en bijgevolg begrip van, de mechanismen die betrokken zijn.
Technologieën die een evaluatie van eiwit wijzigingen vertegenwoordigen een belangrijk onderdeel van de systeembiologie, omdat ze vaak een regelgevende functie dienen, zoals het moduleren van de activiteit van een enzym of de fysieke interactie tussen proteïnen. Het belang van posttranslationele modificaties wordt geïllustreerd door de rol van de proteïne fosforylatie in bijna alle extracellulaire geactiveerd signaaltransductie trajecten18. Traditioneel, kan de identificatie van kinases of de status van de fosforylering van eiwitten ook worden bepaald door westelijke vlekkenanalyse, vooral als de onderzoeker geïnteresseerd in alleen 1 – 5 doelen is. Western blots zijn echter zeer selectief en kunnen een vertekend beeld geven richting voorkennis en belangrijke doelstellingen als gevolg daarvan zou kunnen missen. Antilichaam-array(s) bieden een middellange-doorvoer uitlezing van meerdere doelen door verschillende opname-antilichamen [pan-specifieke gefosforyleerd tyrosine(s), anti-ubiquitin, enz.] op een stevige matrijs (bijvoorbeeld, glas of nitrocellulose) insluiten. Secundaire antilichamen bevatten informatie over specifieke eiwitten in een sandwich-ELISA opmaak (Figuur 1). Deze test wordt krachtiger en relevante als meer doelen van belang zijn of de voorkennis beperkt15 is. De phospho-arrays zijn breder inzetbaar als ze kunnen fosforylatie, alsmede algemene hoeveelheden eiwit van een breder scala van doelstellingen in één experiment vergelijken en een beduidend betere kwantificering over massaspectrometrie bieden. Deze techniek is niet van toepassing voor de identificatie van nieuwe of voorheen onbekende fosforylatie sites.
Grootschalige massa spectrometrie gebaseerde proteomics kan worden aangewend om te identificeren specifieke fosforylering van eiwitten19. Hoewel deze techniek duizenden posttranslationele gebeurtenissen opsommen kunt, vereist het dure instrumentatie, speciale experimentele pijpleidingen en een computationele expertise die buiten het bereik van de meeste onderzoekers.
Antilichaam matrices geven een gelijktijdige uitlezing op verschillende eiwit uitlezingen16. Voorbeelden hiervan zijn veranderingen in het eiwit ubiquitylation (ubiquitin matrix) of fosforylering. Het belangrijkste voordeel van deze matrix-technologie is dat het belangrijke feedback over de biologische toestand van diverse biologische trajecten die zijn gekoppeld aan belangrijke cel parameters (eiwit van 53 kDa, p53 receptor tyrosine kinases en intracellulaire trajecten geeft) tegelijkertijd. Daarnaast is het mogelijk te combineren verschillende van de matrix te verhogen van de penetratie van een assay (b.v., apoptosis en ubiquitin en fosforylering). Dit vermogen om het combineren van meerdere arrays om te beoordelen van verschillende posttranslationele wijzigingen in verschillende monsters tegelijk op een tijd en goedkoop cost-effective wijze die geen specifieke instrumentatie of expertise vereist is van een aanzienlijk voordeel in het geval antilichaam-arrays.

<table><tbody><tr><td>Odysee SA Imager</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>Fluorescent Imager</td></tr><tr><td>1.5 mL tube</td><td>Eppendorf</td><td>22363212</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>Falkon (Corning)</td><td>353085</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeco's Phosphate buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>wash buffer voor eiwitextractie</td></tr><tr><td>Tissue Culture dish 100 mm</td><td>TRP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>ICC Insulin syringe U100</td><td>Becton Dickinson</td><td>329412</td><td>27 G5/8,&nbsp; 1 mL voor naaldbehandeling van eiwitmonsters</td></tr><tr><td>Protein Profiler ARRAY&nbsp;</td><td>R&amp;D</td><td>ARY003B</td><td>Humane fosfo MAPK-array</td></tr><tr><td>Protein Profiler ARRAY&nbsp;</td><td>R&amp;D</td><td>ARY002B</td><td>Humane fosfo kinase-array</td></tr><tr><td>Centrifuge Eppendorf 5430R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Tischzentrifuge</td></tr><tr><td>Pierce BCA protein assay kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMAX M2</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Absorptiometer voor eiwitkwantificering</td></tr><tr><td>IRDye 800CW Streptavidin</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>925-32230</td><td>Streptavidine-conjugaat voor fluorescente detectie</td></tr><tr><td>LabGard ES Class II, Type A2 biosafety cabinet</td><td>NuAire</td><td>NU-425-400</td><td>Weefselkweekkap</td></tr><tr><td>TC20 automated cell counter</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td>Celteller</td></tr><tr><td>Halt Protease &amp; Phosphatase Inhibitor Cocktail (100x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>78446</td><td></td></tr><tr><td>RIPA buffer</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>F60</td><td>Sonicator</td></tr><tr><td>Rocking platform shaker</td><td>VWR</td><td>10860-780</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH open source</td><td></td><td>https://imagej.net/Welcome</td></tr><tr><td>SAS Institute JMP&reg; 12.1.0 (64-bit)</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

beoordeling van weerstand tegen tyrosine kinase remmers door een ondervraging van signaaltransductie trajecten door antilichaam arrays

Assessment of Resistance to Tyrosine Kinase Inhibitors by an Interrogation of Signal Transduction Pathways by Antibody Arrays

Kankerpatiënten met een afwijkende regeling van de proteïne fosforylatie netwerken worden vaak behandeld met de tyrosine-kinase-remmers. Berekening van responsrates bijna 85% zijn gemeenschappelijk. Helaas, patiënten vaak geworden vuurvaste op de behandeling door een wijziging van hun signaaltransductie trajecten. Een implementatie van de expressie profilering met microarrays kan het identificeren van de wijzigingen die over het algemeen mRNA-niveau, en proteomics herkent de algemene veranderingen in eiwitniveaus of herkent de eiwitten die betrokken zijn, maar de activiteit van de signaaltransductie trajecten kunnen alleen worden vastgesteld door het ondervragen van posttranslationele modificaties van de eiwitten. Dientengevolge, is de mogelijkheid om te identificeren of een medicamenteuze behandeling succesvol is of weerstand ontstaan, of de mogelijkheid te karakteriseren van eventuele wijzigingen in de signaalroutes, een belangrijke klinische uitdaging. Wij bieden hier een gedetailleerde uitleg van antilichaam arrays als een hulpmiddel dat systeembrede wijzigingen in verschillende posttranslationele modificaties (b.v., fosforylatie identificeren kan). Een van de voordelen van het gebruik van antilichaam arrays omvat hun toegankelijkheid (een matrix hoeft niet een expert in proteomics of dure apparatuur) en snelheid. De beschikbaarheid van arrays gericht op een combinatie van posttranslationele modificaties is de primaire beperking. Bovendien, wellicht onbevooroordeelde benaderingen (Fosfoproteomics) meer geschikt voor de nieuwe ontdekking, overwegende dat antilichaam-arrays ideaal voor de meest gekarakteriseerd doelstellingen zijn.

Om te onderzoeken van het effect van TKI weerstand op signaaltransductie trajecten in cellijnen, werden vier monsters geanalyseerd. Een controlemonster (H3255r1) en 3 TKI-resistente cellijnen (H3255r2-4) (Figuur 2) hadden betrekking op de plek antilichaam-sjabloon (Figuur 3). Alle 4 monsters werden opgesteld op basis van dit protocol. Zes phosphoproteins met differential activiteit werden gekozen voor de demonstratie van de analy...

Hier presenteren we een protocol voor antilichaam arrays om te identificeren van de wijzigingen in de signaalroutes in verschillende cellulaire modellen. Deze veranderingen, veroorzaakt door drugs/hypoxie/ultra-violet licht/straling, of overexpressie/Downregulatie/uitsparingen, zijn belangrijk voor verschillende modellen van de ziekte en kunnen aangeven of een therapie effect sorteren zullen of mechanismen van drugs kan identificeren weerstand.

Beoordeling van weerstand tegen Tyrosine Kinase remmers door een ondervraging van signaaltransductie trajecten door antilichaam Arrays

Cancer patients with an aberrant regulation of the protein phosphorylation networks are often treated with the tyrosine kinase inhibitors. Response rates ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over verstoringen in signalering netwerken die kankergroei of de ontwikkeling van resistentie tegen specifieke therapieën kan veroorzaken. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het snelle en betrouwbare feedback kan geven over de fosforylatietoestand van meerdere netwerken die vaak worden gedereguleerd bij kanker. De implicatie van deze techniek strekt zich uit tot therapie van resistente kankers, omdat identificatie van veranderingen en post-translationele wijzigingen veranderingen in signaaltransductierouteactiviteit kan verduidelijken.Hoewel deze techniek wordt gebruikt op fosforylatie, kan het ook worden gebruikt om te kijken naar andere post-translationele wijzigingen zoals glycosylation en alomtegenwoordigheid. Begin met het grondig spoelen 's nachts gekweekte cellen drie keer met 10 milliliter PBS die ervoor zorgen om alle PBS te verwijderen na de laatste wasbeurt. Voeg vervolgens het juiste volume lysebuffer toe aan de eiwittestkit en gebruik een celschraper om de cellen los te maken.Triturate de resulterende celoplossing ongeveer 10 keer voordat u ten minste één keer 10 naar de zevende cellen

assessment-resistance-to-tyrosine-kinase-inhibitors-an-interrogation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kankeronderzoek

RPPA kan de eiwitexpressie van honderden monsters gedrukt op nitrocellulose dia gelijktijdig worden uitgelezen met behulp van fluorescent gelabelde antilichamen. Deze techniek is toegepast om het effect van medicamenteuze behandeling heterogeniteit studeren in clear cell niercarcinoom.

Het gebruik van omgekeerde fase eiwitseries (RPPA) naar Protein Expression Variatie Verkennen binnen Individuele Nier cel kankers

Receptor tyrosine kinases worden ectopisch uitgedrukt in vele kanker en zijn geïdentificeerd als therapeutische doelwitten bij acute leukemie. Dit manuscript beschrijft een efficiënte strategie voor pre-klinische evaluatie van tyrosine kinase inhibitoren voor de behandeling van acute leukemie.

Pre-klinische evaluatie van tyrosinekinaseremmers voor de behandeling van acute leukemie

Opkomst van genetische resistentie tegen kinase remmer therapie vormt een serieuze uitdaging voor een effectieve behandeling van kanker. Identificatie en karakterisatie van resistente mutaties tegen een nieuw ontwikkelde geneesmiddel helpt bij een betere klinische behandeling en de volgende generatie geneesmiddelen. Hier beschrijven we ons protocol in vitro screening en validatie van resistente mutaties.

Een werkwijze voor het screenen en Validatie van Resistente Mutaties Tegen kinaseremmers

Peptide array screening is een hoogdoorlaattest voor het identificeren van interactieplaatsen tussen eiwitten. Dit maakt het mogelijk om meerdere interacties van een doeleiwit in kaart te brengen en kan dienen als een methode voor het identificeren van plaatsen voor remmers die een eiwit aanspreken. Hier beschrijven we een protocol voor het screenen en analyseren van peptide arrays.

Het identificeren van eiwit-eiwit interacties sites maken met Peptide Arrays

Geneesmiddelresistentie voor gerichte therapeutica is wijdverbreid en de noodzaak om resistentiemechanismen te identificeren - voor of na de eerste klinische verschijnselen - is essentieel voor het geleiden alternatieve klinische strategieën. Hier presenteren we een protocol te koppelen afleiding van resistente lijnen in vitro sequentiebepaling ontdekking van deze mechanismen te bespoedigen.

Invoer van<em&gt; In Vitro</em&gt; Drug Resistance Testen: maximaliseren van het potentieel voor het blootleggen van klinisch relevante resistentiemechanismen

Dit is een tijd - en goedkoop cost-effective in vitro protocol van het onderzoek naar de mechanismen van verworven resistentie aan gerichte therapeutische agenten, dat is een zeer onvervulde medische noodzaak in kanker beheer.

Op zoek naar de bestuurder trajecten van verworven resistentie aan gerichte therapie: resistente Subclone generatie en gevoeligheid herstellen door Gene Knock-down

We beschrijven hier protocollen voor de validatie van het genetische en chemische van c-Fos en Dusp1 als een drug target in met behulp van in vitro en in vivo genetische en gehumaniseerd Muismodellen leukemie. Deze methode kan worden toegepast op een doelwit voor genetische valideren en therapeutische ontwikkeling.

Methoden voor de evaluatie van de rol van c-Fos en Dusp1 in afhankelijkheid van de oncogen

Deze paper gebruikt een stroom cytometry-gebaseerde assay naar scherm bibliotheken van chemische inhibitoren voor de identificatie van remmers en de bijbehorende doelen die van invloed zijn T-cel receptor signalering. De hier beschreven methoden kunnen ook worden uitgebreid voor high-throughput screening.

Identificatie van bemiddelaars/Mediators van T-cel Receptor signalering via de Screening van chemische remmer bibliotheken

Een gedetailleerd protocol voor het genereren van zelf-geassembleerde humane eiwit arrays voor de screening van kinase remmers wordt gepresenteerd.

Kinase remmer screening in zelf-geassembleerde humane Eiwit Microarrays

Hier presenteren we een protocol om de werkzaamheid van gerichte therapieën geselecteerd op basis van de genomische samenstelling van een tumor te testen. Het protocol beschrijft identificatie en validatie van structurele DNA-herschikkingen, engraftmentatie van tumoren van patiënten in muizen en het testen van reacties op overeenkomstige geneesmiddelen.

Testen gerichte therapieën bij kanker met behulp van structurele DNA-wijzigingsanalyse en patiënt-afgeleide Xenografts

Tijd-opgeloste Förster resonantie energieoverdracht cel-gebaseerde assay protocollen worden beschreven voor de eenvoudige, specifieke, gevoelige en robuuste kwantificering van endogene gefosforyleerde signaal transducer en activator van transcriptie (STAT) 1/3/4/5/6 eiwitten in cellysaten in een 384-well formaat.

Tijd-opgeloste Förster Resonantie Energie Transfer Assays voor meting van endogene gefosforyleerde STAT-eiwitten in menselijke cellen

Ontdek hoe antilichaam arrays signaaltransductieveranderingen identificeren in kankercellen. Deze methode geeft snelle inzichten in fosforyleringstoestanden en therapieresistentie mechanismen.

Beoordeling van weerstand tegen Tyrosine Kinase remmers door een ondervraging van signaaltransductie trajecten door antilichaam Arrays (Video) | JoVE Journal

Beoordeling van weerstand tegen Tyrosine Kinase remmers door een ondervraging van signaaltransductie trajecten door antilichaam Arrays

Meer video's verkennen