Eencellige analyse van Immunophenotype en Cytokine productie in perifere bloed via massale Cytometry
26 juni 2018
Hier beschrijven we een eencellige proteomic aanpak om te evalueren van immuun fenotypische en functionele (intracellulaire cytokine inductie) veranderingen in het perifere bloedmonsters geanalyseerd via massale cytometry.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van auto-immuniteit, zoals het identificeren van abnormaliteiten in celfrequentie en functieverschille zoals de productie van belangrijke cytokinen in de context van auto-immuunziekten. Het grote voordeel van deze methode is dat het een breed repertoire of verschillende celtypen en functieverschille kan vastleggen uit een gemakkelijk verkrijgbare monster van perifeer bloed. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn in dit proces moeite hebben met het goed inschatten van de timing van de bloedverwerkingsstappen, de ontwerp van het antilichaampaneel, het barcodeproces zelf en de analyse van hoogdimensionele enkele celgegevens.
Deze systeemimmunologie-aanpak is bijzonder geschikt voor auto-immuunziekten zoals SLE waar immuundysregulatie alomtegenwoordig en duidelijk is in perifeer bloed. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk om de timing van stappen te verduidelijken en ook om te laten zien hoe meerdere monsters kunnen worden gebarcodet en gepoold vóór massa-cytometrieanalyse. Om deze procedure te starten, plaats de gelabelde ronde bodempolystyreenbuisjes van vijf verschillende omstandigheden voor hele bloedverwerking op een rek.
Voeg vervolgens een milliliter van 37 graden Celsius RPMI toe aan elke buis. Voeg vervolgens een milliliter heel bloed toe aan elke buis en pipet om en om om grondig te mengen met RPMI. Voeg vervolgens 10 microliters voorverdunde ruxolitinib toe aan de buis gelabeld T zes plus vijf R en meng grondig.
Plaats de rek met buisjes in de incubator op 37 graden Celsius en begin met het timen van de incubatie. Om de T nul-steekproef te verwerken, pipet de volledige inhoud van de T nul-buis in een gelabelde conische buis met 20 milliliter 37 graden Celsius lys/fix-buffer op werkconcentratie. Om de celherstel te optimaliseren, spoel de buis met lys/fix-buffer en meng door de conische buis om te draaien.
Incubeer de cellen op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten om lys en fixatie mogelijk te maken. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 500 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Decanteer daarna de supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in één milliliter ijskoud PBS om de pellet te breken.
Vul vervolgens de conische buis aan tot een volume van 15 milliliter met PBS. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 500 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Suspendeer de cellen opnieuw in één milliliter CSM om de pellet te breken.
Breng vervolgens het monster over naar een gelabelde microcentrifugebuis voor antilichaamkleuring. Tel de cellen met een monster van 10 microliters met een geautomatiseerde celteller. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 500 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.
Aspireer daarna het supernatant, waarbij het pellet in ongeveer 60 microliter restant achterlaat. Bewaar dit pellet op ijs tot de monsters van andere omstandigheden de verwerking hebben voltooid. Bij T gelijk aan 30 minuten, verplaats de buisrek naar de weefselcultuurkap.
Voeg 10 microliters R848 toe bij 0,1 gram per microliter aan de T zes plus R848 buis en meng grondig. Voeg vervolgens 10 microliters LPS toe bij 0,01 microgram per microliter aan de T zes plus LPS buis en meng grondig. Voeg daarna vier microliters eiwittransportremmer toe aan de buizen gelabeld T zes, T zes plus vijf R en T zes plus LPS en breng de monsters terug naar de incubator tot T gelijk aan zes uur.
Meng de monsters grondig met een P1000 pipet elke twee uur. Bij T gelijk aan twee uur, voeg vier microliters eiwittransportremmercocktail toe aan de T zes plus R848 buis. Meng alle monsters en breng de rek terug naar de incubator tot T gelijk aan zes uur.
Bij T gelijk aan vier uur, meng de monsters nog een keer met een P1000 pipet. Bij T gelijk aan zes uur, verwerk T zes, T zes plus LPS, T zes plus R848 en T zes plus vijf R bloedsteekproevenbuisjes zoals beschreven voor de T nul-steekproef. Bewaar vervolgens de pellets in restant CSM-volume bij min 80 graden Celsius om later te verwerken.
Om de geliste, gefixeerde cellen te barcoden, ontdooi de monsters uit de opslag van min 80 graden Celsius langzaam op ijs. Verdun de 10X barcoden permissiebuffer met PBS met een verhouding van één tot tien en maak genoeg buffer voor drie milliliter per monster. Vul één niet-steriele trog met CSM en één met de een X barcoden permissiebuffer.
Voeg vervolgens één milliliter ijskoud CSM toe aan de vers ontdooide monsters, meng grondig en breng over naar de respectieve vooraf gelabelde polypropyleen clusterbuisjes. Neem nu een monster van 10 microliter en tel de cellen met een geautomatiseerde celteller. Normaliseer de celtellingen in elke clusterbuis door het volume van overtollige cellen te verwijderen.
Centrifugeer vervolgens de cellen bij 600 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Suspendeer de cellen opnieuw in één milliliter van een X barcoden permissiebuffer met een multikanaals pipet en centrifugeer bij 600 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aspireer daarna het supernatant weg.
Schik de clusterbuisjes op een rek in dezelfde volgorde als aangegeven op de barcodesleutel, zodat het monster overeenkomt met zijn barcode. Voeg 800 microliters van een X barcoden permissiebuffer toe met een multikanaals pipet aan alle monsters in de clusterbuisjes zonder de celpellet aan te raken om celverlies te verminderen. Zet vervolgens de rek met de clusterbuisjes opzij.
Verwijder de 20-plex palladium barcoden kit buisjes uit min 20 graden Celsius en ontdooi ze op kamertemperatuur. Voeg 100 microliters van een X barcoden permissiebuffer toe, meng grondig en breng 120 microliters van de opnieuw gesuspendeerde barcodemix over naar de corresponderende celmonsters in de clusterbuisjes. Meng grondig met een multikanaals pipet zodat er geen kruisbesmetting is tussen afzonderlijk gebarcodete monsters.
Incubeer de clusterbuisjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de barcodes toe te laten staan de cellen te labelen. Na 30 minuten, centrifugeer de monsters bij 600 keer G gedurende vijf minuten bij
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een proteomische benadering met één cel om immuunfenotypische en functionele veranderingen in perifere bloedmonsters te evalueren met behulp van massa-cytometrie. Deze methode is bijzonder relevant voor het bestuderen van auto-immuunziekten.
Belangrijke studiecomponenten
Wetenschapsgebied
- Immunologie
- Auto-immuniteit
- Massa-cytometrie
Achtergrond
- Identificeren van celfrequentieafwijkingen bij auto-immuunziekten.
- Begrip van functionele verschillen in cytokineproductie.
- Gebruik maken van gemakkelijk verkrijgbare perifere bloedmonsters.
- Aanpak van uitdagingen bij bloedverwerking en data-analyse.
Doel van het onderzoek
- Om immuundysregulatie bij auto-immuunziekten te evalueren.
- Om de methodologie voor het verwerken van bloedmonsters te demonstreren.
- Om de timing van verwerkingsstappen en analyse te verduidelijken.
Gebruikte methoden
- Proteomische analyse met één cel.
- Massa-cytometrie voor hoogdimensionale data.
- Barcoding en poolen van monsters.
- Visuele demonstratie van de methodologie.
Belangrijkste resultaten
- Succesvolle identificatie van immuuncelfenotypen.
- Demonstratie van functionele verschillen in cytokineproductie.
- Effectieve verwerking van meerdere monsters.
- Verduidelijking van de timing en stappen in de methodologie.
Conclusies
- Deze methode biedt inzichten in immuundysregulatie bij auto-immuunziekten.
- Het benadrukt het belang van juiste monsterverwerking en analyse.
- Visuele hulpmiddelen kunnen het begrip van complexe methodologieën verbeteren.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
This method enables comprehensive immune profiling of peripheral blood to identify cell frequency abnormalities and cytokine production differences in autoimmune disease contexts. By capturing both phenotypic and functional immune parameters from easily obtainable samples, it supports target validation and mechanistic de-risking in early discovery. The approach facilitates preclinical model relevance and translational biomarker alignment for portfolio triage decisions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses through simultaneous measurement of immune cell phenotypes and cytokine functions.
- Operational Value: Supports biological de-risking by identifying dysregulated immune subsets and their functional outputs in disease-relevant systems.
- Predictive Value: Provides quantitative dependent variable measurements that enhance target confidence and inform lead identification strategies.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by establishing reproducible immune cell stimulation and cytokine readout protocols.
- Operational Value: Addresses assay standardization and scalability through barcoding-enabled multiplexed sample processing.
- Screening Readiness: Generates quantitative outputs that enable reliable compound evaluation across immune cell subsets and signaling pathways.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery-phase immune profiling to preclinical validation through disease-relevant system modeling.
- Biomarker Alignment: Supports identification of cytokine production patterns that correlate with therapeutic response or disease state.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by clarifying mechanistic links between immune modulation and functional outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing immune phenotyping and functional readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by linking specific stimuli to cytokine induction in defined immune cell subsets.
- Screening: Delivers assay readiness and reproducibility through standardized stimulation, fixation, and barcoding procedures.
- Analytics: Enables high-dimensional single-cell measurements that allow comparison of immune responses across conditions and timepoints.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling immune dysregulation in peripheral blood samples relevant to autoimmune disease mechanisms.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for immune monitoring across multiple projects and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through mechanistic de-risking of immune targets and reduction of functional ambiguity in complex disease models.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via barcoding and pooled sample analysis.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk via early immune phenotype-function correlation.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative immune profiling data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, flow/mass cytometry, and high-dimensional data analysis.
- Depends on instrumentation for cell stimulation, barcoding, and mass cytometry acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, stimulation protocols, and gating strategies.
- Involves adaptation considerations across model systems, particularly for ex vivo whole blood processing.
- Includes practical limitations related to sample processing timing and antibody panel design complexity.
