Name: Eencellige analyse van Immunophenotype en Cytokine productie in perifere bloed via massale Cytometry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 36 s
Description: Leer een eencellige proteomics-methode voor immunofenotypering en cytokineproductie in perifeer bloed met massale cytometrie. Deze techniek helpt bij het bestuderen van immuundysregulatie bij auto-immuunziekten.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

We zouden graag bedanken Aimee Pugh-Bernard voor haar intellectuele input en nuttige opmerkingen. Dit werk werd gesteund door de biomedische Research Award Boettcher Stichting Webb-Waring en getal K23-1K23AR070897 van de NIH tot Elena W.Y. Hsieh. Ze werd ook ondersteund door award aantal K12-HD000850 van het nationale Instituut van Eunice Kennedy Shriver Child Health en menselijke ontwikkeling en de Lucile Packard Foundation voor kinderen gezondheid, Stanford CTSA UL1 TR001085 en kind gezondheidsonderzoek Instituut van Stanford University.

Alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de Colorado meerdere institutionele Review Board (COMIRB) van de Universiteit van Colorado. Alle onderstaande beschreven procedures moeten worden uitgevoerd in een steriele weefselkweek kap, tenzij anders aangegeven, met gefilterde Pipetteer tips, en alle reagentia gefilterd.
1. bereiding van reagentia voor perifere bloed verwerking
<ol><li>Bereiden ruxolitinib voorraad aliquots (10 – 15 μl/injectieflacon voor eenpersoonsgebruik) op 10 mM door verdunning van het gelyofiliseerd reagens in DMSO volgens de instructies van de fabrikant (winkel bij-80 ° C). DMSO concentraties in alle tests met inbegrip van ongestimuleerde controles minder dan 0,2% (vol/vol) houden</li>
	<li>Bereiden van R848 (resiquimod) voorraad aliquots (10 – 15 μl/injectieflacon voor eenpersoonsgebruik) bij 1 μg/μL door verdunning van het gelyofiliseerd reagens in steriel water als de per de instructies van de fabrikant. Winkel bij-80 ° C.</li>
	<li>Lipopolysaccharide (LPS) voorraad aliquots (5 μL per flacon voor slechts één keer wordt gebruikt) op 1 μg/l bereid door verdunning van het gelyofiliseerd reagens in steriel water volgens instructies van de fabrikant. Winkel bij-80 ° C.</li>
	<li>De cel kleuring Media (CSM) met behulp van PBS, 0,5% BSA en 0,02% NaN3voor te bereiden.</li>
	<li>Verwerven en de eiwit vervoer remmer (PTI) cocktail (Tabel of Materials) klaar te houden.</li>
	<li>Ontdooien en Verdun de ruxolitinib voorraad flacon (10 mM) 1:10 in steriele PBS (1 mM). Gereserveerd bij kamertemperatuur in een weefselkweek kap.</li>
	<li>Ontdooien en Verdun de R848 voorraad flacon (1 μg/µL) 1:10 in steriele PBS (0.1 μg/µL). Gereserveerd bij kamertemperatuur in een weefselkweek kap.</li>
	<li>Ontdooien en Verdun de LPS voorraad flacon (1 μg/µL) 1:100 in steriele PBS (0,01 μg/µL). Gereserveerd bij kamertemperatuur in een weefselkweek kap.</li>
	<li>Vooraf warm steriele RPMI (geen L-glutamine) in een waterbad standaard 37 ° C (voor minstens 10 min).</li>
	<li>Verdun de lyse/fix buffer door 1:5 in gefilterde ddH2O (werken concentratie) op de benchtop (hoeft niet te worden steriel). Opmerking: vereist 1 mL bloed 20 mL werken concentratie van lyse/fix buffer.<ol>
<li>Maken van lyse/fix buffer voor 5 voorwaarden voor 1 mL volbloed elke (minstens 100 mL). Aliquot 20 mL van de concentratie van de werken van lyse/fix buffer in de conische buizen 50 mL per milliliter van volbloed (Houd de lyse/fix oplossing bij 37 ° C, totdat het nodig is). De omstandigheden op de conische buisjes met lyse/fix buffer als volgt labelen: T0 (tijd nul), T6 + 5R (tijd 6 h met 5 uM ruxolitinib), T6 + R848 (tijd 6 h met 1 μg/mL R848), T6 + LPS (tijd 6 h met 0,1 μg/mL LPS), T6 (tijd 6 h).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Label ronde onder steriele polystyreen buizen met caps en 1 mL microcentrifuge buizen met de dezelfde nomenclatuur zoals in stap 1.10.</li>
</ol>2. stimulatie en verwerking van perifere bloed (Figuur 1)
<ol><li>Plaats de gelabelde ronde onderkant polystyreen buizen uit stap 1.11 (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6) op een rek. Opmerking: Al de volgende stappen worden uitgevoerd in dit soort buis tenzij anders is bepaald. Cap de buizen bij het overbrengen van tussen de weefselkweek kap en incubator te handhaven van de steriliteit.</li>
	<li>Voeg 1 mL van 37 ° C RPMI (geen L-glutamine) toe aan elk van de buizen (T0, T6 + 5R, T6 + R848, T6 + LPS, T6). De bloed collectie buis meerdere malen omkeren, voeg 1 mL bloed aan elke buis en Pipetteer op en neer meerdere keren meng met RPMI (verdunning met RPMI verhindert samendoen van het bloed tijdens de incubatietijd van 6 h).</li>
	<li>Voeg 10 μL van de 1:10 ruxolitinib T6 + 5R. Meng met een pipet P1000. Plaats het rek van buizen in de incubator bij 37 ° C en beginnen timing de incubatie (T = 0).</li>
	<li>De T0-monster als volgt verwerken.<ol>
<li>Pipetteer de volledige inhoud van de T0-buis in een gelabelde conische buis met 20 mL van 37 ° C werken concentratie lyse/fix buffer. Spoel voor het optimaliseren van herstel van de cel, de buis met werken concentratie lyse/fix buffer. Meng door het omkeren van de conische buis.</li>
		<li>Incubeer bij 37 ° C gedurende 15 minuten zodat lysis en fixatie. Voer alle volgende stappen bij de benchtop na fixatie. Centrifugeer cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Giet het supernatant. Resuspendeer de cellen in de koude PBS ijs te breken van de pellet 1 mL, vul dan de conische tot een volume van 15 mL met PBS.</li>
		<li>Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Giet het supernatant. Herhaal de PBS wash (stappen 2.4.3–2.4.4) als pellets rood zijn. Resuspendeer de cellen in 1 mL van CSM te breken van de pellet, dan naar de gelabelde microcentrifuge buis (stap 1.11) voor het antilichaam kleuring. Neemt een 10 µL monster aan cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller of hemocytometer tellen. Opmerking: Aangezien alle cellen op dit punt worden opgelost, is het niet nodig om een vlek van de levensvatbaarheid.</li>
		<li>Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De bovendrijvende vloeistof, waardoor de pellet in ~ 60 µL van restvolume gecombineerd. Houd deze pellet op ijs totdat monsters van andere voorwaarden hebt voltooid verwerking.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bij T = 30 min, de buis rack (stap 2.3) naar de weefselkweek kap en uitvoeren van de volgende handelingen uit.<ol>
<li>Voeg 10 μL van de 0.1 μg/μL R848 T6 + R848. Meng met een pipet P1000.</li>
		<li>Voeg toe 10 μL van de 0,01 μg/μL LPS aan T6 + LPS. Meng met een pipet P1000.</li>
		<li>4 μL van eiwit vervoer remmer (voorraad bij 500 X) toevoegen aan T6, T6 + 5R, en T6 + LPS (maar niet naar T6 + R848) en terug van de monsters naar de incubator tot T = 6 h. Mix grondig met een pipet P1000 elke 2 h. Opmerking: R848 is een endoplasmic TLR-agonist en vereist bijgevolg een tijdelijke vertraging in de toevoeging van de eiwit-vervoer-remmer te voorzien in toegang tot haar doel-receptor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Op T = 2 h, 4 μL van eiwit vervoer remmer cocktail (voorraad bij 500 X) toevoegen aan de T6 + R848 buis. Meng alle monsters met een pipet P1000 en terug het rack naar de incubator tot T = 6 h.</li>
	<li>Meng de monsters met een P1000 nog een keer op T = 4 h.</li>
	<li>Op T = 6 h, verwerken T6, T6 + LPS T6 + R848 en T6 + 5R bloed monster buizen zoals beschreven in stap 2.4 voor de T0-monster.</li>
	<li>Bewaar de cel pellets in restvolume CSM-80 ° c te verwerken op een toekomstige datum. U kunt ook overgaan tot barcoding en antilichaam kleuring zonder op te slaan.</li>
</ol>3. de Barcode van bloedcellen Lysed/vast
<ol><li>Ontdooi de lysed/vaste celsteekproeven van de opslag-80 ° C langzaam op het ijs; een maximum van 20 monsters kan worden aangeduid met unieke barcodes en gebundeld met behulp van dit systeem. Verdun de 10 X barcoding perm buffer door 1:10 met PBS; het maken van genoeg buffer voor ~ 3 mL per monster.</li>
	<li>Vul één niet-steriele trog met de CSM en één met de 1 X barcoding perm buffer. Voeg vervolgens 1 mL van ijs koud CSM aan vers ontdooid samples, meng met een pipet en overbrengen naar de respectieve vooraf gelabelde polypropyleen cluster buizen.</li>
	<li>Neemt een 10 μL monster aan cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller of hemocytometer tellen. Normaliseren van de graven van de cel voor 1.5-2 x 106 cellen per monster in elke cluster buis: verwijderen en het volume van overtollige cellen boven 2 x 106 cellen negeren.</li>
	<li>Centrifugeer de cellen bij 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de cellen in 1 mL van de 1 X barcoding perm buffer met een meerkanaalspipet en centrifuge op 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gecombineerd uit het supernatant.</li>
	<li>Line-up de cluster buizen op een rek in dezelfde volgorde zoals aangegeven op de barcode-sleutel, zodat het monster overeenkomt met met de barcode. Voeg toe aan alle monsters in de cluster buizen 800 μL 1 X barcoding perm buffer door meerkanaalspipet zonder te raken de pellet van de cel met de uiteinden van de Pipet (geen menging) te verminderen cel verlies. Terzijde van het rek met de cluster-buizen.</li>
	<li>Verwijder 20-plex Pd Barcoding Kit buis strips van-20 ° C en ontdooien bij kamertemperatuur. Voeg 100 l 1 X barcoding perm buffer, meng en breng 120 μl van de geresuspendeerde barcode mix in de overeenkomstige celsteekproeven in de cluster buizen.</li>
	<li>Meng door meerkanaalspipet zodat er geen kruisbesmetting tussen individueel barcoded monsters. Incubeer cluster buizen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur toe de barcodes op het etiket van de cellen.</li>
	<li>Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer in 1 mL van CSM.</li>
	<li>Centrifugeren en resuspendeer in CSM weer zoals in stap 3.8. Opmerking: Elk monster wordt nu aangeduid met een unieke barcode en monsters zijn klaar om te worden samengevoegd.</li>
	<li>Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en de bovendrijvende substantie gecombineerd. Met een enkele pipet en gebruik van de dezelfde tip, overdracht van alle cel pellets in ~ 70-80 μL restvolume aan één polystyreen buis. Het uiteinde van de pipet; verwijdert niet gereserveerd de één pipet met deze tip.</li>
	<li>Toevoegen met een meerkanaalspipet en nieuwe tips, ~ 100 μl CSM aan elke oorspronkelijke cluster buis te maximaliseren van de terugwinning van de cel. Met de één pipet met de tip dat opzij werd gezet, door alle cel pellets in ~ 100 μl restvolume te overbrengen in de dezelfde polystyreen buis.</li>
	<li>Het toevoegen van CSM naar boven uit de polystyreen buis (~ 3 mL). Graaf en record het nummer van de cel voor de gepoolde barcode ingesteld. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en de bovendrijvende substantie gecombineerd. Ga verder met de monsters barcoded kleuring op dezelfde dag. Opmerking: Het is normaal te verwachten ~ 20-30% cel verlies in het barcoding proces.</li>
</ol>4. vlekken van Barcoded vaste Lysed/bloedcellen en voorbereiding voor analyse op massale Cytometry Instrument
Opmerking: Elke 1 X titer van kleuring van antilichaam (1 μL van antilichaam per 100 μl kleuring reactie), meestal 3-4 x 106 cellen kan vlek. Daarom, wanneer alle barcoded monsters zijn samengevoegd in één buis, de hoeveelheid antilichaam moet worden opgeschaald. Als 20 barcoded monsters bedraagt 30 x 106 cellen, en elk 1 X titer kan 3-4 x 106 cellen vlek, vereist het monster barcoded slechts een 10 X titer, in tegenstelling tot de kleuring van elk monster individueel, die zou vereisen een 20 X hoeveelheid antilichaam (1 X per individuele buis). De concentratie van het antilichaam aan celaantal moet zorgvuldig worden getitreerd voor elke individuele antilichaam cocktail (hier niet besproken).
<ol><li>Vlek de cellen met behulp van antilichamen (Tabel of Materials) voor oppervlakte kleuring en cytokine inductie.<ol>
<li>Maken door de berekening worden toegevoegd en de boekhouding voor pipetting fout met de oppervlakte kleuring cocktail (dat wil zeggen, als de kleuring van 20 barcoded monsters van 2 x 106 cellen in elk monster, een 10 X titer vlek is vereist; voor eindvolume berekeningen, compenseren pipetting fout door het maken van een 10.5 X laatste kleurstofoplossing).</li>
		<li>Voeg toe 10 X waard van oppervlak vlekken van volume dat u wilt de barcoded cel pellet. Ter vermindering van verlies van de cel, met de dezelfde tip, meng en meten van de hoeveelheid oppervlak vlekken en cel pellet.</li>
		<li>Op basis van het volume van cellen en vlekken cocktail, CSM aan een kleuring eindvolume van 50 μl per aantal celsteekproeven (dat wil zeggen, als een set van 20 monsters, 50 μl X 20 = 1 mL) toevoegen. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Het monster iedere 15 minuten doorroeren om zelfs kleuring.</li>
		<li>Tijdens de oppervlakte vlek incubatie, bereiden de Perm/afwas buffer (Tabel van materialen) door verdunning 1:10 met gefilterde ddH2O. voorbereiden hoeveelheden van 2 mL voor permeabilization, en 5 mL voor wassen. Bewaren bij 4 ° C of op ijs.</li>
		<li>Boven uit het oppervlak vlekken van buis met CSM en centrifugeer bij 600 x g bij 4 ° C gedurende 5 min. gecombineerd het supernatant. Resuspendeer de barcoded monster in 2 mL zuiver 4 ° C, 1:10 verdunning Perm/afwas buffer. Incubeer bij 4 ° C gedurende 20-30 minuten om volledig permeabilize van de cellen.</li>
		<li>Centrifugeer bij 600 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten en het supernatant gecombineerd.</li>
		<li>Voor het intracellulaire kleuring, stappen vergelijkbaar kleuring (wat betreft oppervlakte kleuring). Echter gebruiken de 4 ° C, 1:10 verdunning Perm/afwas buffer in plaats van de CSM om het totaal volume kleuring, zodat de cellen in een permeabilizing omgeving gedurende de intracellulaire kleuring blijven.</li>
		<li>Voeg het intracellulaire antilichaam cocktail aan het oppervlak gekleurd en permeabel cel pellet (stappen 4.1.2–4.1.17). Brengen het totaal volume naar 50 μl per aantal celsteekproeven kleuring. Incubeer gedurende 60 min bij 4 ° C. Het monster iedere 15 minuten doorroeren om ervoor te zorgen zelfs kleuring.</li>
		<li>Tijdens de intracellulaire kleuring, bereid de intercalatorethidium oplossing: 900 μL van gefilterde PBS + 100 μl van gefilterde 16% PFA (eindconcentratie van 1,6% PFA) + 0,2 μL van 500 uM van intercalatorethidium kleurstof (Tabel van materialen).</li>
		<li>Top af de cel pellet + intracellulaire antilichaam cocktail met koude 1:10 Perm/afwas buffer.</li>
		<li>Centrifugeer bij 600 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten, en het supernatant gecombineerd. Top af de kleuring buis met CSM. Tellen en noteer het nummer van de cel. Centrifugeer bij 600 x g bij 4 ° C gedurende 5 minuten, en het supernatant gecombineerd. Resuspendeer de cellen in 1 mL van de intercalatorethidium oplossing van stap 4.9. Incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij kamertemperatuur voor volledige bekomt, of overnacht bij 4 ° C (monsters in intercalatorethidium oplossing kunnen verblijf bij 4 ° C voor maximaal 1 week voordat u ze op de massale cytometry instrument).</li>
	</ol>
</li>
	<li>De cellen voor te bereiden voor de massale cytometry instrument.<ol>
<li>Top uit de buis met 3 mL gefilterde ddH2O en centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 min bij 4 ° C. Resuspendeer de cellen in 3 mL gefilterde ddH2O. Pass deze schorsing door een 100 μm filter verwijderen puin of aggregaten die potentieel het massale cytometry instrument kunnen verstoppen.</li>
		<li>Tellen en registreren van de cel nummer na filtratie. Centrifugeer bij 600 x g gedurende 5 min bij 4 ° C</li>
	</ol>
</li>
	<li>De kraal ijkoplossing (Tabel of Materials) voor te bereiden door verdunning het 1:10 in gefilterde ddH2O.</li>
	<li>Resuspendeer de gekleurde cellen in het vereiste volume van 1:10 kraal kalibreervloeistof voor de verwezenlijking van de concentratie van een cel ~ 1 x 106 cellen/mL verdund. Opmerking: Voor een CyTOF1 op 45 µL/min is het aanbevolen optimum 5 x 10,5 cellen/mL; voor Helios op 30 µL/min, 7,5 x 105 cellen/mL.</li>
	<li>Ga verder met het uitvoeren van het monster op de massale cytometry instrument9.</li>
</ol>

<ol><li>Walsh, S. J., Rau, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+diseases%3A+a+leading+cause+of+death+among+young+and+middle-aged+women+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+public+health%22%5BJournal%5D)">Autoimmune diseases: a leading cause of death among young and middle-aged women in the United States.</a> American journal of public health. 90 (9), 1463-1466 (2000).</li>
<li>Mak, A., Cheung, M. W. -L., Chiew, H. J., Liu, Y., Ho, R. C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+trend+of+survival+and+damage+of+systemic+lupus+erythematosus%3A+meta-analysis+and+meta-regression+of+observational+studies+from+the+1950s+to+2000s%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+arthritis+and+rheumatism%22%5BJournal%5D)">Global trend of survival and damage of systemic lupus erythematosus: meta-analysis and meta-regression of observational studies from the 1950s to 2000s.</a> Seminars in arthritis and rheumatism. 41 (6), 830-839 (2012).</li>
<li>Kaul, A., Gordon, C., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27306639">Systemic lupus erythematosus.</a> Nature reviews. Disease primers. 2, 16039(2016).</li>
<li>Annunziato, F., Romagnani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+effector+CD4%2B+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Arthritis+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human effector CD4+ T cells.</a> Arthritis Research & Therapy. 11 (6), 257(2009).</li>
<li>Peck, A., Mellins, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+T-cell+phenotype+and+function%3A+the+T+helper+type+17+example%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Plasticity of T-cell phenotype and function: the T helper type 17 example.</a> Immunology. 129 (2), 147-153 (2010).</li>
<li>Basso, A. S., Cheroutre, H., Mucida, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+stories+on+Th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+research%22%5BJournal%5D)">More stories on Th17 cells.</a> Cell research. 19 (4), 399-411 (2009).</li>
<li>Ornatsky, O., Bandura, D., Baranov, V., Nitz, M., Winnik, M. A., Tanner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiparametric+analysis+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly multiparametric analysis by mass cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 361 (1-2), 1-20 (2010).</li>
<li>Ornatsky, O., Baranov, V. I., Bandura, D. R., Tanner, S. D., Dick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+cellular+antigen+detection+by+ICP-MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiple cellular antigen detection by ICP-MS.</a> Journal of Immunological Methods. 308 (1-2), 68-76 (2006).</li>
<li>Bendall, S. C., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+Mass+Cytometry+of+Differential+Immune+and+Drug+Responses+Across+a+Human+Hematopoietic+Continuum%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum.</a> Science. 332 (6030), 687-696 (2011).</li>
<li>Bandura, D. R., Baranov, V. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+Cytometry%3A+Technique+for+Real+Time+Single+Cell+Multitarget+Immunoassay+Based+on+Inductively+Coupled+Plasma+Time-of-Flight+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mass Cytometry: Technique for Real Time Single Cell Multitarget Immunoassay Based on Inductively Coupled Plasma Time-of-Flight Mass Spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 81 (16), 6813-6822 (2009).</li>
<li>Leipold, M. D., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry%3A+protocol+for+daily+tuning+and+running+cell+samples+on+a+CyTOF+mass+cytometer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (69), e4398(2012).</li>
<li>McCarthy, R. L., Duncan, A. D., Barton, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sample+Preparation+for+Mass+Cytometry+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (122), (2017).</li>
<li>Rahman, A., Isenberg, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Systemic lupus erythematosus.</a> The New England journal of medicine. 358 (9), 929-939 (2008).</li>
<li>O'Gorman, W. E., Hsieh, E. W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+systems-level+analysis+of+human+Toll-like+receptor+activation+defines+a+chemokine+signature+in+patients+with+systemic+lupus+erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+allergy+and+clinical+immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell systems-level analysis of human Toll-like receptor activation defines a chemokine signature in patients with systemic lupus erythematosus.</a> The Journal of allergy and clinical immunology. 136 (5), 1326-1336 (2015).</li>
<li>O'Gorman, W. E., Kong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry+identifies+a+distinct+monocyte+cytokine+signature+shared+by+clinically+heterogeneous+pediatric+SLE+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry identifies a distinct monocyte cytokine signature shared by clinically heterogeneous pediatric SLE patients.</a> Journal of Autoimmunity. 81, 74-89 (2017).</li>
<li>Simonds, E. F., Bendall, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracting+a+cellular+hierarchy+from+high-dimensional+cytometry+data+with+SPADE%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE.</a> Nature Biotechnology. , 1-8 (2011).</li>
<li>Amir, E. -A. D., Davis, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nature Biotechnology. 31 (6), 545-552 (2013).</li>
<li>Bruggner, R. V., Bodenmiller, B., Dill, D. L., Tibshirani, R. J., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+identification+of+stratifying+signatures+in+cellular+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Automated identification of stratifying signatures in cellular subpopulations.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (26), E2770-E2777 (2014).</li>
<li>Levine, J. H., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-Driven+Phenotypic+Dissection+of+AML+Reveals+Progenitor-like+Cells+that+Correlate+with+Prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Data-Driven Phenotypic Dissection of AML Reveals Progenitor-like Cells that Correlate with Prognosis.</a> Cell. 162 (1), 184-197 (2015).</li>
<li>Samusik, N., Good, Z., Spitzer, M. H., Davis, K. L., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+mapping+of+phenotype+space+with+single-cell+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Publishing+Group%22%5BJournal%5D)">Automated mapping of phenotype space with single-cell data.</a> Nature Publishing Group. 13 (6), 493-496 (2016).</li>
<li>Spitzer, M. H., Gherardini, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMMUNOLOGY.+An+interactive+reference+framework+for+modeling+a+dynamic+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IMMUNOLOGY. An interactive reference framework for modeling a dynamic immune system.</a> Science. 349 (6244), 1259425(2015).</li>
<li>Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+platinum-based+covalent+viability+reagent+for+single-cell+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry.</a> Cytometry Part A. 81 (6), 467-475 (2012).</li>
<li>Jansen, K., Blimkie, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polychromatic+flow+cytometric+high-throughput+assay+to+analyze+the+innate+immune+response+to+Toll-like+receptor+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Polychromatic flow cytometric high-throughput assay to analyze the innate immune response to Toll-like receptor stimulation.</a> Journal of Immunological Methods. 336 (2), 183-192 (2008).</li>
<li>Zunder, E. R., Finck, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palladium-based+mass+tag+cell+barcoding+with+a+doublet-filtering+scheme+and+single-cell+deconvolution+algorithm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm.</a> Nature Protocols. 10 (2), 316-333 (2015).</li>
<li>Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD45-based+barcoding+approach+to+multiplex+mass-cytometry+%28CyTOF%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF).</a> Cytometry Part A. , (2015).</li>
<li>Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Barcoding+of+live+human+peripheral+blood+mononuclear+cells+for+multiplexed+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry.</a> The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).</li>
<li>Finck, R., Simonds, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+mass+cytometry+data+with+bead+standards%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Normalization of mass cytometry data with bead standards.</a> Cytometry Part A. 83 (5), 483-494 (2013).</li>
<li>Takahashi, C., Au-Yeung, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+cytometry+panel+optimization+through+the+designed+distribution+of+signal+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A+%3A+the+journal+of+the+International+Society+for+Analytical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference.</a> Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier beschrijven we een roman, eencellige, proteomic aanpak gelijktijdig controleren meerdere soorten van immuun cellen en hun verschillende cytokine verstoringen op te sporen in de omgeving van de patiënt specifieke "pathogene" perifere bloed plasma circulerende factoren. Deze methode maakt gebruik van perifere bloed als het analytische voertuig, en de massale cytometry als instrument voor de evaluatie van immuun cellulaire fenotypische en functionele afwijkingen. De methode is gemakkelijk van toepassing op de mens en m...

Auto-immune ziekten zijn een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit 3-8% van de bevolking. In de Verenigde Staten, auto-immune aandoeningen behoren tot de belangrijkste doodsoorzaken onder jonge en middelbare leeftijd vrouwen (leeftijden < 65 jaar)1,2. Auto-immune aandoeningen worden gekenmerkt door heterogene Vaatwandpathologie en diverse onderliggende immunologische processen. Het spectrum van heterogeniteit is goed vertegenwoordigd in verschillende aandoeningen, zoals gezamenlijke betrokkenheid bij reumatoïde artritis (RA) en neurologische ziekte bij multiple sclerose (MS). Echter, dit niveau van heterogeniteit ook binnen een enkele stoornis, zoals systemische lupus erythematosus (SLE) wordt geïllustreerd: sommige patiënten kunnen presenteren met Renale pathologie, terwijl anderen van hematologic of gezamenlijke betrokkenheid3 last.
De onderliggende immunopathogenese in auto-immune aandoeningen komt overeen met de klinische heterogeniteit, met betrekking tot auto - en hyper-activering van meerdere aangeboren en adaptieve immuun cel subsets, en daarmee gepaard gaande dysregulated cytokine productie. Hoewel cytokines een centrale rol in de pathogenese van auto-immune ziekte spelen, heeft inzicht in hun specifieke rol in het mechanisme van de ziekte bewezen uitdagend. Cytokines worden gekenmerkt door Pleiotropie (een cytokine kan het hebben van meerdere effecten op verschillende soorten cellen), redundantie (meerdere cytokines kan hetzelfde effect hebben), dualiteit (een cytokine kan pro - of anti - inflammatory effecten onder verschillende omstandigheden hebben), en plasticiteit (cytokines kan worden gegoten in een rol die verschillend van de "originele", afhankelijk van de omgeving)4,5,6. Bijgevolg onderscheiden niet populatieniveau methoden heterogene cellulaire reacties op de dezelfde "cytokine milieu". Studie ontwerpen die zich richten op een specifiek aspect van het immuunsysteem (één celtype of cytokine), bieden ook niet een algemene beoordeling van alle elementen die betrokken zijn bij complexe auto-immuunziekte. Terwijl de patiënt sera gebaseerde studies veroorloofd hebben belangrijke inzichten in autoimmuniteit, bieden ze niet de specifieke cellulaire bron van de dysregulated cytokines gedetecteerd.
Onlangs, we een eencellige proteomic benadering om gelijktijdig controleren meerdere immuun celtypes, en sporen van hun verschillende cytokine verstoringen in de omgeving van de patiënt specifieke "pathogene" perifere bloed plasma circulerende factoren ontwikkeld. De hier beschreven werkstroom wordt gekenmerkt door het gebruik van intact perifere bloedmonsters, in tegenstelling tot geïsoleerde perifere bloed mononucleaire cellen (PBMCs). Perifere bloed vertegenwoordigt het meest fysiologisch desbetreffende voertuig te bestuderen van systemische immuun-gemedieerde ziekte, met inbegrip van 1) niet-mononucleaire bloedcellen vaak betrokken in de auto-immune ziekte (d.w.z., neutrofielen, bloedplaatjes), en 2) plasma factoren, zoals nucleïnezuren, immuuncomplexen en cytokines, circuleren die immuun activerend rollen hebben. Te vangen de "intrinsieke pathogene" dysregulated cytokine productie, perifeer bloed monsters worden verwerkt onmiddellijk na de loting van het bloed (T0, tijd nul), en na 6 uur incubatie bij 37 ° C (fysiologische lichaamstemperatuur) met een eiwit transport de Inhibitor van de omwenteling in het ontbreken van een exogene stimulerende aandoening (T6, tijd 6 h), om op te sporen van cytokine productie (accumulatie, T6-T0) dat bij de status van "intrinsieke" ziekte (Figuur 1 aansluiten zou). Om te studeren van dysregulated processen die weerspiegelen over of onder activering van signalering trajecten die betrokken zijn bij de immuunrespons die relevant zijn voor de ziekte, perifeer bloedmonsters zijn behandeld (6 uur incubatie bij 37 ° C met een eiwit vervoer-remmer) een exogene stimuleren van de voorwaarde dat weerspiegelt de pathogenese van de ziekte, zoals Toll-Like-Receptor (TLR) agonisten in het geval van SLE (T6 + R848, tijd 6 h met 1 µg/mL R848), op te sporen van cytokine productie die bij een reactie op nucleic zuren aansluiten zou (T0 vs. T6 vs. T6 vergelijken + R848, Figuur 1). Studeren immunomodulerende effecten van beschikbare therapeutics ex vivo, aangezien ze betrekking op de precieze immuun dysregulated processen voor specifieke patiënten hebben, worden perifeer bloedmonsters behandeld met een JAK-remmer bij de relevante therapeutische concentratie (hier, 5 uM ruxolitinib; T6 + 5R, tijd 6 h met 5 uM ruxolitinib), aan de opsporing van wijzigingen in "intrinsieke" ziekte staat naar aanleiding van de drug (T0 vs. T6 vs. T6 + 5R, Figuur 1). Een JAK-remmer werd gekozen voor deze studie omdat JAK-remmers is gebleken dat succesvol te zijn in de behandeling van auto-immune aandoeningen zoals RA.
Om tegelijkertijd het evalueren van de processen van de dysregulated in meerdere immuun cel subsets perifeer bloedmonsters van SLE hierboven beschreven werden patiënten en gezonde controles verwerkt zoals hierboven beschreven en geanalyseerd door massale cytometry. Massa cytometry, ook bekend als Cytometry-Time-Of-Flight, biedt eencellige analyse van meer dan 40 parameters zonder problemen van spectrale overlap7,8,9. Deze techniek maakt gebruik van zeldzame aarden metalen isotopen in de vorm van oplosbare metaalionen als tags gebonden aan antilichamen, in plaats van fluorophores10. Aanvullende gegevens met betrekking tot de massa cytometry technologische platform (dat wil zeggen, tuning en kalibratie, monster overname) kunnen worden gevonden in Leipold et al. en McCarthy et al. 11 , 12 de hoge-dimensionaliteit van massale cytometry waardoor gelijktijdige meting van meerdere cytokines in aangeboren en adaptieve immuun cel subsets met eencellige granulariteit (Tabel van materialen).
Huidige conventionele klinische en laboratorium parameters zijn vaak niet gevoelige of specifiek genoeg is voor het opsporen van voortdurende ziekte-activiteit of het antwoord op de specifieke immunomodulators13, als gevolg van de noodzaak om het beter af te bakenen de onderliggende immuun wijzigingen die flare-ups rijden. Gezien de alomtegenwoordigheid van cytokine disregulatie in auto-immuunziekte, een overvloed aan behandeling benaderingen die gebruikmaken van antilichamen of kleine moleculaire remmers targeting cytokines of signalering eiwitten die betrokken zijn in de regulatie van cytokine productie hebben onlangs naar voren gekomen. In zijn elementaire vorm biedt de hier beschreven perifeer bloed analytische aanpak een platform om patiënt-specifieke dysregulated cel subsets en hun abnormale cytokine productie in auto-immune ziekten met systemische weerslag te identificeren. Deze methode zorgt voor de personalisatie van therapeutische keuzes, zoals specifieke dysregulated cytokines kunnen worden geïdentificeerd, en specifieke behandeling opties kunnen ex vivo getest te beoordelen van hun vermogen om te immunomodulate de patiënt specifieke ziekte proces.

<table><tbody><tr><td>Ruxolitinib</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-364729A</td><td>Stock Conc: 10 mM; Final Conc: 5 &mu;M</td></tr><tr><td>R848</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-r848-5</td><td>Stock Conc: 1 &mu;g/&/&mu;L; Final Conc: 1 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>LPS-EK</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-eklps</td><td>Stock Conc: 1 &mu;g/&/&mu;L; Final Conc: 0.1 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>Steriel PBS</td><td>Lonza</td><td>17-516F</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix Buffer</td><td>BD biosciences</td><td>558049</td><td>Stock Conc: 5X; Final Conc: 1X (verdunnen in ddH2O)</td></tr><tr><td>BD Phosflow perm/wash buffer I</td><td>BD biosciences</td><td>557885</td><td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1:10 (verdunnen in ddH2O)</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco</td><td>21870-076</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Azide (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-8032</td><td>Stock Conc: >99,9%; Final Conc: 0,0002</td></tr><tr><td>Protein Transport Inhibitor (PTI)</td><td>eBiosciences</td><td>00-4980-93</td><td>Stock Conc: 500X; Final Conc: 1X</td></tr><tr><td>DNA Intercalator</td><td>Fluidigm</td><td>201192B</td><td>Stock Conc: 500 &mu;M; Final Conc: 0,1 &mu;M</td></tr><tr><td>Cell Staining Media (CSM)</td><td></td><td></td><td>PBS + 0,5% BSA, 0,02% NaN3</td></tr><tr><td>MaxPar Barcode Perm Buffer</td><td>Fluidigm</td><td>201057</td><td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td></tr><tr><td>20-plex Pd Barcode Set</td><td>Fluidigm</td><td>S0014</td><td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td></tr><tr><td>EQ TM Four Element Calibration Beads</td><td>Fluidigm</td><td>201078</td><td>Stock Conc: 10X; Final Conc: 1X</td></tr><tr><td>16% MeOH-vrije Formaldehyde-oplossing</td><td>Thermo</td><td>28908</td><td>Stock Conc: 16% (w/v); Final Conc: 1,6% (w/v)</td></tr><tr><td>Steriel ronde bodem polystyreen buizen</td><td>VWR</td><td>60818-496</td><td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td></tr><tr><td>Polypropyleen cluster buizen</td><td>Light Labs</td><td>A-9001</td><td>Stock Conc: n/a; Final Conc: n/a</td></tr><tr><td>Helios CyTOF-instrument</td><td>Fluidigm</td><td>Helios</td><td>Alle oplossingen die worden gebruikt in CyTOF-analyse moeten vrij zijn van metaalverontreiniging. ddH2O wordt gebruikt bij de bereiding van eventuele oplossingen en moet een weerstand van minimaal 18,0 M&Omega;.cm hebben. ddH2O en alle zelfbereide oplossingen moeten worden bewaard in nieuwe plastic of glazen flessen die nooit zijn geautoclaveerd.</td></tr><tr><td>Naam</td><td>Bedrijf</td><td>Catalogusnummer</td><td>Opmerkingen</td></tr><tr><td>Antilichamen gebruikt voor massa cytometrie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oppervlaktemarkers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD1c</td><td>Biolegend</td><td>L161</td><td>Massa: 161</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD</td><td>UCHT1</td><td>Massa: 144</td></tr><tr><td>CD4</td><td>Biolegend</td><td>SK3</td><td>Massa: 174</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD</td><td>M-T701</td><td>Massa: 149</td></tr><tr><td>CD8</td><td>Biolegend</td><td>SK1</td><td>Massa: 142</td></tr><tr><td>CD11b</td><td>Fluidigm</td><td>ICRF44</td><td>Massa: 209</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>BD</td><td>B-ly6</td><td>Massa: 152</td></tr><tr><td>CD15</td><td>BD</td><td>HI98</td><td>Massa: 115</td></tr><tr><td>CD14</td><td>Biolegend</td><td>M5E2</td><td>Massa: 154</td></tr><tr><td>CD16</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>B73.1</td><td>Massa: 165</td></tr><tr><td>CD19</td><td>Santa Cruz</td><td>SJ25C1</td><td>Massa: 163</td></tr><tr><td>CD21</td><td>Biolegend</td><td>Bu32</td><td>Massa: 141</td></tr><tr><td>CD27</td><td>BD</td><td>L128</td><td>Massa: 155</td></tr><tr><td>CD38</td><td>Fluidigm</td><td>HIT2</td><td>Massa: 172</td></tr><tr><td>CD45 totaal</td><td>Biolegend</td><td>HI30</td><td>Massa: 89</td></tr><tr><td>CD45RA</td><td>Biolegend</td><td>HI100</td><td>Massa: 153</td></tr><tr><td>CD56</td><td>Miltenyi</td><td>REA196</td><td>Massa: 168</td></tr><tr><td>CD66</td><td>BD</td><td>B1.1/CD66</td><td>Massa: 113</td></tr><tr><td>CD86</td><td>Fluidigm</td><td>IT2.2</td><td>Massa: 150</td></tr><tr><td>CD123</td><td>Fluidigm</td><td>6H6</td><td>Massa: 143</td></tr><tr><td>CD278/ICOS</td><td>Biolegend</td><td>C398.4A</td><td>Massa: 156</td></tr><tr><td>CD179/PD1</td><td>Biolegend</td><td>EH12.2H7</td><td>Massa: 162</td></tr><tr><td>IgD</td><td>Biolegend</td><td>IA6-2</td><td>Massa: 146</td></tr><tr><td>IgM</td><td>Biolegend</td><td>MHM-88</td><td>Massa: 151</td></tr><tr><td>CXCR5</td><td>BD</td><td>RF8B2</td><td>Massa: 173</td></tr><tr><td>HLADR</td><td>Biolegend</td><td>L243</td><td>Massa: 167</td></tr><tr><td>Cytokines</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-1&alpha;</td><td>Biolegend</td><td>364-3B3-14</td><td>Massa: 147</td></tr><tr><td>IL-1&beta;</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>H1b-98</td><td>Massa: 169</td></tr><tr><td>IL-1RA</td><td>Santa Cruz&nbsp;</td><td>AS17</td><td>Massa: 157</td></tr><tr><td>IL-6</td><td>Biolegend</td><td>MQ2-13A5</td><td>Massa: 164</td></tr><tr><td>IL-8</td><td>BD</td><td>E8N1</td><td>Massa: 160</td></tr><tr><td>IL-12/IL-23p40</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>C8.6</td><td>Massa: 171</td></tr><tr><td>IL-17A</td><td>Biolegend&nbsp;</td><td>BL168</td><td>Massa: 148</td></tr><tr><td>IL23p19</td><td>eBioscience/Thermo</td><td>23dcdp</td><td>Massa: 176</td></tr><tr><td>MIP1&beta;</td><td>BD</td><td>D21-13

eencellige analyse van immunophenotype en cytokine productie in perifere bloed via massale cytometry

Single-cell Analysis of Immunophenotype and Cytokine Production in Peripheral Whole Blood via Mass Cytometry

Cytokines spelen een centrale rol in de pathogenese van auto-immune ziekten. Vandaar, de meting van cytokine niveaus is de focus van meerdere onderzoeken in een poging om de precieze mechanismen die tot de verdeling van self-tolerance en latere autoimmuniteit leiden begrijpen. Benaderingen tot nu toe zijn gebaseerd op de studie van een specifiek aspect van het immuunsysteem (een single of paar celtypes of cytokines), en bieden niet een algemene beoordeling van ingewikkelde auto-immuunziekte. Terwijl de patiënt sera gebaseerde studies veroorloofd hebben belangrijke inzichten in autoimmuniteit, bieden ze niet de specifieke cellulaire bron van de dysregulated cytokines gedetecteerd. Een totaalaanpak van de eencellige te evalueren van cytokine productie in meerdere immuun cel subsets, in het kader van "intrinsieke" plasma van de patiënt-specifieke factoren, circulerende wordt hier beschreven. Deze aanpak maakt controle van de patiënt-specifieke immune fenotype (oppervlakte markeringen) en functie (cytokines), beide in de native "intrinsieke pathogene" ziekte staat, of in de aanwezigheid van therapeutische agenten (in vivo of ex vivo).

Figuur 1 toont de workflow voor de stimulatie en verwerking van de monsters van perifeer bloed, met inbegrip van de toewijzing van bloed monster aliquots, timing van de toevoeging van stimulatie agenten, eiwit transport remmer cocktail en incubatie maal totdat de lysis van de rode bloedcellen (RBC) en fixatie. De keuze van de stimulerende agenten zal afhangen van de signalering en cytokine trajecten die voor beoordeling gericht zijn. Bijvoorbeeld, in het prot...

Hier beschrijven we een eencellige proteomic aanpak om te evalueren van immuun fenotypische en functionele (intracellulaire cytokine inductie) veranderingen in het perifere bloedmonsters geanalyseerd via massale cytometry.

Eencellige analyse van Immunophenotype en Cytokine productie in perifere bloed via massale Cytometry

Cytokines play a pivotal role in the pathogenesis of autoimmune diseases. Hence, the measurement of cytokine levels has been the focus of multiple studies ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van vragen op het gebied van auto-immuniteit, zoals het identificeren van abnormaliteiten in celfrequentie en functieverschille zoals de productie van belangrijke cytokinen in de context van auto-immuunziekten. Het grote voordeel van deze methode is dat het een breed repertoire of verschillende celtypen en functieverschille kan vastleggen uit een gemakkelijk verkrijgbare monster van perifeer bloed. Over het algemeen kunnen personen die nieuw zijn in dit proces moeite hebben met het goed inschatten van de timing van de bloedverwerkingsstappen, de ontwerp van het antilichaampaneel, het barcodeproces zelf en de analyse van hoogdimensionele enkele celgegevens.Deze systeemimmunologie-aanpak is bijzonder geschikt voor auto-immuunziekten zoals SLE waar immuundysregulatie alomtegenwoordig en duidelijk is in perifeer bloed. Visuele demonstratie van deze methode is belangrijk om de timing van stappen te verduidelijken en ook om te laten zien hoe meerdere monsters kunnen worden gebarcodet en gepoold vóór massa-cytometrieanalyse. Om deze procedure te starten, plaats de gelabelde ronde bodempolystyreenbuisjes van vijf verschillende omstandigheden voor hele bloedverwerking op een rek.Voeg vervolgens een milliliter van 37 graden Celsius RPMI toe aan elke buis. Voeg vervolgens een milliliter heel bloed toe aan elke buis en pipet om en om om grondig te mengen met RPMI. Voeg vervolgens 10 microliters voorverdunde ruxolitinib toe aan de buis gelabeld T zes plus vijf R en meng grondig.Plaats de rek met buisjes in de incubator op 37 graden Celsius en begin met het timen van de incubatie. Om de T nul-steekproef te verwerken, pipet de volledige inhoud van de T nul-buis in een gelabelde conische buis met 20 milliliter 37 graden Celsius lys/fix-buffer op werkconcentratie. Om de celherstel te optimaliseren, spoel de buis met lys/fix-buffer en meng door de conische buis om te draaien.Incubeer de cellen op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten om lys en fixatie mogelijk te maken. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 500 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Decanteer daarna de supernatant en suspendeer de cellen opnieuw in één milliliter ijskoud PBS om de pellet te breken.Vul vervolgens de conische buis aan tot een volume van 15 milliliter met PBS. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 500 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Suspendeer de cellen opnieuw in één milliliter CSM om de pellet te breken.Breng vervolgens het monster over naar een gelabelde microcentrifugebuis voor antilichaamkleuring. Tel de cellen met een monster van 10 microliters met een geautomatiseerde celteller. Centrifugeer vervolgens de cellen bij 500 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur.Aspireer daarna het supernatant, waarbij het pellet in ongeveer 60 microliter restant achterlaat. Bewaar dit pellet op ijs tot de monsters van andere omstandigheden de verwerking hebben voltooid. Bij T gelijk aan 30 minuten, verplaats de buisrek naar de weefselcultuurkap.Voeg 10 microliters R848 toe bij 0,1 gram per microliter aan de T zes plus R848 buis en meng grondig. Voeg vervolgens 10 microliters LPS toe bij 0,01 microgram per microliter aan de T zes plus LPS buis en meng grondig. Voeg daarna vier microliters eiwittransportremmer toe aan de buizen gelabeld T zes, T zes plus vijf R en T zes plus LPS en breng de monsters terug naar de incubator tot T gelijk aan zes uur.Meng de monsters grondig met een P1000 pipet elke twee uur. Bij T gelijk aan twee uur, voeg vier microliters eiwittransportremmercocktail toe aan de T zes plus R848 buis. Meng alle monsters en breng de rek terug naar de incubator tot T gelijk aan zes uur.Bij T gelijk aan vier uur, meng de monsters nog een keer met een P1000 pipet. Bij T gelijk aan zes uur, verwerk T zes, T zes plus LPS, T zes plus R848 en T zes plus vijf R bloedsteekproevenbuisjes zoals beschreven voor de T nul-steekproef. Bewaar vervolgens de pellets in restant CSM-volume bij min 80 graden Celsius om later te verwerken.Om de geliste, gefixeerde cellen te barcoden, ontdooi de monsters uit de opslag van min 80 graden Celsius langzaam op ijs. Verdun de 10X barcoden permissiebuffer met PBS met een verhouding van één tot tien en maak genoeg buffer voor drie milliliter per monster. Vul één niet-steriele trog met CSM en één met de een X barcoden permissiebuffer.Voeg vervolgens één milliliter ijskoud CSM toe aan de vers ontdooide monsters, meng grondig en breng over naar de respectieve vooraf gelabelde polypropyleen clusterbuisjes. Neem nu een monster van 10 microliter en tel de cellen met een geautomatiseerde celteller. Normaliseer de celtellingen in elke clusterbuis door het volume van overtollige cellen te verwijderen.Centrifugeer vervolgens de cellen bij 600 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Suspendeer de cellen opnieuw in één milliliter van een X barcoden permissiebuffer met een multikanaals pipet en centrifugeer bij 600 keer G gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Aspireer daarna het supernatant weg.Schik de clusterbuisjes op een rek in dezelfde volgorde als aangegeven op de barcodesleutel, zodat het monster overeenkomt met zijn barcode. Voeg 800 microliters van een X barcoden permissiebuffer toe met een multikanaals pipet aan alle monsters in de clusterbuisjes zonder de celpellet aan te raken om celverlies te verminderen. Zet vervolgens de rek met de clusterbuisjes opzij.Verwijder de 20-plex palladium barcoden kit buisjes uit min 20 graden Celsius en ontdooi ze op kamertemperatuur. Voeg 100 microliters van een X barcoden permissiebuffer toe, meng grondig en breng 120 microliters van de opnieuw gesuspendeerde barcodemix over naar de corresponderende celmonsters in de clusterbuisjes. Meng grondig met een multikanaals pipet zodat er geen kruisbesmetting is tussen afzonderlijk gebarcodete monsters.Incubeer de clusterbuisjes gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur om de barcodes toe te laten staan de cellen te labelen. Na 30 minuten, centrifugeer de monsters bij 600 keer G gedurende vijf minuten bij

single-cell-analysis-immunophenotype-cytokine-production-peripheral

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

In dit rapport tonen we de kleuring en analyse stappen van een fenotypering test uitgevoerd op vers volbloed aan grote aangeboren en adaptieve leukocyten populaties te sommen. Wij benadrukken overwegingen voor het uitvoeren van deze procedures in het kader van een multicenter klinische studie.

Opsomming van belangrijke perifeer bloed leukocyten populaties voor Multicenter klinische proeven met behulp van een volbloed Fenotypering Assay

De stappen die dagelijks tuning en optimalisatie van de prestaties van een CyTOF massa cytometer beschreven. Reacties op optimale monstervoorbereiding en debiet worden...

Massa Cytometry: Protocol voor dagelijks Tuning en Running Cell Samples op een CyTOF Mass Cytometer

This video demonstrates a flow cytometry-based technique using two fluorochromes to identify CD4+ and CD8+ T cells, γδ T cells, B cells, natural killer (NK) cells, and monocytes in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Upon incubating the cells with fluorochrome-conjugated antibodies against the surface markers, the cell subsets are identified using an optimal flow cytometric gating strategy.

A Flow Cytometry Assay to Identify Immune Cell Subsets in Peripheral Blood Mononuclear Cells

This video highlights a single-cell proteomic method that employs heavy-metal-conjugated antibodies for distinct cell barcoding. Subsequently, immunostaining and mass cytometry are applied to evaluate immune phenotypic and functional alterations in human whole blood-derived immune cells.

A Barcoding Assay for Phenotypic and Functional Characterization of Immune Cells

Immunofenotypeer van vol bloed is onmisbaar voor het bewaken van het menselijk immuunsysteem. Echter, het aantal benodigde reagentia en de instabiliteit van specifieke fluorochromen in voorgemengde cocktails vereisen dagelijkse bereiding van reagentia. Hier laten we zien dat semi-geautomatiseerde bereiding van een kleuringsantilichaamcocktail helpt om betrouwbare immunofenotypering te vestigen door de variabiliteit in het doseren van reagentia te minimaliseren.

Een semi-automatische Aanpak Voorbereiding Antibody Cocktails voor Immunophenotypic Analyse van de humane perifere bloed

Dit artikel beschrijft de verzameling en verwerking van monsters voor massa-cytometrie-analyse.

Monstervoorbereiding Mass Cytometry Analysis

Bulk gen expressie metingen wolk individuele cel verschillen in heterogene cel populaties. Hier beschrijven we een protocol voor hoe eencellige gen expressie analyse en index Sorteren door bloeien geactiveerd Cell Sorting (FACS) kan worden gecombineerd om te bakenen heterogeniteit en immunophenotypically karakteriseren moleculair afzonderlijke cel populaties.

Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

Hier presenteren we een protocol voor het karakteriseren van monocyt deelverzamelingen door volbloed stroom cytometry. Het gaat hierbij om overzichten hoe gate de subsets kunt weergeven en beoordelen van hun uitdrukking van oppervlakte markers en geven een voorbeeld van de beoordeling van de uitdrukking van de M1 (inflammatoire) en M2 markers (ontstekingsremmer).

Karakterisatie van menselijke monocyt deelverzamelingen door volbloed Stroom Cytometry analyse

Hier presenteren we een protocol voor het verwerken van vers beenmerg (BM) geïsoleerd van muis of mens voor High-dimensionale massa Cytometry (Cytometry door time-of-Flight, CyTOF) analyse van neutrofiele-Lineage cellen.

Voorbereiding van het hele beenmerg voor massa Cytometry analyse van neutrofiele-Lineage cellen

Dit protocol schetst een uitgebreide massacytometrie (cytometrie door time-of-flight [CyTOF]) analysemethode voor het evalueren van zowel systemische als lokale immuunresponsen bij hepatocellulair carcinoom (HCC). De aanpak is bedoeld om inzicht te geven in het immuunlandschap van HCC en een beter begrip te bieden van de micro-omgeving van de tumor en de bijbehorende immuunmechanismen.

Massacytometrie-analyse van systemische en lokale immuunresponsen bij hepatocellulair carcinoom

Dit protocol beschrijft het verzamelen en conserveren van bloedmonsters van neonatale en pediatrische patiënten en de toepassing van scRNA-seq, proteomics en spectrale flowcytometrie om de populaties van immuuncellen uit deze monsters te karakteriseren.

Infant Immuniteit in kaart brengen met minimale input: Integratieve single-cell en multiomic profiling

Leer een eencellige proteomics-methode voor immunofenotypering en cytokineproductie in perifeer bloed met massale cytometrie. Deze techniek helpt bij het bestuderen van immuundysregulatie bij auto-immuunziekten.

Eencellige analyse van Immunophenotype en Cytokine productie in perifere bloed via massale Cytometry

Meer video's verkennen