Name: Optogenetics identificatie van een neuronale Type met een glazen Optrode in wakker muizen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Leer optogenetische enkele-unit-opnames in wakker muizen met een glazen optrode. Deze techniek identificeert betrouwbaar neuronale typen in vivo en onderzoekt hun functionele rollen in de inferieure colliculus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs werden ondersteund door de Japan-vereniging voor de promotie van wetenschap KAKENHI Grant JP16K11200 en 17H 02223, en de subsidie voor onderzoek van de Kanazawa medische universiteit S2016-8 en C2017-3. Wij danken Yuhichi Kuda voor zijn steun bij het nemen van de foto's.

Alle procedures worden uitgevoerd in overeenstemming met de leidende beginselen van de fysiologische Society van Japan en met goedkeuring van de Animal Care Comité Kanazawa medische universiteit van.
1. bouw van de glazen Optrode houder
Opmerking: Om te bouwen van een glas optrode houder, is de houder van een commerciële elektrode gebruikt (figuur 1A).
<ol><li>Trek voorzichtig uit de stalen buis voor drukregeling van het vat van de houder.</li>
	<li>Door het boren, verbreden het gat van de zijde van de stoel aanpassen in het vat van de houder. Maak het gat 3 mm in diameter en 12 mm in diepte.</li>
	<li>Zet een roestvrij stalen pijp (diameter 3 mm 0,5 mm in dikte en 8 mm lengte; Figuur 1A 2) in het gat.</li>
	<li>Invoegen van een keramische paring mouw voor ⌀2.5 mm ferrules (figuur 1A1) gesplitst in het gat.</li>
	<li>Fix het vat van de elektrode-houder voor een L-vormige felsen met epoxy lijm.</li>
	<li>Maak de gaatjes (3 mm diameter) in het felsen en deze koppelen aan een manipulator met schroeven.</li>
</ol>2. hoofd Post installatie
<ol><li>Een op maat gemaakte hoofd post maakte van een circuit bord spacer voor te bereiden. Maken van de spacer in kolomvorm printplaat in een cuboidal vorm met een kotter frezen en snijd deze in 2 hoofd posten met een zaag (figuur 1B). De onderkant van de hoofd post met een kotter frezen afvlakken.</li>
	<li>De transgene dieren waarin een lichtgevoelige opsin is uitgedrukt in een specifieke neuron-type voor de studie voor te bereiden. In dit werk, wordt de transgene muis (VGAT-ChR2 muizen) waarin de remmende neuronen express channelrhodopsin-2 (ChR2)11 gebruikt.</li>
	<li>Anesthetize het dier met een mengsel van 0,3 mg/kg medetomidine, 4,0 mg/kg van midazolam en 5,0 mg/kg Butorfanol door intraperitoneale toediening. Testen om te bevestigen dat het dier volledig verdoofd is, zijn reacties om staart knijpen.</li>
	<li>Hiermee plaatst u de muisaanwijzer in een stereotaxic frame op een verwarming pad. Schoon het stereotaxic frame en de verwarming pad met 70% alcohol van tevoren. Plaats de tanden in het gat van de balk beet en licht het scherpen van de klem van de neus. Beide zijden van het hoofd met behulp van oor balken vast te stellen. Wanneer het hoofd goed door de oor-bars opgelost is, draai de neus klem. Toepassing een oogheelkundige zalf op de ogen.</li>
	<li>Scheren van de hoofdhuid met een kleine schaar en reinig de hoofdhuid met een wattenstaafje van chloorhexidine gluconaat. Vóór de operatie, steriliseren alle die de chirurgische instrumenten en een hoofd met een autoclaaf (121 ° C, 15 min post).</li>
	<li>De hoofdhuid langs de middellijn knippen met een schaar en het terzijde schuiven. Het maken van de incisie aan de achterkant van het hoofd aan de ogen (ongeveer 20 mm). Het beenvlies verwijderen met een wattenstaafje gedoopt in 70% alcohol en droog de schedel.</li>
	<li>Bevestig de hoofd post aan de manipulator. Plaats de hoofd post plat op de schedel rond de bregma met behulp van de manipulator.</li>
	<li>Meng de monomeer (4 druppels), de katalysator (1 druppel) en het polymeer (1 kleine lepel) van tandheelkundige cement op een kleine schotel die tevoren in de koelkast is gekoeld. Zet de tandheelkundige cement (onder 1 g) op de frontale en pariëtale bot van de schedel te lossen de hoofd post op de schedel.</li>
	<li>Nadat de tandheelkundige cement moeilijk wordt, verwijder de muis uit het stereotaxic frame. Een antibiotische zalf zetten op de blootgestelde huid. Injecteer de medetomidine antagonist (0,3 mg/kg) en de antibiotica (oxytetracycline; 20 mg/kg). Plaats en volgen van de muis op het pad van de warmte in een kooi totdat het ontwaakt, en terug te sturen naar een huisvesting kooi.</li>
	<li>Het huis van het dier in een kooi van individuele huisvesting met een verrijking apparaat. Het wijzigen van de dierlijke papier beddengoed dagelijks om de kooi schoon te houden en te voorkomen infectie. Zorgvuldig controleren of het dier ongemak vertoont. Toepassing lidocaïne op de wond als eventuele pijn wordt vermoed. Beheren meloxicam of carprofen eenmaal elke 24 h gedurende 48 uur nadat beide het hoofd installatie en craniotomy chirurgie post. De lokale lidocaïne kan bovendien worden gegeven als de NSAID niet voldoende is.
</li>
</ol>3. acclimatisering
<ol><li>Twee dagen (minimaal) na het herstel van de narcose, acclimatiseren de dieren aan de hoofd-bevestigde staat in de zaal van de opname. Voer de acclimatisatie sessies voor ten minste 5 dagen.</li>
	<li>Tijdens de acclimatisatie sessies, plaats het dier in de zaal van de opname met de hoofd post bevestigd aan een custom-built klem. Tijdens de sessie, ter beperking van beweging, dekking het lichaam met een op maat gemaakte hars halve buis (Figuur 1 c), gemaakt met behulp van een 3D-printer. Opmerking: Op dag 1 moet de acclimatisatie sessie 5 min lang. Het is vervolgens verhoogd dagelijks tot 10, 20, 40 en 60 min voor dagen 2, 3, 4 en 5, respectievelijk.</li>
	<li>Aan het einde van elke sessie, geeft het dier een beloning van voedsel. Als het dier continu tijdens de acclimatisatie worstelt, stoppen de sessie.</li>
</ol>4. craniotomy
Opmerking: Na de acclimatisatie, een craniotomy is gemaakt over de regio van de hersenen voor opname. De craniotomy wordt uitgevoerd in het stereotaxic frame onder verdoving, met het hoofd na installatie. De procedure na operatie is hetzelfde als het hoofd installatie post.
<ol><li>Schoon voordat de craniotomy, de schedel met een wattenstaafje met chloorhexidine gluconaat en 70% alcohol.</li>
	<li>Zorgvuldig Schraap de schedel over de opname-site met een tandheelkundige boor. Wanneer het bot dun genoeg wordt, snijd het met het topje van de scalpel en verwijderen.</li>
	<li>Zet tandheelkundige cement rond het blootgestelde gebied ter versterking van de schedel.</li>
	<li>Bestrijken het gebied van de blootgestelde hersenen met siliconen lijm nadat de tandheelkundige cement wordt het moeilijk. De procedure na chirurgie is zoals beschreven in stap 2.8.</li>
</ol>5. elektrofysiologische opname
<ol><li>Laat het dier terug te vorderen voor minimaal 1 dag na de craniotomy voordat u de elektrofysiologische opname uitvoert. Plaats het dier in de opname-zaal op dezelfde manier die het werd gedaan tijdens de sessies van de acclimatisering wanneer de opname begint.</li>
	<li>Maken van glas pipetten van borosilicaatglas haarvaten (OD = 1,5 mm, ID = 0,9 mm, 90.0 mm lang) trok op een trekker van de elektrode. Hun tip diameter is 2-3 µm, en hun weerstand is 4 – 6 MΩ wanneer ze worden gevuld met 10 mM PBS. De lengte van de elektrode is 40 – 50 mm. In sommige opnamen, is 2% neurobiotin toegevoegd aan de 10 mM PBS.</li>
	<li>De gevulde glazen pipet hechten aan de houder van de op maat gemaakte optrode.</li>
	<li>De Ag-Cl gecoat zilver draad (0.2 mm diameter) gestoken in de glazen pipet. Sluit de zilver draad aan een pin via een dun gecoate elektrische draad. Sluit de pin aan de headstage van de opname-versterker.</li>
	<li>Sluit de glasvezel patch kabel (kern = 960 µm, bekleding = 1.000 µm, NB = 0,63) met een Zirkonia verlengstuk (OD = 2,5 mm) naar de split paring mouw op de houder van de optrode. Duw de patch-kabel in de mouw tot het puntje van de verlengstuk contact op met de achterkant van de glazen pipet. De patch-kabel levert het licht (golflengte = 465 nm) van LED. Het LED licht wordt gecontroleerd door een één-kanaals LED-driver.</li>
	<li>Verwijder de siliconen lijm over de craniotomy. Put verwarmde zoutoplossing (38 ° C) op het oppervlak van de hersenen regelmatig om te voorkomen dat de hersenen oppervlak drogen tijdens de opnamesessie. Indien nodig, verwijder de dura met scherpe pincet.</li>
	<li>De glazen elektrode invoegen in het hersenweefsel met een manipulator. De elektrode weerstand controleren wanneer deze wordt ingevoegd. Vervang de elektrode wanneer de weerstand lager is dan verwacht omdat het puntje van de elektrode kan worden beschadigd. Zoek op de diepte van belang, en de eenheid spikes isoleren door de diepte in stappen van 2 tot en met 5 µm aan te passen.</li>
	<li>Nadat de eenheid geïsoleerd is, leveren het LED-licht en observeren de reactie op de lichte stimuli.</li>
	<li>Record de neurale activiteiten na de identificatie van de celtypes. De opnames voor 2 – 3 h uitvoeren. Als de opname is gemaakt op opeenvolgende dagen (maximaal 2 dagen), dekking van de craniotomy met siliconen lijm. Wanneer de opname is voltooid, en het dier wordt opgeofferd, ophalen van de post van hoofd en zet het in aceton te wassen en opnieuw gebruiken.</li>
</ol>

<ol><li>Rajasethupathy, P., Ferenczi, E., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeting neural circuits.</a> Cell. 165 (3), 524-534 (2016).</li>
<li>Gore, F., Schwartz, E. C., Salzman, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+neural+activity+in+physiologically+classified+neurons%3A+triumphs+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+of+London.+Series+B%2C+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Manipulating neural activity in physiologically classified neurons: triumphs and challenges.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370 (1677), 20140216(2015).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identified+GABAergic+and+glutamatergic+neurons+in+the+mouse+inferior+colliculus+share+similar+response+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Identified GABAergic and glutamatergic neurons in the mouse inferior colliculus share similar response properties.</a> Journal of Neuroscience. 37 (37), 8952-8964 (2017).</li>
<li>Ono, M., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-lasting+sound-evoked+afterdischarge+in+the+auditory+midbrain%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Long-lasting sound-evoked afterdischarge in the auditory midbrain.</a> Scientific Reports. 6, 20757(2016).</li>
<li>Munoz, W., Tremblay, R., Rudy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-assisted+patching%3A+in+vivo+recording+of+genetically+and+morphologically+identified+neurons+throughout+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-assisted patching: in vivo recording of genetically and morphologically identified neurons throughout the brain.</a> Cell Reports. 9 (6), 2304-2316 (2014).</li>
<li>Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINP%3A+a+new+method+of+tagging+neuronal+populations+for+identification+during+in+vivo+electrophysiological+recording%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording.</a> PLoS One. 4 (7), e6099(2009).</li>
<li>Kuwada, S., Batra, R., Stanford, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monaural+and+binaural+response+properties+of+neurons+in+the+inferior+colliculus+of+the+rabbit%3A+effects+of+sodium+pentobarbital%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Monaural and binaural response properties of neurons in the inferior colliculus of the rabbit: effects of sodium pentobarbital.</a> Journal of Neurophysiology. 61 (2), 269-282 (1989).</li>
<li>Populin, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthetics+change+the+excitation%2Finhibition+balance+that+governs+sensory+processing+in+the+cat+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthetics change the excitation/inhibition balance that governs sensory processing in the cat superior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 25 (25), 5903-5914 (2005).</li>
<li>Duque, D., Malmierca, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus-specific+adaptation+in+the+inferior+colliculus+of+the+mouse%3A+anesthesia+and+spontaneous+activity+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Structure+and+Function%22%5BJournal%5D)">Stimulus-specific adaptation in the inferior colliculus of the mouse: anesthesia and spontaneous activity effects.</a> Brain Structure and Function. 220 (6), 3385-3398 (2015).</li>
<li>Cai, R., Richardson, B. D., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+to+predictable+versus+random+temporally+complex+stimuli+from+single+units+in+auditory+thalamus%3A+impact+of+aging+and+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Responses to predictable versus random temporally complex stimuli from single units in auditory thalamus: impact of aging and anesthesia.</a> Journal of Neuroscience. 36 (41), 10696-10706 (2016).</li>
<li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+type-specific+channelrhodopsin-2+transgenic+mice+for+optogenetic+dissection+of+neural+circuitry+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function.</a> Nature Methods. 8 (9), 745-752 (2011).</li>
<li>Ito, T., Bishop, D. C., Oliver, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+classes+of+GABAergic+neurons+in+the+inferior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Two classes of GABAergic neurons in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 29 (44), 13860-13869 (2009).</li>
<li>Ono, M., Yanagawa, Y., Koyano, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+neurons+in+inferior+colliculus+of+the+GAD67-GFP+knock-in+mouse%3A+electrophysiological+and+morphological+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">GABAergic neurons in inferior colliculus of the GAD67-GFP knock-in mouse: electrophysiological and morphological properties.</a> Neuroscience Research. 51 (4), 475-492 (2005).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neural+activity+using+Thy1-GCaMP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice.</a> Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).</li>
<li>Hirai, Y., Nishino, E., Ohmori, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+recording+of+fluorescence+and+electrical+signals+by+photometric+patch+electrode+in+deep+brain+regions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous recording of fluorescence and electrical signals by photometric patch electrode in deep brain regions in vivo.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (10), 3930-3942 (2015).</li>
<li>LeChasseur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microprobe+for+parallel+optical+and+electrical+recordings+from+single+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A microprobe for parallel optical and electrical recordings from single neurons in vivo.</a> Nature Methods. 8 (4), 319-325 (2011).</li>
<li>Abaya, T. V., Blair, S., Tathireddy, P., Rieth, L., Solzbacher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+glass+optrode+array+for+optical+neural+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">A 3D glass optrode array for optical neural stimulation.</a> Biomedical Optics Express. 3 (12), 3087-3104 (2012).</li>
<li>Bittner, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conjunctive+input+processing+drives+feature+selectivity+in+hippocampal+CA1+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Conjunctive input processing drives feature selectivity in hippocampal CA1 neurons.</a> Nature Neuroscience. 18 (8), 1133-1142 (2015).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Optogenetics is een krachtig hulpmiddel in de neurowetenschappen geworden. Het is gebruikt voor het identificeren van specifieke neuron typen in vivo , evenals het manipuleren van de activiteiten van bepaalde neuronale trajecten. De verduidelijking van de neurale activiteiten van verschillende neuronale bevordert het begrip van het mechanisme van de neurale circuits. We toonden hier, een methode om het licht te leveren aan de site van de opname via een glaselektrode in de IC van wakker VGAT-ChR2 muizen.
<p c...

Het centrale zenuwstelsel bestaat uit verschillende soorten neuronen, die verschillende functies hebben. De werking van deze verschillende soorten neuronen binnen het neurale circuit is een van de belangrijkste bekommernissen in de neurowetenschappen. Echter in veel hersengebieden is het onmogelijk om te onderscheiden van de neuronale soorten in in-vivo -opnamen elektrische activiteiten, want er geen duidelijk verschil in het elektrische spike signaal zelf, met enkele uitzonderingen is. Recente vooruitgang in optogenetics heb een doorbraak1,2. Het gebruik van transgene dieren waarin lichtgevoelige opsin (bijvoorbeeldchannelrhodopsin-2) wordt uitgedrukt in neuronale bepaalde, werd het mogelijk om te onderscheiden van de neuronale typen efficiënt in in vivo opnames3, 4,5,6. Bij deze dieren, de neuronen met lichtgevoelige opsin zijn opgewonden door lichte prikkels te geven tijdens de elektrische opnames, maar andere neuronen zijn niet. De opsin-positieve neuronen, daarom zijn gemakkelijk onderscheiden van andersoortige neuron door hun antwoorden aan het licht.
In optogenetics de experimenten is het van cruciaal belang om het licht op de site van de opname. Als een niet-invasieve methode, is het licht vaak gericht van de hersenen oppervlak. Omdat de sterkte van het licht vermindert als het hersenweefsel doorloopt, is het echter moeilijk te stimuleren de diepe hersengebieden van de hersenen oppervlak. Het is vooral moeilijk voor de stimulatie licht te bereiken de diepe hersengebieden toen de optische transparantie van het oppervlak van de hersenen laag, is zoals vaak het geval met opnames van wakker dieren. Elektrofysiologische experimenten hebben vaak verricht voor narcose dieren omdat de lichaamsbeweging ruis in de opnames veroorzaakt. Zoals is goed gedocumenteerd, is anesthesie echter bekend om te veranderen van de neurale reacties7,8,9,10. Het is dus nodig om wakker dieren te bestuderen van neurale reacties zonder de kunstmatige effecten van de narcose. In tegenstelling tot de experimenten met narcose dieren, worden het elektrofysiologische opnamen uitgevoerd na het herstel van een operatie in de experimenten met dieren wakker. Tijdens het interval tussen de operatie en de opnames, het weefsel afgescheiden vaak ophoopt op de hersenen oppervlak en maakt de optische transparantie van het oppervlak van de hersenen laag.
Hier beschrijven we een methode voor het opnemen van de single-eenheid opnamen vanaf een wakker muis met behulp van een op maat gemaakte glazen optrode. Bij deze methode wordt het licht beschikbaar gesteld via de opname-glaselektrode zodat het is mogelijk om op een betrouwbare manier stimuleren de opgenomen neuron met licht in diepe hersengebieden. Deze op maat gemaakte optrode-systeem bestaat uit toegankelijke en goedkope materialen en is eenvoudig te monteren.

<table><tbody><tr><td>Electrode holder</td><td>Molecular Device</td><td>1-HL-U</td><td>pipettenhouder voor micro-elektrode versterker</td></tr><tr><td>Ceramic split mating sleeve</td><td>Thorlabs</td><td>ADAF1</td><td>f2.5 mm ferrule</td></tr><tr><td>Circuit board spacer</td><td>Teishin Denki</td><td>SPA-320</td><td>f8.0 mm, 20.0 mm lang</td></tr><tr><td>Stereotaxic frame voor muizen</td><td>Narishige</td><td>SR-6M-HT</td><td>Stereotaxische instrumenten voor muizen</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>NA</td><td>Handmatige manipulator</td></tr><tr><td>Superbond</td><td>Sun Medical</td><td>M: 204610557</td><td>Tandheelkundig adhesief harscement</td></tr><tr><td>Form2</td><td>Formlabs</td><td>NA</td><td>3D-printer</td></tr><tr><td>Kwik-Sil</td><td>WPI</td><td>KWIK-SIL</td><td>Silicone-adhesief met lage toxiciteit</td></tr><tr><td>Borosilicaat glazen capillaire</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>OD 1.5 mm, ID 0.9 mm, 90.0 mm lang</td></tr><tr><td>Fiber-optic patchcord</td><td>Doric Lenses</td><td>MFP_960/1000/2200-0.63_1m_FCM-ZF2.5</td><td>Monofiberoptische patchcord, OD, 2.5 mm, kern = 960 mm, omhulsel = 1000 mm, NA = 0.63</td></tr><tr><td>Connectrized LED</td><td>Doric Lenses</td><td>LEDC-1B_FC</td><td>Centrale golflengte = 465 nm, uitgangsvermogen = 45 mW (Kern 960 mm 0.63 NA )</td></tr><tr><td>LED driver</td><td>Doric Lenses</td><td>LEDRV_1CH_1000</td><td>1 ch LED driver, maximale uitgang = 1000 mA</td></tr><tr><td>Electrode puller</td><td>Narishige</td><td>PB-7</td><td>Dubbeltraps glas micropipet puller</td></tr><tr><td>Borosilicaat glazen capillair</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td>Borosilicaat glazen capillair, OD, 1.5mm, ID, 0.9 mm, 90.0 mm lang</td></tr><tr><td>GENTACIN</td><td>MSD CO., Ltd</td><td>185711173</td><td>Antibiotische zalf</td></tr><tr><td>Terramycin&reg;-LA</td><td>Zoetis</td><td>G 333</td><td>Oxytetracycline</td></tr><tr><td>Tg(Slc32a1- COP4*H134R/EYFP)8Gfng/J</td><td>Jackson Labs</td><td>#14548</td><td>VGAT-ChR2 muizen</td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Molecular Devices</td><td>2500-0157</td><td>Micro-elektrode versterker</td></tr></tbody></table>

optogenetics identificatie van een neuronale type met een glazen optrode in wakker muizen

Optogenetics Identification of a Neuronal Type with a Glass Optrode in Awake Mice

Het is een grote zorg in de neurowetenschappen hoe verschillende soorten neuronen werken in neurale circuits. Recente vooruitgang in de optogenetics hebt ingeschakeld op de identificatie van de neuronale type in in vivo elektrofysiologische experimenten in brede hersengebieden. In optogenetics de experimenten is het van cruciaal belang om het licht op de site van de opname. Echter is het vaak moeilijk te leveren van de stimulatie licht aan de diepe hersengebieden van de hersenen oppervlak. Het is vooral moeilijk voor de stimulatie licht te bereiken de diepe hersengebieden toen de optische transparantie van het oppervlak van de hersenen laag, is zoals vaak het geval met opnames van wakker dieren. Hier beschrijven we een methode om vast te leggen van spike reacties op het licht van een wakker muis met behulp van een op maat gemaakte glazen optrode. Bij deze methode wordt het licht beschikbaar gesteld via de opname-glaselektrode zodat het is mogelijk om op een betrouwbare manier stimuleren de opgenomen neuron met licht in de diepe hersengebieden. Deze op maat gemaakte optrode-systeem bestaat uit toegankelijke en goedkope materialen en is eenvoudig te monteren.

In Figuur 2onderzocht wij hebben de effecten van de grootte van de tip en de lengte van de pipetten van glas op de lichte macht op het puntje van de pipetten (figuur 2A-B). De lichte macht werd gemeten door een optische Energiemeter geplaatst 1 mm van het uiteinde. De volledige lengte was ingesteld op 50 ± 2 mm, wanneer de grootte van de tip gevarieerd, terwijl de grootte van de tip was ingesteld op 2,5 µm wannee...

Dit werk introduceert een methode voor het uitvoeren van een optogenetic single-eenheid betrouwbaar opnemen vanaf een wakker muis met behulp van een op maat gemaakte glazen optrode.

Optogenetics identificatie van een neuronale Type met een glazen Optrode in wakker muizen

It is a major concern in neuroscience how different types of neurons work in neural circuits. Recent advances in optogenetics have enabled the ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van de neurowetenschappen, zoals de functies van verschillende typen neuronen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de verschillende typen neuronen in vivo betrouwbaar te identificeren met goedkope en toegankelijke materialen. Ik zal de procedure demonstreren samen met Shinji Muramoto, onze technicus, en Lanlan Ma, onze assistent-professor van ons laboratorium.Om deze procedure te beginnen, trekt u voorzichtig de stalen buis voor drukcontrole uit de loop van de houder. Verdik het gat van de pinzetelzijde in de loop van de houder door te boren. Plaats vervolgens een roestvrij stalen buis in het gat.Plaats vervolgens een keramische split koppelhuls voor een ferrule met een diameter van 2,5 millimeter in het gat. Maak een gat in een L-vormige konijn en bevestig de loop van de elektrodehouder aan het konijn met epoxylijm. Vervolgens bevestigt u het aan een manipulator met schroeven.Bereid een op maat gemaakte hoofdpositie voor door de kolomvormige printplaat spacer in een kubusvormige vorm te maken met een frees, en snijd het in twee hoofdposities met een zaag. Vervolgens maakt u de onderkant van de hoofdpositie plat met een frees. Voor de operatie steriliseert u alle chirurgische instrumenten en een hoofdpositie met een autoclaaf.Reiniging het stereotactische frame en het verwarmingskussen met 70 procent alcohol. Vervolgens verdooft u de muis en plaatst u deze in het stereotactische frame op een verwarmingskussen. In dit experiment wordt een transgene muis gebruikt waarin de remmende neuronen die channelrhodopsin-II tot expressie brengen, tot expressie worden gebracht.Plaats de tanden in het gat van de beetbalk en draai de neusklem lichtjes vast. Vervolgens bevestigt u beide kanten van het hoofd met oorbars. Wanneer het hoofd correct is vastgezet door de oorbars, draait u de neusklem vast.Breng een oftalmisch zalfje aan op de ogen. Trim de haren over het hoofd met kleine schaartjes en reinig de hoofdhuid met een wattenstaafje chloorhexidinegluconaat. Vervolgens snijdt u de hoofdhuid langs de middenlijn en duwt u deze opzij.Verwijder het periost met een wattenstaafje gedrenkt in 70 procent alcohol en laat de schedel drogen. Vervolgens bevestigt u de hoofdpositie aan de manipulator. Positioneert u de hoofdpositie vlak op de schedel rond de bregma met behulp van de manipulator.Meng vier druppels van de monomeer, een druppel katalysator en een kleine lepel polymeer op een klein schoteltje dat is gekoeld in de koelkast. Breng tandcement aan op het frontale en pariëtale bot en bevestig de hoofdpositie aan de schedel. Nadat het tandcement is uitgehard, verwijdert u de muis uit het stereotactische frame.Breng een antibioticumzalf aan op de blootgestelde huid en injecteert u een cocktail van medetomidine-antagonist en antibioticum. Plaats vervolgens de muis op het verwarmingskussen in een kooi totdat het wakker wordt en breng het terug naar een kooicage met verrijkingsmaterialen. Om craniotomie uit te voeren boven het doelbreingebied voor opname, maakt u de schedel schoon met een wattenstaafje gedrenkt in chloorhexidinegluconaat en 70 procent alcohol.Schrap de schedel voorzichtig boven de opnameplaats met een tandborstel. Wanneer het bot dun genoeg is, snijdt u het af met de punt van het scalpel en verwijdert u het. Breng vervolgens tandcement aan rond het blootgestelde gebied om de schedel te versterken.Bedek het blootgestelde hersengebied met siliconenkleefstof nadat het tandcement is uitgehard. Plaats vervolgens het dier op het verwarmingskussen in een kooi totdat het wakker wordt en breng het terug naar een kooicage. Laat het dier minimaal één dag herstellen na craniotomie, voordat u de elektrofysiologische opname uitvoert.Voordat u de elektrofysiologische opname uitvoert, maakt u enkele glazen pipetten uit borosilicaatglas capillairen met behulp van een elektrodetrekker. Vul de pipetten met 10 millimolair PBS. In sommige opnames wordt twee procent neurobiotine toegevoegd aan de 10 millimolair PBS.Plaats vervolgens het dier in de opnamekamer. Bevestig een gevulde glazen pipet aan de op maat gemaakte optrode houder. Plaats een met zilverchloride gecoate draad in de glazen pipet.Verbind vervolgens de pin met de hoofdfase van de opnameversterker. Verbind vervolgens de glasvezel-patchkabel met een zirkoniumferrule aan de split koppelhuls op de optrode houder. Duwt u de patchkabel in de sleeve totdat de punt van de ferrule contact maakt met de achterkant van de glazen pipet.De patchkabel levert het licht van LED, dat wordt bestuurd door een enkele kanaal LED-driver. Verwijder vervolgens de siliconenkleefstof over de craniotomie. Breng periodiek warme zoutoplossing aan op het hersenoppervlak om te voorkomen dat het hersenoppervlak uitdroogt tijdens de opname sessie.Indien nodig verwijdert u de duur met scherpe pincetten. Hier werden de spike reacties opgenomen in de inferieure colliculus van de wakkere VGAT channelrhodopsin-II muizen. In de inferieure colliculus van de VGAT channelrhodopsin-II muizen tonen de GABAerge neuronen specifiek channelrhodopsin-II tot expressie.Bij de wakkere muizen werden zowel de GABAerge als de glutamaterge neuronen opgewonden of onderdrukt respectievelijk wanneer ze lichtstimuli kregen. Wanneer het lichtstimulus wordt afgeleverd via de glazen elektrode, riep het spike reacties op in sommige neuronen. Daarentegen onderdrukten in andere neuronen de lichtstimuli de door geluidsstimuli opgewekte spike reacties.Deze resultaten tonen aan dat een glazen optrode de goed geïsoleerde enkele eenheidsactiviteit kan opnemen en de opgenomen neuronen betrouwbaar kan stimuleren met behulp van licht. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van de neurowetenschappen om te onderzoeken hoe verschillende typen neuronen werken in de neurale socket van verschillende hersengebieden.

optogenetics-identification-neuronal-type-with-glass-optrode-awake

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowetenschap

Dit artikel geeft de registratie van de individuele cellen van fluorescent gelabelde neuronale populaties in het intacte muis netvlies. Door het gebruik van twee-foton excitatie infrarood transgenetically gelabelde cellen waren gericht voor patch-clamp opnamen om hun licht te antwoorden, receptieve veld eigenschappen, en morfologie studie.

Elektrofysiologische karakterisatie van GFP-uitdrukken celpopulaties in de Intact Retina

Source: Kodani, S., et.al. Optogenetic Manipulation of Neural Circuits During Monitoring Sleep/wakefulness States in Mice. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the optogenetic manipulation of neural circuits involved in the sleep-to-wakefulness transition in mice. The procedure involves surgically implanting an optic fiber and electrodes into the brain and muscles to enable light stimulation and electrophysiological recording. By delivering light to activate light-sensitive cation...

Optogenetic Manipulation of Neural Circuits for the Sleep-to-Wakefulness Transition in Mice

This video demonstrates the brain's neural activity recording through an optical window in transgenic mice. The mice express a fluorescent protein that enables the detection of neural activities. A small portion of the skull is carefully removed to install an optical window, and the skull is then covered with black cement to block light before imaging.

Installation of Optical Windows in the Brain of Transgenic Mice to Image Neural Activities

Source: Laboissonniere, et. al. Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells. J. Vis. Exp. (2017). This video demonstrates a fluorescent tracing technique to identify retinal ganglion cell (RGC) subtypes in a transgenic mouse retina. The process involves securing the isolated retina in a recording chamber, maintaining cell viability with oxygenated perfusion, and targeting fluorescently labeled RGCs using a pipette with a tracer. By analyzing dendritic morphology and...

Identification of Mouse Retinal Ganglion Cell Subtypes Through Fluorescent Tracing

We beschrijven een methode voor het karakteriseren van de functionele topografie en synaptische eigenschappen van voorhersenencircuits met behulp van een optogenetische aanpak om neuronale populaties in vitro te fotostimuleren.

Laser-scanning fotostimulatie van optogenetisch gerichte voorhersenencircuits

Optogenetica is een krachtig hulpmiddel geworden voor gebruik in gedragsneurowetenschappelijke experimenten. Dit protocol biedt een stapsgewijze handleiding voor het ontwerp en de installatie van lasersystemen en biedt een volledig protocol voor het uitvoeren van meerdere en gelijktijdige in vivo optogenetische stimulaties die compatibel zijn met de meeste gedragstestparadigma's bij knaagdieren.

In vivo optogenetische Stimulatie van de knaagdieren centrale zenuwstelsel

Hier beschrijven we onze strategie voor het verkrijgen van stabiele, goed geïsoleerde single-unit opnamen van geïdentificeerde remmende interneuronen in de geanesthetiseerde muiscortex. Neuronen die ChR2 tot expressie brengen, worden geïdentificeerd door hun reactie op blauw licht. De methode maakt gebruik van standaard extracellulair opname-apparatuur en dient als een goedkope alternatief voor calcium-beeldvorming of visueel geleid patchen.

Een gids voor In vivo Single-unit Opnemen van Optogenetically Identified Cortical Remmende Interneurons

Hier beschrijven we methoden van optogenetische manipulatie van bepaalde soorten neuronen tijdens het monitoren van de slaap/wakkerheid toestanden in muizen, het presenteren van onze recente werk op de bed kern van de Stria terminalis als voorbeeld.

Optogenetische manipulatie van neurale circuits tijdens het monitoren van slaap/wakkerheid toestanden in muizen

Met optogenetische manipulatie van specifieke neuronale populaties of hersengebieden kan gedrag worden gewijzigd met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie bij vrij bewegende dieren. Door het gebruik van verschillende optogenetische tools in combinatie met chronisch geïmplanteerde optische vezels, kan een verscheidenheid aan neuronale modulaties en gedragstesten worden uitgevoerd.

Optogenetische manipulatie van neuronale activiteit om gedrag te moduleren in vrij bewegende muizen

Hier presenteren we de fabricagemethode van een optrode-systeem met optische vezels voor lichtafgifte en een elektrode-array voor neurale opname. In vivo experimenten met transgene muizen die channelrhodopsine-2 tot expressie brengen, tonen de haalbaarheid van het systeem voor gelijktijdige optogenetische stimulatie en elektrofysiologische registratie.

Optrode Array voor gelijktijdige optogenetische modulatie en elektrische neurale opname

Leer optogenetische enkele-unit-opnames in wakker muizen met een glazen optrode. Deze techniek identificeert betrouwbaar neuronale typen in vivo en onderzoekt hun functionele rollen in de inferieure colliculus.

Optogenetics identificatie van een neuronale Type met een glazen Optrode in wakker muizen

Meer video's verkennen