Optogenetics identificatie van een neuronale Type met een glazen Optrode in wakker muizen

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van de neurowetenschappen, zoals de functies van verschillende typen neuronen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het mogelijk maakt om de verschillende typen neuronen in vivo betrouwbaar te identificeren met goedkope en toegankelijke materialen. Ik zal de procedure demonstreren samen met Shinji Muramoto, onze technicus, en Lanlan Ma, onze assistent-professor van ons laboratorium.

Om deze procedure te beginnen, trekt u voorzichtig de stalen buis voor drukcontrole uit de loop van de houder. Verdik het gat van de pinzetelzijde in de loop van de houder door te boren. Plaats vervolgens een roestvrij stalen buis in het gat.

Plaats vervolgens een keramische split koppelhuls voor een ferrule met een diameter van 2,5 millimeter in het gat. Maak een gat in een L-vormige konijn en bevestig de loop van de elektrodehouder aan het konijn met epoxylijm. Vervolgens bevestigt u het aan een manipulator met schroeven.

Bereid een op maat gemaakte hoofdpositie voor door de kolomvormige printplaat spacer in een kubusvormige vorm te maken met een frees, en snijd het in twee hoofdposities met een zaag. Vervolgens maakt u de onderkant van de hoofdpositie plat met een frees. Voor de operatie steriliseert u alle chirurgische instrumenten en een hoofdpositie met een autoclaaf.

Reiniging het stereotactische frame en het verwarmingskussen met 70 procent alcohol. Vervolgens verdooft u de muis en plaatst u deze in het stereotactische frame op een verwarmingskussen. In dit experiment wordt een transgene muis gebruikt waarin de remmende neuronen die channelrhodopsin-II tot expressie brengen, tot expressie worden gebracht.

Plaats de tanden in het gat van de beetbalk en draai de neusklem lichtjes vast. Vervolgens bevestigt u beide kanten van het hoofd met oorbars. Wanneer het hoofd correct is vastgezet door de oorbars, draait u de neusklem vast.

Breng een oftalmisch zalfje aan op de ogen. Trim de haren over het hoofd met kleine schaartjes en reinig de hoofdhuid met een wattenstaafje chloorhexidinegluconaat. Vervolgens snijdt u de hoofdhuid langs de middenlijn en duwt u deze opzij.

Verwijder het periost met een wattenstaafje gedrenkt in 70 procent alcohol en laat de schedel drogen. Vervolgens bevestigt u de hoofdpositie aan de manipulator. Positioneert u de hoofdpositie vlak op de schedel rond de bregma met behulp van de manipulator.

Meng vier druppels van de monomeer, een druppel katalysator en een kleine lepel polymeer op een klein schoteltje dat is gekoeld in de koelkast. Breng tandcement aan op het frontale en pariëtale bot en bevestig de hoofdpositie aan de schedel. Nadat het tandcement is uitgehard, verwijdert u de muis uit het stereotactische frame.

Breng een antibioticumzalf aan op de blootgestelde huid en injecteert u een cocktail van medetomidine-antagonist en antibioticum. Plaats vervolgens de muis op het verwarmingskussen in een kooi totdat het wakker wordt en breng het terug naar een kooicage met verrijkingsmaterialen. Om craniotomie uit te voeren boven het doelbreingebied voor opname, maakt u de schedel schoon met een wattenstaafje gedrenkt in chloorhexidinegluconaat en 70 procent alcohol.

Schrap de schedel voorzichtig boven de opnameplaats met een tandborstel. Wanneer het bot dun genoeg is, snijdt u het af met de punt van het scalpel en verwijdert u het. Breng vervolgens tandcement aan rond het blootgestelde gebied om de schedel te versterken.

Bedek het blootgestelde hersengebied met siliconenkleefstof nadat het tandcement is uitgehard. Plaats vervolgens het dier op het verwarmingskussen in een kooi totdat het wakker wordt en breng het terug naar een kooicage. Laat het dier minimaal één dag herstellen na craniotomie, voordat u de elektrofysiologische opname uitvoert.

Voordat u de elektrofysiologische opname uitvoert, maakt u enkele glazen pipetten uit borosilicaatglas capillairen met behulp van een elektrodetrekker. Vul de pipetten met 10 millimolair PBS. In sommige opnames wordt twee procent neurobiotine toegevoegd aan de 10 millimolair PBS.

Plaats vervolgens het dier in de opnamekamer. Bevestig een gevulde glazen pipet aan de op maat gemaakte optrode houder. Plaats een met zilverchloride gecoate draad in de glazen pipet.

Verbind vervolgens de pin met de hoofdfase van de opnameversterker. Verbind vervolgens de glasvezel-patchkabel met een zirkoniumferrule aan de split koppelhuls op de optrode houder. Duwt u de patchkabel in de sleeve totdat de punt van de ferrule contact maakt met de achterkant van de glazen pipet.

De patchkabel levert het licht van LED, dat wordt bestuurd door een enkele kanaal LED-driver. Verwijder vervolgens de siliconenkleefstof over de craniotomie. Breng periodiek warme zoutoplossing aan op het hersenoppervlak om te voorkomen dat het hersenoppervlak uitdroogt tijdens de opname sessie.

Indien nodig verwijdert u de duur met scherpe pincetten. Hier werden de spike reacties opgenomen in de inferieure colliculus van de wakkere VGAT channelrhodopsin-II muizen. In de inferieure colliculus van de VGAT channelrhodopsin-II muizen tonen de GABAerge neuronen specifiek channelrhodopsin-II tot expressie.

Bij de wakkere muizen werden zowel de GABAerge als de glutamaterge neuronen opgewonden of onderdrukt respectievelijk wanneer ze lichtstimuli kregen. Wanneer het lichtstimulus wordt afgeleverd via de glazen elektrode, riep het spike reacties op in sommige neuronen. Daarentegen onderdrukten in andere neuronen de lichtstimuli de door geluidsstimuli opgewekte spike reacties.

Deze resultaten tonen aan dat een glazen optrode de goed geïsoleerde enkele eenheidsactiviteit kan opnemen en de opgenomen neuronen betrouwbaar kan stimuleren met behulp van licht. Na de ontwikkeling heeft deze techniek de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van de neurowetenschappen om te onderzoeken hoe verschillende typen neuronen werken in de neurale socket van verschillende hersengebieden.