Name: Inductie en validatie van cellulaire senescentie in primaire menselijke cellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Leer hoe u cellulaire senescentie induceert en valideert in primaire menselijke fibroblasten met behulp van doxorubicine en specifieke markers. Deze reproduceerbare methode vereist geen dure apparatuur en is waardevol voor onderzoek naar veroudering en kanker.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken de leden van de lab Demaria voor vruchtbare discussies, en Thijmen van Vliet voor het delen van gegevens en het protocol betreffende de UV-geïnduceerde senescentie.

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Muñoz-Espín, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nrm3823">Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Correia-Melo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+are+required+for+pro-ageing+features+of+the+senescent+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype.</a> The EMBO Journal. 10, e201592862(2016).</li>
<li>Loaiza, N., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+tumor+promotion%3A+Is+aging+the+key%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+senescent+cells+enhances+adipogenesis+and+metabolic+function+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age.</a> Elife. 4, e12997(2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Senescence+Promotes+Adverse+Effects+of+Chemotherapy+and+Cancer+Relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse.</a> Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Soto-Gamez, A., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+interventions+for+aging%3A+the+case+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence.</a> Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).</li>
<li>Childs, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%3A+an+emerging+target+for+diseases+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+genes+and+pathways+in+primary+human+fibroblast+strains+undergoing+replicative+and+radiation+induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence.</a> Biological Research. 49, 34(2016).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Senescence+Associated+Genes+and+Pathways+in+Primary+Human+Fibroblasts+Detected+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq.</a> PLoS One. 11 (5), e0154531(2016).</li>
<li>Hernandez-Segura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+Transcriptional+Heterogeneity+in+Senescent+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells.</a> Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).</li>
<li>Le, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation-induced+long-term+expression+of+senescence+markers+in+mice+is+independent+of+p53+and+immune+status%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status.</a> Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).</li>
<li>Hall, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPalpha+regulates+CRL4%28Cdt2%29-mediated+degradation+of+p21+in+response+to+UVB-induced+DNA+damage+to+control+the+G1%2FS+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint.</a> Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).</li>
<li>Nitiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+topoisomerase+II+in+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).</li>
<li>Pazolli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+underlies+the+senescence-+associated+secretory+phenotype+of+tumor+stromal+fibroblasts+that+supports+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression.</a> Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).</li>
<li>Venturelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+of+apoptosis+and+senescence+by+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+5-azacytidine+and+5-aza-2%27-deoxycytidine+in+solid+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).</li>
<li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Trypan+Blue+Technique+for+Determination+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability.</a> Transplantation. 2, 685-694 (1964).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+%CE%B2-galactosidase+is+lysosomal+%CE%B2-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase.</a> Aging Cell. 5, 187-195 (2006).</li>
<li>Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase+staining+on+bone+marrow.+The+osteoclast+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall.</a> Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).</li>
<li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Sherr, C. J., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RB+and+p53+pathways+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The RB and p53 pathways in cancer.</a> Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).</li>
<li>Bunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+p53+and+p21+to+sustain+G2+arrest+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage.</a> Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).</li>
<li>Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+beta-galactosidase+staining+a+marker+of+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo.</a> Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).</li>
<li>Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-induced+replicative+senescence+in+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells.</a> Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).</li>
<li>Blazer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose-induced+replicative+senescence%3A+point+of+no+return+and+effect+of+telomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).</li>
<li>Wiley, C. D., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Ancient+Pathways+to+Aging+Cells-Connecting+Metabolism+and+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).</li>
<li>Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+senescence+in+primary+glioblastoma+cells+by+serum+and+TGFbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2156(2017).</li>
<li>Hypoxia Blagosklonny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTOR+and+autophagy%3A+converging+on+senescence+or+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence.</a> Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).</li>
<li>Meuter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+cellular+senescence+are+elevated+in+murine+blastocysts+cultured+in+vitro%3A+molecular+consequences+of+culture+in+atmospheric+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human-like+senescence-associated+secretory+phenotype+is+conserved+in+mouse+cells+dependent+on+physiological+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen.</a> PLoS One. 5 (2), e9188(2010).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+time-series+gene+expression+profiles+of+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence.</a> Aging Cell. 12, 622-634 (2013).</li>
</ol>

De protocollen die hier uitgelegd werden geoptimaliseerd voor menselijke primaire fibroblasten, met name de cellen BJ en WI-38. De protocollen voor Dr. senescentie, ioniserende straling en Doxorubicine, zijn met succes toegepast op andere types van fibroblasten (HCA2 en IMR90) en in andere celtypen (namelijk neonatale melanocyten en keratinocyten of iPSC afkomstige cardiomyocytes) in ons laboratorium. Aanpassingen voor extra celtypes kunnen echter worden geoptimaliseerd door enkele details zoals het aantal geplaatste cel...

In 1961, Hayflick en Moorhead gemeld dat primaire fibroblasten in cultuur hun proliferatieve potentieel na opeenvolgende doorgangen1 verliezen. Dit proces wordt veroorzaakt door de sequentiële verkorting van telomeren na elke celdeling. Als telomeren een kritisch korte tijdsduur bereikt heeft, ze worden herkend door de reactie van DNA-schade (DDR) dat een onomkeerbare arrestatie van proliferatie activeert — ook gedefinieerd als Dr. senescentie. Dr. senescentie is momenteel een van de vele prikkels die bekend zijn voor het opwekken van een staat van permanente celcyclus arrestatie maakt cellen ongevoelig mitogenen zowel apoptotic signalen2,3. Het programma senescentie wordt normaal gesproken gekenmerkt door extra functies waaronder lysosomale hoogactieve, mitochondriale dysfunctie, nucleaire veranderingen, herschikkingen van de chromatine, endoplasmatisch reticulum-stress, DNA-schade en een senescentie-geassocieerde secretoire fenotype (SASP)3,4. Verouderend cellen hebben meerdere functies in het lichaam: ontwikkeling, wond genezing en tumor onderdrukking2. Ze zijn ook bekend te spelen een belangrijke rol in veroudering en, paradoxaal genoeg, tumor progressie5. De negatieve, en deels tegenstrijdige gevolgen van senescentie worden vaak toegeschreven aan de SASP6.
Onlangs, werd aangetoond dat afschaffing van verouderend cellen uit muizen tot verlenging van de levensduur en tot afschaffing van veel van de veroudering functies7,8,9,10,11, leidt 12. op dezelfde manier, meerdere geneesmiddelen zijn ontwikkeld om op te heffen ofwel verouderend cellen (senolytics) of te richten op de SASP13,14. De therapeutische mogelijkheden van anti-veroudert heeft onlangs trok meer aandacht aan het veld.
De studie van de mechanismen die zijn gekoppeld aan cellulaire senescentie en de screenings voor farmacologische interventies zwaar afhankelijk van ex vivo modellen, met name op de menselijke primaire fibroblasten. Hoewel er sommige gemeenschappelijke functies geactiveerd door uiteenlopende senescentie inductoren, is een grote variabiliteit in het fenotype senescentie waargenomen en afhankelijk van verschillende factoren, waaronder cel type, stimulans en punt3,15, 16,17. Het is noodzakelijk te overwegen de heterogeniteit voor studeren en targeting verouderend cellen. Daarom heeft dit protocol tot doel een aantal methoden die worden gebruikt voor het opwekken van senescentie in primaire fibroblasten met behulp van verschillende behandelingen. Zoals het zal worden verklaard, kunnen de methoden gemakkelijk worden aangepast aan andere celtypes.
Afgezien van Dr. senescentie, beschrijven we de vijf andere senescentie-inducerende behandelingen: ioniserende straling en ultraviolette (UV) straling, Doxorubicine, oxidatieve stress, epigenetische veranderingen (namelijk bevordering van Histon acetylation of DNA demethylatie) . Zowel, ioniserende straling en UV-straling veroorzaken directe DNA-beschadiging en, in de juiste dosis, trigger senescentie18,19. Doxorubicine ook senescentie voornamelijk door middel van DNA-schade veroorzaakt door het intercalating in het DNA en verstoren topoisomerase II functie en dus stoppen DNA herstellen mechanismen20. De expressie van genen essentieel voor senescentie wordt normaal bestuurd door Histon acetylation en methylation van DNA. Dientengevolge, histone deacetylase remmers (bijvoorbeeldnatrium butyraat en SAHA) en DNA demethylating (bijvoorbeeld 5-aza) agenten leiden tot senescentie in anders normale cellen21,22.
Tot slot, vier van de meest voorkomende markeringen geassocieerd met verouderend cellen zal worden verklaard: activiteit van de senescentie verbonden-β-galactosidase (SA-β-gal), tarief voor DNA-synthese door EdU opneming assay, overexpressie van de celcyclus regelgevers en cycline-afhankelijk kinase remmers p16 en p21, overexpressie en secretie van leden van de SASP.

<table><tbody><tr><td>DMEM Media - GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (P/S; 10,000 U/ml)</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SC-202581</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>T75 flask</td><td>Sarstedt</td><td>833911002</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Solution</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>PBS tablets</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microcentrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp;15 mL centrifuge tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>13mm round coverslips</td><td>Sarstedt</td><td>83.1840.002</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip</td><td>Merck Chemicals</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Cesium137-source</td><td></td><td></td><td>IBL 637 Cesium-137&gamma;-ray machine</td></tr><tr><td>UV radiation chamber</td><td></td><td></td><td>Opsytec, Dr. G&ouml;bel BS-02</td></tr><tr><td>Doxorubicin dihydrochloride&nbsp;</td><td>BioAustralis Fine Chemicals</td><td>BIA-D1202-1</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>5-aza-2&rsquo;-deoxycytidine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3656</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0061</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Butyrate&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&beta;-D-galactopyranoside)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7240-90-6</td><td></td></tr><tr><td>Citric acid monohydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dibasic phosphate</td><td>Acros organics</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferrocyanide&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferricyanide</td><td>Fisher Scientific</td><td>13746-66-2</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Merck Millipore</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Chloride</td><td>Fisher Chemicals</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>25% glutaraldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>111-30-8,7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>16% formaldehyde (w/v)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-ethynyl-2&rsquo;-deoxyuridine)</td><td>Lumiprobe</td><td>10540</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-Cyanine3 azide (Sulfo-Cy3-Azide)</td><td>Lumiprobe</td><td>D1330</td><td></td></tr><tr><td>Sodium ascorbate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Copper(II) sulfate pentahydrate (Cu(II)SO4.5H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros organics</td><td>215682500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS base</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Multiwell Plate 384, white&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4729749001</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480 sealing foil&nbsp;</td><td>Roche</td><td>4729757001</td><td></td></tr><tr><td>Sensifast Probe Lo-ROX kit&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-84020</td><td></td></tr><tr><td>UPL Probe Library</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Human IL-6 DuoSet ELISA</td><td>R&amp;D</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad TC20</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Counting slides</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0017</td><td></td></tr><tr><td>Dry incubator</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>Heratherm</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamide</td><td>Merck Millipore</td><td>1.10983</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 'M' laboratory film</td><td>Bemis&nbsp;</td><td>#PM992</td><td></td></tr><tr><td>Tweezers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needles</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inductie en validatie van cellulaire senescentie in primaire menselijke cellen

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Cellulaire senescentie is een staat van permanente celcyclus arrestatie geactiveerd in reactie op andere schadelijke stimuli. Activering van cellulaire senescentie is een kenmerk van verschillende pathofysiologische omstandigheden waaronder tumor onderdrukking, weefsel remodeling en veroudering. De inductoren van cellulaire senescentie in vivo worden nog steeds slecht gekenmerkt. Een aantal stimuli kan echter worden gebruikt ter bevordering van cellulaire senescentie ex vivo. Onder hen zijn de meest voorkomende senescentie-inductoren Dr. uitputting, ioniserende en niet-ioniserende straling, genotoxische drugs, oxidatieve stress, demethylating en acetylerend agenten. Hier, zullen we geen gedetailleerde instructies over het gebruik van deze prikkels voor het opwekken van fibroblasten in senescentie. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor verschillende soorten primaire cellen en cellijnen, met inbegrip van kankercellen. Ook beschrijven we de verschillende methoden voor de validatie van senescentie inductie. In het bijzonder richten we ons op het meten van de activiteit van de lysosomale enzym senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal), het tempo van de DNA synthese met behulp van de 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) opneming assay, de niveaus van meningsuiting van de celcyclus remmers p16 en p21, en de expressie en secretie van leden van de Senescence-Associated secretoire fenotype (SASP). Tot slot, wij bieden voorbeeld resultaten en toepassingen van deze protocollen verder te bespreken.

Verrijking van de SA-β-gal kleuring in verouderend fibroblasten
Β-galactosidase (β-gal) is een lysosomale enzym dat wordt uitgedrukt in alle cellen en dat heeft een optimale pH van 4,025,-26. Echter tijdens senescentie, lysosomen in omvang toenemen en, bijgevolg, verouderend cellen accumuleren β-gal. De verhoogde bedragen van dit enzym maken het mogelijk om op te sporen haa...

Hier bespreken we een serie van protocollen voor de inductie en validatie van cellulaire senescentie in gekweekte cellen. Wij richten op verschillende senescentie-inducerende prikkels en de kwantificering van gemeenschappelijke senescentie-geassocieerde markers te beschrijven. Wij bieden technische details met behulp van fibroblasten als een model, maar de protocollen kunnen worden aangepast aan verschillende cellulaire modellen.

Inductie en validatie van cellulaire senescentie in primaire menselijke cellen

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het verouderings- en kankerveld, zoals hoe gemeenschappelijke technieken worden uitgevoerd om cellulaire senescentie te induceren en hoe het senescentie-fenotype wordt geëvalueerd. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het gemakkelijk te volgen is, zeer reproduceerbaar is, geen speciale of dure apparatuur vereist en dat het resulteert in het induceren van senescentie bij minimaal 50% van de cellulaire populatie. Deze procedure zal worden gedemonstreerd door Alejandra Hernandez-Segura, een afgestudeerde student uit ons lab.Om te beginnen, zaai zeven keer 10 tot de vijfde levensvatbare primaire fibroblasten met een lage Population Doubling of PD in een T75-kolf met 10 milliliters D10. Incubeer de cellen in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en 5% zuurstof overnacht. Verdun 11 microliters van de 1.000X doxorubicine stockoplossing in 11 milliliters D10 tot een eindconcentratie van 250 nanomolar.Zuig vervolgens het medium van de cellen af en vervang het met 10 milliliters D10 plus doxorubicine. Incubeer de cellen in een celkweekincubator bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en 5% zuurstof gedurende exact 24 uur. Zuig vervolgens het medium af en gebruik 10 milliliters D10 om de cellen eenmaal voorzichtig te wassen.Incubeer de cellen in 10 milliliters D10 gedurende nog eens zes dagen, waarbij het medium regelmatig wordt vervangen, ongeveer elke drie dagen. Om bèta-galactosidasekleuring uit te voeren, zaai voor elk monster een keer 10 tot de vierde cellen in ten minste één put van een 24-puts plaat die 500 microliters D10 bevat, zodat de cellen spaarzaam zijn. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en 5% zuurstof overnacht.De volgende dag, gebruik 500 microliters PBS om de cellen twee keer te wassen. Voeg vervolgens 500 microliters per put toe van 2% formaldehyde plus 0,2% glutaaraldehyde in PBS en incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende drie tot vijf minuten om ze te fixeren. Gebruik vervolgens 500 microliters PBS om de cellen twee keer te wassen.Vervolgens, na het bereiden van verse kleuroplossing, voeg 500 microliters per put toe en gebruik parafilm om de plaat af te sluiten om verdamping te voorkomen, wat kristallen kan veroorzaken. Incubeer de cellen in het donker bij 37 graden Celsius in een droge incubator zonder kooldioxide gedurende 12 tot 16 uur. Gebruik vervolgens 500 microliters PBS om de cellen twee keer te wassen.Controleer de cellen onder een normale lichtmicroscoop om de resultaten te beoordelen waarbij positieve cellen verschijnen met blauwe paranucleaire kleuring. Om visualisatie en kwantificering van individuele cellen te vergemakkelijken, gebruik DAPI als contrakleuring. Bepaal vervolgens met behulp van een fluorescerende microscoop het percentage positieve cellen versus het totale aantal cellen door meerdere foto's van hetzelfde monster te maken om ten minste 100 enkele cellen te evalueren.Plaats voor elk monster of voorwaarde één dekglas per put in een 24-puts plaat. Zaai een keer 10 tot de vierde cellen met 500 microliters D10 per put zodat de cellen spaarzaam zijn. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en 5% zuurstof overnacht.Bereid voldoende 20 micromolar EdU-oplossing en D10 voor zodat elk monster 250 microliters ontvangt. Verwijder de helft van het medium uit elke put die wordt behandeld en vervang het met EdU D10-oplossing. De uiteindelijke EdU-concentratie is 10 micromolar.Incubeer de monsters bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide en 5% zuurstof gedurende 18 tot 24 uur. Gebruik dezelfde incubatietijd voor controle- en senescente cellen. Na de incubatie, gebruik 500 microliters PBS om de cellen twee keer te wassen.Voeg vervolgens 500 microliters van 4% formaldehyde in PBS toe en incubeer de cellen gedurende 10 minuten om ze te fixeren. Na fixatie, voeg 500 microliters van 100 millimolar Tris pH 7,6 toe aan de monsters en incubeer ze gedurende vijf minuten. Voeg vervolgens 500 microliters van 0,1% Triton X-100 in PBS toe aan de cellen en permeabiliseer ze gedurende 10 minuten.Gebruik vervolgens PBS om de monsters drie keer te wassen. Bereid 50 microliters labelmix voor elke dekglas, waarbij de componenten in de volgende volgorde worden toegevoegd: 44,45 microliters PBS, 0,5 microliters koper(II)sulfaat, 0,05 microliters sulfo-cy3-azide en vijf microliters natriumascorbinezuur. Pipetteer 50 microliters van de labelmix op een stukje parafilm.Gebruik vervolgens een pincet en een naald om het dekglas op te tillen en het celzijde naar beneden op het labelmix te laten rusten. Zorg ervoor dat er geen bubbels zijn en dat het hele oppervlak van het dekglas in contact komt met het labelmix. Incubeer het monster gedurende 30 minuten in het donker.Plaats de cellen terug in de putten van de 24-puts plaat en was ze drie keer met PBS. Gebruik vervolgens montagemedium met DAPI om de monsters te monteren en laat ze een nacht drogen. Om te beginnen, zaai zeven keer 10 tot de vijfde levensvatbare primaire fibroblasten met een lage Population Doubling of.Neem ten minste 100 cellen per voorwaarde op. Kwantificeer ten slotte het percentage cellen dat EdU heeft opgenomen met behulp van de volgende formule. Voer gen- en eiwitexpressiestudies uit volgens het tekstprotocol.Hier worden representatieve beelden van SA-bèta-gal-kleuring in proliferatieve versus senescente primaire fibroblasten getoond. Senescente cellen zien er vergroot uit binnen een normale cellichaam. Zoals eerder vermeld, kan het moeilijk zijn om individuele cellen te onderscheiden.Daarom vergemakkelijkt co-kleuring met DAPI visualisatie en celtelling. In dit experiment we

induction-and-validation-of-cellular-senescence-in-primary-human-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Of veroudering voorkomt of bevordert het ontstaan ​​van tumoren blijft controversieel. Sinds chemotherapeutische drugs kankercellen ertoe kunnen bewegen senesce, studeren veroudering is essentieel voor het voorstellen van nieuwe therapieën. De standaard en breed gebruikt β-galactosidase test geeft belangrijke nadelen. We stellen hier een snelle en gevoelige flowcytometrie gebaseerde bepaling senescentie kwantificeren.

Een gevoelige methode om Senescent kankercellen kwantificeren

Cellular veroudering, de onomkeerbare toestand van de celcyclus, kan worden geïnduceerd door verschillende cellulaire stress. Hier beschrijven we protocollen bij cellulaire veroudering en methoden ertoe te brengen markers van veroudering te beoordelen.

Technieken voor het induceren en te kwantificeren Cellulaire senescentie

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol bij het detecteren van zowel verouderend en pluripotente stamcellen in de skeletspieren op letsel tijdens het inducerende in vivo herprogrammering. Deze methode is geschikt voor de evaluatie van de rol van cellulaire senescentie tijdens Weefselregeneratie en herprogrammering in vivo.

Evaluatie van schade-geïnduceerde senescentie en In Vivo herprogrammering in de skeletspieren

Intracellulaire ROS heeft aangetoond dat een belangrijke rol spelen in de inductie van cellulaire senescentie. Hier beschrijven we een gevoelige assay voor het kwantificeren van ROS niveaus tijdens cellulaire senescentie. We bieden ook protocollen voor de beoordeling van het senescentie-geassocieerde secretoire fenotype, die naar verluidt aan verschillende leeftijdsgebonden disfuncties bijdraagt.

Een kwantitatieve meting van reactieve zuurstof soorten en senescentie-geassocieerde secretoire fenotype in normale menselijke fibroblasten tijdens oncogen-geïnduceerde senescentie

Cellulaire senescentie is de belangrijkste factor in de ontwikkeling van chronische leeftijdsgebonden pathologieën. Identificatie van therapeutische middelen die gericht zijn op senescentie cellen tonen belofte voor het verlengen van gezonde veroudering. Hier presenteren we een nieuwe assay voor de identificatie van senotherapeutica op basis van meting van senescentie geassocieerde β-galactosidase activiteit in enkelvoudige cellen.

Op SA-β-galactosidase gebaseerde screeningstest voor de identificatie van Senotherapeutische geneesmiddelen

Multiplexed immunofluorescentie maakt sequentiële labeling van meerdere antilichaammarkers binnen één weefselsectie mogelijk om ruimtelijke analyse van weefselarchitectuur en celpopulaties te ondersteunen. Hier wordt een workflow gepresenteerd voor multiplexdetectie van senescentie-geassocieerde, structurele en immuunmarkers, inclusief handmatige en geautomatiseerde preparat, iteratieve beeldvorming en single-cell analyse met behulp van digitale pathologiesoftware.

Multiplexed Immunofluorescentietest voor ruimtelijke beoordeling van senescence-markers in vivo

Dit protocol biedt gereflecteerd licht confocale microscopie voor objectieve, enkelceldetectie van senescence-geassocieerde bèta-galactosidase (SA-β-gal) activiteit in de stromale vasculaire fractie die is geïsoleerd uit menselijk vetweefsel. De methode is compatibel met immunocytochemie, bevat pH-controles voor kwantitatieve beoordeling en biedt bovendien een gevoeliger en minder subjectief alternatief voor conventionele SA-β-gal kleuring.

Senescentiedetectie met behulp van gereflecteerd licht in de vetachtige stromale vaatfractie

Een gestandaardiseerd protocol voor het induceren van voortijdige veroudering in HNM met behulp van tBHP, gestandaardiseerde protocollen voor het analyseren van belangrijke senescentiemarkers, waaronder groeistop, SA-β-galactosidase-activiteit en SASP-factoren.

Een gestandaardiseerd protocol voor het induceren van door stress veroorzaakte voortijdige veroudering in primaire menselijke melanocyten met behulp van tert-butylhydroperoxide

Dit artikel presenteert een levende-cel LysoTracker-protocol om lysosomale hervorming tijdens senescentie in IMR-90 menselijke fibroblasten te meten.

Lysosomale profilering met LysoTracker voor kwantitatieve beoordeling van cellulaire senescentie bij menselijke fibroblasten

Deze methode bestudeert hoe senescente huidfibroblasten gezonde fibroblasten beïnvloeden. Senescentie wordt geïnduceerd door UVB-blootstelling, en het geconditioneerde medium wordt toegepast op normale fibroblasten. Het helpt bij het evalueren van bioactieve verbindingen die gericht zijn op veranderde cel-tot-cel communicatie bij huidveroudering.

Nieuwe combinatie van antioxidanten om gezonde intercellulaire communicatie te herstellen in een in vitro model met behulp van een geconditioneerd medium uit senescente cellen

Leer hoe u cellulaire senescentie induceert en valideert in primaire menselijke fibroblasten met behulp van doxorubicine en specifieke markers. Deze reproduceerbare methode vereist geen dure apparatuur en is waardevol voor onderzoek naar veroudering en kanker.

Inductie en validatie van cellulaire senescentie in primaire menselijke cellen

Meer video's verkennen