Name: Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Leer een vereenvoudigde methode om primaire humane keratinocyten te isoleren uit volwassen huidweefsel met behulp van ROCK-inhibitor Y-27632. Dit efficiënte protocol levert hoge opbrengsten aan levensvatbare cellen voor celbiologisch en dermatologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit werk werd gesteund door de nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China (2017YFA0104604), het algemene programma van nationale Natural Science Foundation van China (NSFC, 81772093), de wetenschap en de technologie ontwikkeling programma van Suzhou (ZXL2015128), de Natural Science Foundation van de oostelijke provincie Jiangsu (BK20161241), en een Shandong Taishan Scholar Award (tshw201502065).

Menselijke weefsels gebruikt in dit protocol hebben behandeld volgens de richtlijnen van de instelling menselijke onderzoek ethische Commissie (NO.2015120401, datum: 12 mei 2015).
1. voorbereiding
<ol><li>Verzamel verse volwassen buikhuid weefsels verwijderd van plastische chirurgie in het ziekenhuis in een tube van 50 mL met 10 mL ijskoud Dulbecco gewijzigd van Eagle medium (DMEM). Het model kan worden bewaard bij 4 ° C voor maximaal 72 uur zonder aanzienlijke invloed zijn op de levensvatbaarheid van de cellen.</li>
	<li>De reagentia en voedingsbodem voorbereiden zoals hieronder beschreven.<ol>
<li>Voeg 1 mL penicilline (100 U/mL) en streptomycine (100 mg/L) aan 50 mL fosfaatgebufferde oplossing (PBS) ter voorbereiding van de Supermarket-oplossing.</li>
		<li>Twee sets van enzym spijsvertering oplossingen voor te bereiden: (1) bereiden 50 mL dispase (2,5 mg/mL in DMEM) en 50 mL typ ik collagenase (2,5 mg/mL in DMEM) apart voor de conventionele methode; en (2) bereiden 50 mL van een mengsel van dispase en typ ik collagenase (Los 125 mg dispase poeder en 125 mg type ik collagenase poeder in 50 mL DMEM) voor de nieuwe methode. Opmerking: Alle enzym oplossingen moeten worden gefilterd met een zeef 0.22-µm en gehouden at4 ° C.</li>
		<li>Bereiden van spijsvertering oplossingen voor beide methoden: trypsine van 0,05% en 0,25% trypsine commercieel werden aangekocht. Bereiden van een 10 mg/mL DNase ik oplossing door ontbinding van 50 mg DNase ik poeder in 5 mL PBS, filteren met een zeef 0.22-µm, en opgeslagen bij-20 ° C.</li>
		<li>Bereiden van 500 mL medium te neutraliseren de enzymatische spijsvertering: DMEM medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine.</li>
		<li>Bereiden van 500 mL van inoculatie medium (groei-factor-bevattende medium, genaamd G-medium): DMEM/F12 (3:1) medium dat 1% penicilline/streptomycine, 40 µg/mL fungizone, 40 ng/mL fibroblast groeifactor 2 (FGF2), 20 ng/mL epidermale groeifactor (EGF), en 2% B27 supplement.</li>
		<li>Voorbehandeling van 100 mm celkweek gerechten met 2 mL van coating matrix met type I collageen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. de conventionele methode
<ol><li>
Huid weefsel voorbehandeling
	<ol>
<li>Neem 1.5 cm,2 van huidweefsel en wassen het 1 x met 10 mL PBS; Spoel het daarna met 10 mL 70% ethanol voor 30 s en Incubeer het 2 x met 10 mL oplossing (PBS met 2% penicilline en streptomycine), 5 minuten elk te wassen. Opmerking: Alle wast zijn uitgevoerd in 100-mm cel cultuur gerechten binnen een laminaire flow-kap.</li>
		<li>Trim het weefsel met een steriele schaar verwijderen van de subcutane vetlaag in een schaal van 100-mm cel cultuur en, vervolgens, weeg het huidweefsel (het gewicht is 1 g in dit protocol). Opmerking: Voldoende trimmen is zeer cruciaal voor de efficiënte scheiding van de epidermis van de dermis. De gelige vetlaag kan visueel gemakkelijk worden onderscheiden.</li>
		<li>Het weefsel overbrengen in een andere 100-mm steriele schotel met de dermis zijde naar beneden, en snijd vervolgens het huidweefsel in 3 - tot 4-mm brede stroken met behulp van een scalpel blad. Opmerking: De dermis kant met de vetlaag is visueel gemakkelijk herkend.</li>
		<li>Voeg 10 mL van 2,5 mg/mL dispase oplossing naar de huid weefsels in een schaal van 100-mm cultuur en, vervolgens, Incubeer de schotel 's nachts bij 4 ° C (niet meer dan 20 h). Nota: Het bedrag van de dispase oplossing kan worden berekend met behulp van 10 mL dispase oplossing voor de vertering van elke gram weefsel.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Scheiding van de epidermis van de huidweefsel
	<ol>
<li>Op de tweede dag, afschilferen de opperhuid van de dermis, met behulp van fijne pincet. Opmerking: Als het is moeilijk om het afschilferen van de epidermis, de dispase spijsvertering was niet voldoende, die is meestal te wijten aan onvoldoende trimmen van het weefsel. Het weefsel moet in dit geval een langere incubatietijd.</li>
		<li>Mince de gepelde epidermis met 500 µL cultuurmedium van de cellen in een weefsel drijfmest met scalpel messen; vervolgens het resuspendeer met 10 mL van 0,25% trypsine in een tube van 50 mL en Incubeer het 20 min in een waterbad bij 37 ° C, met schudden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verzamelen en kweken van primaire cellen
	<ol>
<li>Neutraliseer de trypsine-activiteit door een gelijk volume neutralisatie oplossing (10 mL in dit protocol) toe te voegen.</li>
		<li>Distantiëren van de epidermale cellen door de oplossing op en neer 20 x pipetteren met een serologische pipet 10 mL en laat de oplossing van de cel door een 100-µm cel zeef te verwijderen van alle resterende weefsel puin.</li>
		<li>Centrifugeer het cell-oplossing bij 200 x g gedurende 5 min na filtratie; resuspendeer de pellet cel in neutralisatie medium voor wassen en Centrifugeer het vervolgens weer bij 200 x g te verkrijgen van de cel-pellet.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet cel in 10 mL van lage-calcium, serumvrij Keratinocyt medium (SFM). Neem 10 µL van deze oplossing naar de cel Totaal aantal tellen en, vervolgens, ongeveer 2 x 106 cellen plaat met 10 mL SFM tot 100 mm cel cultuur gerechten voorbehandeld met coating matrix (bevattende type I collageen). Opmerking: Coating is een noodzakelijke stap voor de conventionele methode.</li>
		<li>Wijzig het kweekmedium elke 2 d. Opmerking: Controleer de cel adhesie onder een Microscoop vóór en na het wijzigen van het kweekmedium.</li>
		<li>Passage van de cellen wanneer ze ongeveer 80 bereiken % samenvloeiing. Opmerking: Alle cultuur gerechten zijn voorbehandeld met de coating-matrix.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. de nieuwe methode
<ol><li>
Huid weefsel voorbehandeling
	<ol>
<li>Het verzamelen van het weefsel zoals beschreven hierboven (stap 2.1) voor de conventionele methode.</li>
		<li>Wassen van de huidweefsel 1 x met 10 mL PBS en weeg het vervolgens in een steriele plastic container door een elektronische schaal (het gewicht is ongeveer 1 g in dit protocol). Opmerking: Het minimum gewicht van weefsel die nodig zijn voor dit protocol is 0.1 g, omdat het moeilijk te verkrijgen van een voldoende aantal cellen als het weefsel model gebruikt te klein is. Er is geen maximumgewicht van weefsel voor dit protocol, die uiteindelijk afhankelijk van de capaciteit van de behandeling van de exploitant.</li>
		<li>Pincet gebruiken om te spoelen het huidweefsel met 70% ethanol voor 30 10 mL s.</li>
		<li>Incubeer het weefsel 2 x met 10 mL van oplossing (bereid in stap 2.1.1), gedurende 5 minuten wassen elke keer. Opmerking: Alle wassen stappen hierboven zijn uitgevoerd in 100-mm cel cultuur gerechten binnen in een laminar flow hood (een weefselkweek kap).</li>
		<li>Het weefsel overbrengen in een andere 100-mm cel cultuur steriele schotel.</li>
		<li>Met scalpel messen, blad voor het weefsel grondig in een weefsel drijfmest.</li>
		<li>Voeg 200 µL van PBS elke 5 min om te houden van de natte weefsels. Opmerking: Duren ongeveer 15 min. voor stappen 3.1.5 - 3.1.7. Alle bovenstaande stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vertering van huidweefsel
	<ol>
<li>Breng de oplossing van de gehomogeniseerde weefsel in een 50 mL-buis. Voeg 10 mL van enzym mengsel voor elke 1 g van huidweefsel. Meng de enzymen met het gehomogeniseerde weefsels.</li>
		<li>Incubeer het mengsel met schudden in een waterbad bij 37 ° C gedurende 1 uur.</li>
		<li>Voeg een 1/5-volume van 0,25% trypsine (2,5 mL in dit protocol) aan de spijsvertering-mengsel voor een ander 30 minuten in een waterbad bij 37 ° C.</li>
		<li>Toevoegen van DNase ik oplossing aan het enzym mengsel bij een verhouding van 1:100 (v/v) (250 µL in dit protocol) en laat het 5 minuten bij kamertemperatuur inwerken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verzamelen en kweken van primaire cellen
	<ol>
<li>Stop het spijsverteringsproces door toevoeging van 12,5 mL van neutralisatie medium in een 1:1 verhouding. Pipetteer op en neer de oplossing voor ongeveer 20 x, met behulp van serologische Pipetteer 10 mL te distantiëren van de cellen.</li>
		<li>Filtreer de gedissocieerde cellen door een 100-µm cel zeef te verwijderen van het puin van het weefsel. Centrifugeer het supernatant bij 200 x g gedurende 5 min. Let op de pellet aan de onderkant van de buis.</li>
		<li>Verwijder het supernatant en wassen van de cel pellet met 10 mL van neutralisatie medium, en centrifuge weer bij 200 x g gedurende 5 min voor het verzamelen van de cellen.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet cel in 10 mL van inoculatie medium (G-medium uit stap 1.2.5) met 10 µM van Y-27632.</li>
		<li>Neem 10 µL van de oplossing voor de cel Totaal aantal tellen en, vervolgens, ongeveer 2 x 106 cellen plaat met 10 mL voor G-medium in een schotel van 100 mm cel cultuur. Opmerking: De precoating stap is niet nodig voor de nieuwe methode, en geen verwijdering van de dermale laag is niet vereist.</li>
		<li>Na de 3 d, vervangt u het medium inoculatie met lage-calcium SFM medium. Wijzig het kweekmedium elke 2 d. Opmerking: Controleer de cel adhesie vóór en na het wijzigen van het medium.</li>
		<li>Passage van de cellen wanneer ze ongeveer 80 bereiken % samenvloeiing. Opmerking: Indien nodig, voorbehandeling van de cellen met 0,05% trypsine gedurende 2 minuten en wassen van de cellen met PBS te verwijderen dermale cellen besmetten voordat de trypsinizing van de epidermale cellen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. de cel Passaging
<ol><li>Verwijder het medium, wassen van de cellen met PBS en, dan, voeg 2 mL 0,05% trypsine (per elke 100 mm schotel).</li>
	<li>Incubeer de cellen in een incubator (37 ° C met 5% CO2) gedurende 5 minuten.</li>
	<li>Controleer de cellen met behulp van een microscoop om ervoor te zorgen dat alle cellen hebben losgemaakt van de cultuur-schotel.</li>
	<li>Voeg 8 mL DMEM met 10% FBS te neutraliseren van de enzymatische reactie, vervolgens verzamelen de cellen in een buis 15 mL.</li>
	<li>Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min te verkrijgen van de cel-pellet.</li>
	<li>Verwijder de bovendrijvende vloeistof langzaam en vervolgens resuspendeer de pellet cel met 10 mL van SFM medium en het aantal cellen tellen.</li>
	<li>1 x 10 bord6 cellen met 10 mL SFM in elke cel van de 100-mm schotel.</li>
	<li>Het medium elke 2 d te wijzigen.</li>
</ol>

<ol><li>Ojeh, N., Pastar, I., Tomic-Canic, M., Stojadinovic, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cells+in+Skin+Regeneration%2C+Wound+Healing%2C+and+Their+Clinical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stem Cells in Skin Regeneration, Wound Healing, and Their Clinical Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (10), 25476-25501 (2015).</li>
<li>Sotiropoulou, P. A., Blanpain, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+homeostasis+of+the+skin+epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+BIology%22%5BJournal%5D)">Development and homeostasis of the skin epidermis.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in BIology. 4 (7), a008383(2012).</li>
<li>Kamstrup, M., Faurschou, A., Gniadecki, R., Wulf, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells+-+role+in+normal%2C+wounded+and+pathological+psoriatic+and+cancer+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells - role in normal, wounded and pathological psoriatic and cancer skin.</a> Current Stem Cell Research & Therapy. 3 (2), 146-150 (2008).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+stem+cells+of+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epidermal stem cells of the skin.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 22 (22), 339-373 (2006).</li>
<li>Guo, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Building+a+microphysiological+skin+model+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Building a microphysiological skin model from induced pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Research & Therapy. 4 (S1), S2(2013).</li>
<li>Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+human+keratinocytes+from+skin+or+plucked+hair+for+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).</li>
<li>Bayati, V., Abbaspour, M. R., Neisi, N., Hashemitabar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin-derived+precursors+possess+the+ability+of+differentiation+into+the+epidermal+progeny+and+accelerate+burn+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Skin-derived precursors possess the ability of differentiation into the epidermal progeny and accelerate burn wound healing.</a> Cell Biology International. 41 (2), 187-196 (2017).</li>
<li>Hirsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+the+entire+human+epidermis+using+transgenic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regeneration of the entire human epidermis using transgenic stem cells.</a> Nature. 551 (7680), 327-332 (2017).</li>
<li>Hentzer, B., Kobayasi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+human+epidermal+cells+from+fibroblasts+in+primary+skin+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Archiv+f%C3%BCr+dermatologische+Forschung%22%5BJournal%5D)">Separation of human epidermal cells from fibroblasts in primary skin culture.</a> Archiv für dermatologische Forschung. 252 (1), 39-46 (1975).</li>
<li>Terunuma, A., Limgala, R. P., Park, C. J., Choudhary, I., Vogel, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+procurement+of+epithelial+stem+cells+from+human+tissue+specimens+using+a+Rho-associated+protein+kinase+inhibitor+Y-27632%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Efficient procurement of epithelial stem cells from human tissue specimens using a Rho-associated protein kinase inhibitor Y-27632.</a> Tissue Engineering Part A. 16 (4), 1363-1368 (2010).</li>
<li>Zhou, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibitor+Y-27632+increases+the+cloning+efficiency+of+limbal+stem%2Fprogenitor+cells+by+improving+their+adherence+and+ROS-scavenging+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+C%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibitor Y-27632 increases the cloning efficiency of limbal stem/progenitor cells by improving their adherence and ROS-scavenging capacity.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (7), 531-537 (2013).</li>
<li>Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Rho-associated+protein+kinase+%28ROCK%29+inhibitor+to+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bioscience+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Application of Rho-associated protein kinase (ROCK) inhibitor to human pluripotent stem cells.</a> Journal of Bioscience and Bioengineering. 114 (6), 577-581 (2012).</li>
<li>Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-27632+simplifies+the+isolation+procedure+of+human+primary+epidermal+cells+by+selectively+blocking+focal+adhesion+of+dermal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (2), e1251-e1255 (2018).</li>
<li>Zou, D., Pan, J., Zhang, P., Wu, X. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/306307941_A_new_method_to_isolate_human_epidermal_keratinocytes">A new method to isolate human epidermal keratinocytes.</a> Journal of Clinical Dermatology (in Chinese). 6, 424-429 (2016).</li>
<li>Cerqueira, M. T., Frias, A. M., Reis, R. L., Marques, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfollicular+epidermal+stem+cells%3A+boosting+and+rescuing+from+adult+skin%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Interfollicular epidermal stem cells: boosting and rescuing from adult skin).</a> Methods in Molecular Biology. 989, 1-9 (2013).</li>
<li>Candi, E., Schmidt, R., Melino, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cornified+envelope%3A+a+model+of+cell+death+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cornified envelope: a model of cell death in the skin.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6 (4), 328-340 (2005).</li>
<li>Breyer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+Rho+kinases+increases+directional+motility+of+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of Rho kinases increases directional motility of microvascular endothelial cells.</a> Biochemical Pharmacology. 83 (5), 616-626 (2012).</li>
<li>Wozniak, M. A., Modzelewska, K., Kwong, L., Keely, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+adhesion+regulation+of+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Focal adhesion regulation of cell behavior.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1692 (2-3), 103-119 (2004).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Gekweekte primaire HKCs hebben grote schaal gebruikt voor de behandeling van wonden in klinieken voor meer dan drie decennia, en sinds die tijd, het is altijd belangrijk geweest voor efficiënt voldoende aantallen cellen voor klinische toepassingen te verkrijgen in een tijdige wijze. Daarom, in de praktijk, de conventionele isolatie-methode, waarbij de scheiding van de epidermis van de dermis, maakt het moeilijk om te voldoen aan deze eisen, als gevolg van de lage opbrengst van de cellen en het lage vermogen om de passage...

Het doel was het ontwikkelen van een eenvoudige en efficiënte protocol om te isoleren van de primaire mens keratinocyten (HKCs) uit volwassen weefsel, met name voor klinische toepassingen. Huid epidermal stamcellen, gelokaliseerd in de basale laag van de huid, bezitten een groot potentieel om te vermenigvuldigen en te onderscheiden en te voorzien van keratinocyten om de functies van de huid1,2,3, 4. HKCs geïsoleerd uit de huid weefsels veel voor huid weefsel engineering en regeneratie doeleinden, vooral in het herstel van beschadigde huid en in de therapie van het gen voor klinische toepassingen5,6 gebruikt worden. Het hoofdthema voor HKC gebaseerde toepassingen is efficiënt isoleren en uitbreiden van grote aantallen HKCs met hoge potentiële in vitro7,8. Hoewel verschillende onderzoeksgroepen hebben methodes voor de productie van culturen van stam-achtige HKCs ontwikkeld, zijn deze methoden soms tijdrovend en ingewikkeld uit te voeren en hebben andere beperkingen, zoals lage cel opbrengsten en wordt beperkt door het type van huid specimen 9gebruikt. Bijvoorbeeld, impliceert de traditionele methode om te isoleren van de HKCs van de huid weefsels een tweestaps enzymatische spijsvertering met een scheiding van de epidermis van de dermis6. Deze methode werkt meestal goed voor neonatale weefsels, maar het zeer moeilijk zijn wanneer gebruikt voor het isoleren van cellen uit volwassen weefsel wordt.
Y-27632, een inhibitor van de omwenteling van Rho-geassocieerde proteïne kinase (ROCK), is gemeld aan het aanzienlijk verbeteren van de efficiëntie van de cel van de stam van de epidermale isolatie en kolonie groei10,11,12. In een eerdere studie ontdekten we dat Y-27632 de klonale groei van epidermale cellen vergemakkelijkt, maar het rendement van dermale cellen vermindert door het differentieel beheersen van de expressie van hechting moleculen13. Wij ook vastgesteld een nieuw geconditioneerde inoculatie medium, G-medium, ter ondersteuning van de groei en rendement van primaire epidermale cellen genoemd. Door het combineren van G-medium met Y-27632, kan deze nieuwe methode spontaan epidermale en dermale cellen scheiden na enzym spijsvertering, waardoor de stap van13,14van de scheiding van de epidermis-dermis. Op basis van eerdere verslagen, beschrijven we nu de gedetailleerde procedure voor deze nieuwe methode om te isoleren van de HKCs van volwassen huidweefsel.

<table><tbody><tr><td>Countess automated cell counter</td><td>Invitrogen Inc. </td><td>C10227</td><td>Automatisch tellen van cellen </td></tr><tr><td>CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026333</td><td>Voor cel incubatie</td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R Centrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004380</td><td>Celcentrifuge</td></tr><tr><td>Constant Temperature Shaker</td><td>Shanghai Boxun</td><td>150036</td><td>Voor waterbad</td></tr><tr><td>Elektronische weegschaal</td><td>Harbin Zhonghui</td><td>1171193</td><td>Voor weegschaal van weefsel</td></tr><tr><td>Celcultuurschaal</td><td>Eppendorf</td><td>30702115</td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>50ml Centrifugeerbuis</td><td>KIRGEN</td><td>171003</td><td>Voor celcentrifuge</td></tr><tr><td>Celzeef</td><td>Corning incorporated</td><td>431792</td><td>Celfiltratie</td></tr><tr><td>Fosfaat gebufferde oplossing</td><td>Solarbio Life Science </td><td>P1020-500</td><td>Wasoplossing</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Scientific</td><td>C11995500</td><td>Onderdeel van neutralisatiemedium</td></tr><tr><td>Gedefinieerd K-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>10785-012</td><td>Epidermale celcultuurmedium</td></tr><tr><td>Penicilline Streptomycine</td><td>Thermo Scientific</td><td>15140-122</td><td>Antibiotica</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1AC5</td><td>Onderdeel van neutralisatiemedium</td></tr><tr><td>0,05% Trypsine</td><td>Life Technologies</td><td>25300-062</td><td>Voor HKC dissociatie</td></tr><tr><td>0,25% Trypsine </td><td>Beijing Solarbio Science &amp; Technology</td><td>T1350-100</td><td>Voor HKC dissociatie</td></tr><tr><td>Coating Matrix Kit</td><td>Life Technologies</td><td>R-011-K</td><td>Voor coating matrix</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>17105-041</td><td>Voor HKC isolatie</td></tr><tr><td>Collagenase Type I</td><td>Life Technologies</td><td>17100-017</td><td>Voor HKC isolatie</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I</td><td>Sigma</td><td>9003-98-9</td><td>Voor HKC isolatie</td></tr><tr><td>F12 voedingsmix, Hams</td><td>Life Technologies</td><td>31765035</td><td>Onderdeel van G-medium</td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17504044</td><td>Groeifactor in G-medium</td></tr><tr><td>FGF-2 Millipore</td><td>Merck Biosciences</td><td>341595</td><td>Groeifactor in G-medium</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503</td><td>ROCK-remmer</td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Gibco</td><td>15290026</td><td>Voorbereiding voor G-medium</td></tr><tr><td>EGF Recombinant Human Protein</td><td>Gibco</td><td>PHG0311</td><td>Groeifactor in G-medium</td></tr><tr><td>Cell Counting Kit-8</td><td>Thermo Scientific</td><td>NC9864731</td><td>Celproliferatie en cytotoxiciteitstesten</td></tr><tr><td>Muis Anti-Menselijke Cytokeratin5</td><td>Hewlett-Packard Development Company</td><td>MA-20142</td><td>Voor immunofluorescentiekleuring om differentiatiemarker van HKC's te controleren</td></tr><tr><td>Konijn Anti-Menselijke Loricrin</td><td>Covance</td><td>PRB-145p</td><td>Voor immunofluorescentiekleuring om differentiatiemarker van HKC's te controleren</td></tr><tr><td>Muis anti-menselijke Vimentin</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>3390</td><td>Voor immunofluorescentiekleuring van dermale fibroblasten</td></tr><tr><td>Integrine &alpha;6(GOH3)</td><td>Santa Cruz </td><td>SC-19622</td><td>Flow cytometrie analyse van HKC's</td></tr><tr><td>Rat IgG2a FITC</td><td>Santa Cruz </td><td>SC-2831</td><td>Negatieve controle antilichaam van &alpha;6-integrine  in flow cytometrie analyse </td></tr></tbody></table>

een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primaire menselijke keratinocyten van frisse huid weefsels en hun expansie in vitro geïsoleerd hebben wijd gebruikt voor laboratoriumonderzoek en klinische toepassingen. De isolatie van de conventionele methode van menselijke keratinocyten impliceert een sequentiële enzymatische spijsvertering-procedure in twee fasen, die heeft bewezen bij het genereren van primaire cellen van volwassen weefsels als gevolg van de lage cel terugvinding en de verminderde cel inefficiënt te zijn levensvatbaarheid. Onlangs meldden wij een geavanceerde methode om te isoleren van de menselijke primaire epidermale voorlopercellen van huid weefsels die gebruikmaakt van de Rho kinase inhibitor Y-27632 in het medium. Vergeleken met de traditionele protocol, deze nieuwe methode is eenvoudiger, makkelijker en minder tijdrovend, en verhoogt de cel van de stam van de epitheliale opbrengst en verbetert hun kenmerken van de cel van de stam. Bovendien, de nieuwe methodologie hoeft niet de scheiding van de epidermis van de dermis, en is daarom geschikt voor het isoleren van de cellen van verschillende types van volwassen weefsels. Deze nieuwe methode van de isolatie overwint de grote tekortkomingen van conventionele methoden en is meer geschikt voor de productie van grote aantallen epidermale cellen met hoge potentie zowel voor laboratorium klinische toepassingen. Hier beschrijven we de nieuwe methode in detail.

Schema's van de nieuwe methode (figuur 1A) en de conventionele methode (figuur 1B) worden weergegeven in Figuur 1. De conventionele methode is een tweestaps spijsvertering, waarvoor de procedure van een 2-daagse. De nieuwe methode is daarentegen een one-step spijsvertering, die ongeveer 3 uur duurt uit te voeren. Nog belangrijker is, kunt de nieuwe methode van one-step verkrijgen twee populaties (epi...

Hier presenteren we een protocol om efficiënt isoleren primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid weefsels. Deze methode vereenvoudigt de conventionele procedure met behulp van de Y-27632 van de Inhibitor van de omwenteling ROCK in het medium van de inoculatie spontaan epidermale cellen uit dermale cellen scheiden.

Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Het algemene doel van deze video is om een nieuwe eenvoudige methode te introduceren om primaire humane epidermale cellen te isoleren en te kweken uit volwassen huidweefsel. Deze geavanceerde methode is geschikter voor het produceren van een groot aantal hoogwaardige epidermale cellen voor zowel laboratorium- als klinische toepassingen. Was het weefsel met PBS voor het wegen.Weeg het huidweefsel met een elektronische weegschaal. Spoel het huidweefsel 30 seconden lang met 70% ethanol. Incubeer het weefsel twee keer gedurende vijf minuten in PBS met antibiotica.Breng het weefsel over naar een andere steriele schaal en homogeniseer het grondig met behulp van scalpelbladen. Voeg elke vijf minuten 200 microliter PBS toe om het weefsel nat te houden. Breng het gehomogeniseerde weefsel over in een buis van 50 milliliter.Voeg 10 milliliter enzymmengsel toe voor elke gram huidweefsel. Meng de enzymen grondig met de gehomogeniseerde weefsels. Incubeer het mengsel in een waterbad van 37 graden Celsius met schudden.Voeg daarna 1/5 van het volume 0,25% trypsine toe. Zet de incubatie voort gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius. Voeg Dnase I-oplossing toe aan het mengsel in e

a-simplified-efficient-method-to-isolate-primary-human-keratinocytes

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Een snelle, robuuste manier van isoleren levensvatbare volwassen epitheliale stamcellen uit menselijke huid is beschreven. De methode maakt gebruik van enzymatische afbraak van de huid collageen matrix, gevolgd door het plukken van de haarfollikels en isolatie van single cell suspensies of weefsel fragmenten voor celkweek.

Isolatie en Cultuur van Volwassen epitheliale stamcellen uit menselijke huid

This video describes the isolation of keratinocytes—the most prominent cells of human skin's epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

Wij rapporteren een methode om naïeve multipotente huid-afgeleide precursor (SKP) cellen uit primaire menselijke fibroblast culturen te isoleren. We laten zien dat deze SKPs afgeleid van fibroblastculturen delen dezelfde stamcel eigenschappen aan deze die direct afgeleid van de menselijke huid biopten. Deze cellen brengen de neurale marker, nestin naast multipotente merkers zoals OCT4 en Nanog.

Naïve Volwassen stamcellen Isolatie van primaire humane fibroblastkweken

Dit manuscript geeft een stapsgewijze procedure voor het verkrijgen en onderhouden van humane keratinocyten uit getrokken haar en de daaropvolgende generatie van integratievrije menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) door middel van episomale vectoren.

Generatie van Integratie-vrije mens geïnduceerde pluripotente stamcellen Met behulp van Hair-afgeleide keratinocyten

Epidermale keratinocyten vormen een functionele huidbarrière en worden gepositioneerd in de voorste lijn van de gastheerverdediging tegen externe milieubeledigingen. Hier beschrijven we methoden voor isolatie en primaire cultuur van epidermale keratinocyten van neonatale en volwassen muishuid, en inductie van terminale differentiatie en UVB-geactiveerde ontstekingsrespons van keratinocyten.

Isolatie en Cultuur van Primaire Muis Keratinocyten Uit Neonatale en Volwassen Muis Huid

De menselijke huid fungeert als een eerste lijn van verdediging tegen de externe omgeving. Presenteren we een methode voor het isoleren van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid. Deze geïsoleerde keratinocyten zijn nuttig in talrijke experimentele opstellingen en een zeer geschikt model voor het bestuderen van de moleculaire mechanismen in cutane biologie in vitro.

Generatie en kweken van primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid

Het doel van dit protocol is het isoleren van epidermale keratinocyten uit de rughuid van volwassen muizen voor een verscheidenheid aan downstreamtoepassingen zoals moleculaire biologie, biochemie, fluorescentie geactiveerde celsortering en primair in vitro gebruik (bijv. clonogene keratinocyten).

Isolatie van muizen epidermale keratinocyten en hun in vitro Clonogene cultuur

Hier beschrijven we een protocol voor de systematische teelt van epidermale sferoïden in 3D-suspensiecultuur. Dit protocol heeft uitgebreide toepassingen voor gebruik in een verscheidenheid van epitheelweefseltypes en voor het modelleren van verscheidene menselijke ziekten en voorwaarden.

Het opzetten van een epidermale sferoïde cultuursysteem met hoge doorvoer om keratinocytstamcelplasticiteit te modelleren

Het huidige protocol beschrijft de isolatie en cultuur van orale keratinocyten afgeleid van het volwassen muizengehemelte. Een evaluatiemethode met behulp van immunostaining wordt ook gemeld.

Isolatie en kweek van primaire orale keratinocyten uit het volwassen muizengehemelte

De studie van wondgenezing geassocieerd met musculoskeletale schade vereist vaak de beoordeling van in vitro interacties tussen Schwann-cellen (SC's), keratinocyten en fibroblasten. Dit protocol beschrijft de isolatie, kweek en karakterisering van deze primaire cellen uit de menselijke voorhuid.

Isolatie, kweek en karakterisering van primaire Schwann-cellen, keratinocyten en fibroblasten uit menselijke voorhuid

Dit protocol schetst de kweek van vers verkregen (passage 0) keratinocyten voor gebruik in beeldvorming van levende cellen.

Genereren van primaire culturen voor beeldvorming van levende cellen van keratinocyten

Leer een vereenvoudigde methode om primaire humane keratinocyten te isoleren uit volwassen huidweefsel met behulp van ROCK-inhibitor Y-27632. Dit efficiënte protocol levert hoge opbrengsten aan levensvatbare cellen voor celbiologisch en dermatologisch onderzoek.

Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel

Meer video's verkennen