Een vereenvoudigde en efficiënte methode om te isoleren van de primaire mens keratinocyten van volwassen huidweefsel
August 25th, 2018
Hier presenteren we een protocol om efficiënt isoleren primaire menselijke keratinocyten van volwassen huid weefsels. Deze methode vereenvoudigt de conventionele procedure met behulp van de Y-27632 van de Inhibitor van de omwenteling ROCK in het medium van de inoculatie spontaan epidermale cellen uit dermale cellen scheiden.
Het algemene doel van deze video is om een nieuwe eenvoudige methode te introduceren om primaire humane epidermale cellen te isoleren en te kweken uit volwassen huidweefsel. Deze geavanceerde methode is geschikter voor het produceren van een groot aantal hoogwaardige epidermale cellen voor zowel laboratorium- als klinische toepassingen. Was het weefsel met PBS voor het wegen.
Weeg het huidweefsel met een elektronische weegschaal. Spoel het huidweefsel 30 seconden lang met 70% ethanol. Incubeer het weefsel twee keer gedurende vijf minuten in PBS met antibiotica.
Breng het weefsel over naar een andere steriele schaal en homogeniseer het grondig met behulp van scalpelbladen. Voeg elke vijf minuten 200 microliter PBS toe om het weefsel nat te houden. Breng het gehomogeniseerde weefsel over in een buis van 50 milliliter.
Voeg 10 milliliter enzymmengsel toe voor elke gram huidweefsel. Meng de enzymen grondig met de gehomogeniseerde weefsels. Incubeer het mengsel in een waterbad van 37 graden Celsius met schudden.
Voeg daarna 1/5 van het volume 0,25% trypsine toe. Zet de incubatie voort gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 graden Celsius. Voeg Dnase I-oplossing toe aan het mengsel in een verhouding van 1 tot 100.
Incubeer vervolgens nog eens vijf minuten. Stop het verteringsproces door dezelfde hoeveelheid neutralisatiemedium toe te voegen. Pipetteer de oplossing ongeveer 20 keer op en neer.
Filter de gedissocieerde cellen door een celzeef van 100 micrometer om weefseldebris te verwijderen. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 200 g. Observeer de pellet op de bodem van de buis.
Verwijder de supernatanten en was het celpellet met 10 milliliter neutralisatiemedium. Centrifugeer vervolgens gedurende vijf minuten bij 200 g. Resuspendeer het celpellet in het inoculatiemedium met 10 micromolar ROCK-remmer.
Plaat twee keer 10 tot de zesde cel in een kweekschaal van 100 millimeter. Vervang na drie dagen het inoculatiemedium door keratinocytenmedium zonder serum. Ververs het medium om de twee dagen.
Wanneer de cellen ongeveer 80% van de dichtheid hebben bereikt, passeer de cellen. Was de cellen met PBS. Indien nodig, trypsiniseer gedurende twee minuten en was de cellen met PBS om besmette dermale cellen te verwijderen.
Voeg dezelfde hoeveelheid neutralisatiemedium toe. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 200 g. Verwijder tenslotte de supernatanten en resuspendeer het celpellet.
De geïsoleerde keratinocyten uit menselijk huidweefsel werden afzonderlijk geïncubeerd met twee methoden. De conventionele methode is een tweedelige vertering die een procedure van twee dagen omvat. Daarentegen is de nieuwe methode een eenmalige vertering die ongeveer drie uur duurt.
Op de derde dag kunnen we gemakkelijk veel celclusters vinden die met de nieuwe methode zijn gekweekt, terwijl dit fenomeen niet optreedt bij gebruik van de conventionele methode. Op de vijfde dag werd waargenomen dat de nieuwe methode een grotere hoeveelheid primaire cellen produceerde. Om de differentiatiestatus van gekweekte keratinocyten te testen, analyseerden we de basale celmarker K5 en de terminale differentiatiemarker Loricrin.
We ontdekten dat 90% van de totale cellen K5-positief was, maar minder dan 10% van de cellen exprimeerde Loricrin bij passage drie, wat aangeeft dat het ongedifferentieerde keratinocyten zijn. We controleerden de expressie van vimentin, dat wordt geëxprimeerd in de dermale fibroblast, om de besmetting van de dermale cellen tijdens isolatie te onderzoeken. We ontdekten dat ongeveer 3% van de dermale cellen in de initiële passage verscheen, maar slechts ongeveer 0,02% van de dermale cellen werd gedetecteerd bij passage drie, wat wijst op een hoge zuiverheid van de epidermale cellen na passage.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overzicht
Dit artikel presenteert een vereenvoudigd protocol voor het isoleren van primaire humane keratinocyten uit volwassen huidweefsels. De methode maakt gebruik van de ROCK-remmer Y-27632 om de scheiding van epidermale cellen van dermale cellen te vergemakkelijken.
Belangrijkste Onderzoekscomponenten
Wetenschapsgebied
- Celbiologie
- Dermatologie
- Regeneratieve Geneeskunde
Achtergrond
- Primaire humane keratinocyten zijn essentieel voor verschillende onderzoekstoepassingen.
- Conventionele isolatiemethoden kunnen complex en tijdrovend zijn.
- Het gebruik van ROCK-remmer Y-27632 biedt een efficiëntere aanpak.
- Geïsoleerde keratinocyten kunnen zowel in laboratorium- als klinische omgevingen worden gebruikt.
Doel van het onderzoek
- Om een efficiëntere methode te ontwikkelen voor het isoleren van epidermale cellen.
- Om het opbrengst van hoogwaardige epidermale cellen te verbeteren.
- Om onderzoek en klinische toepassingen met huicellen te vergemakkelijken.
Gebruikte methoden
- Was het huidweefsel met PBS voor het weegschaal.
- Weeg het huidweefsel met een elektronische weegschaal.
- Spoel het weefsel gedurende 30 seconden met 70% ethanol.
- Incubeer het weefsel twee keer gedurende vijf minuten in PBS met antibiotica.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol isoleert succesvol primaire keratinocyten.
- Er werden hoge opbrengsten aan levensvatbare epidermale cellen verkregen.
- De methode is reproduceerbaar en efficiënt.
- Geïsoleerde cellen kunnen voor verschillende toepassingen worden gebruikt.
Conclusies
- Deze methode vereenvoudigt de isolatie van primaire keratinocyten.
- Het biedt een betrouwbare aanpak voor onderzoekers op het gebied.
- Het gebruik van ROCK-remmer verbetert de celopbrengst en levensvatbaarheid.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Isolating high-purity primary human keratinocytes from adult skin remains a bottleneck in dermatology and regenerative medicine R&D due to low yield and contamination risks. This simplified one-step enzymatic method with ROCK inhibitor Y-27632 improves epidermal cell recovery and stemness, enabling scalable production for target validation and preclinical modeling. The approach reduces procedural complexity and time, supporting reproducible assay development and translational continuity from discovery to lead optimization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of epidermal signaling pathways and target engagement in a physiologically relevant human cell system.
- Operational Value: Provides a renewable source of primary keratinocytes with high K5+/Loricrin- purity for consistent target de-risking.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by maintaining stem cell characteristics and low fibroblast contamination (<0.02% at P3) for reliable phenotype screening.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates large numbers of viable epidermal cells suitable for high-throughput compound screening and cytotoxicity testing.
- Standardization: The one-step digestion protocol (~3 hours) improves reproducibility across batches and laboratories.
- Scalability: Eliminates epidermis-dermis separation, allowing application to diverse adult tissues and increasing throughput for lead identification campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Produces keratinocytes with stem cell properties that model human epidermal homeostasis and barrier function.
- Translational Continuity: Maintains phenotypic stability through passaging, supporting preclinical efficacy and safety testing.
- Risk-Adjusted Advancement: High purity and yield reduce biological variability, improving confidence in go/no-go decisions for topical or regenerative candidates.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum by supplying validated primary human keratinocytes for early target validation, enabling assay development for screening campaigns, and supporting preclinical evaluation of dermatological therapeutics.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on epidermal targets using a purified, stem-cell-enriched human cell system.
- Screening: Delivers standardized, quantitative cell preparations for dose-response and biomarker readouts in compound evaluation.
- Analytics: Enables measurement of differentiation markers (K5, Loricrin) and contamination levels (vimentin) to assess cellular phenotype and purity.
- Translational Research: Supports continuity from isolated primary cells to preclinical models by preserving epidermal stemness and functionality.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolation platform applicable across multiple projects requiring human epidermal cells.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through high-purity, stem-cell-enriched keratinocyte production.
- Operational Value: Reduces isolation time from two days to ~3 hours, improving laboratory throughput and resource efficiency.
- Strategic Value: Enhances predictive confidence in early-stage programs by minimizing biological noise from dermal contamination.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on reliable epidermal cell-based assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell culture and enzymatic tissue dissociation techniques.
- Necessitates access to ROCK inhibitor Y-27632, enzyme mixtures (e.g., dispase, trypsin), and DNase I for digestion.
- Demands standardized centrifugation, filtration, and sterile technique to maintain cell viability and purity.
- Requires adaptation of inoculation and keratinocyte media formulations for optimal expansion and passaging.
- Practical limitations include donor variability in skin tissue quality and the need for aseptic handling to prevent microbial contamination.
