Name: Traceren van genexpressie door detectie van β-galactosidase-activiteit in hele muis embryo s (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Leer de detectie van β-galactosidase-activiteit in hele muizenembryo's voor het bestuderen van genexpressie tijdens de embryonale ontwikkeling. Deze methode biedt een snelle en betrouwbare visualisatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

We bedank de histopathologische Service voor hun technische bijstand bij het Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC). Wij danken ook Dr. Motoharu Seiki voor vriendelijk bieden Mt4-mmpLacZ muizen, en Dr. Alicia G. Arroyo om ons project te steunen en voor haar kritische lezing van het manuscript. Wij wensen Peter Bonney dank voor dit artikel proeflezen. Dit werk werd gesteund door Universidad Europea de Madrid door middel van een subsidie uit (# 2017UEM01) aan CSC

Alle experimentele procedures werden goedgekeurd door de Commissie op de ethiek van dier experimenten van de CNIC (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) en de Comunidad Autónoma de Madrid om minimale dierenleed.
1. verzamelen van embryo's van zwangere muizen (van E8.5 naar E12.5)
<ol><li>Offeren zwangere muizen door cervicale dislocatie of CO2 inademing. De dag van de eerste waargenomen vaginale plug werd beschouwd als embryonale dag 0,5 (E0.5).</li>
	<li>Leg het dier in de liggende positie op het absorberend stootkussen en reinigen van de buikhuid van de muis met 70% ethanol. Opmerking: Steriliteit is niet vereist in de volgende stappen.</li>
	<li>Knijpen en til de buikhuid met behulp van de muis-tooth pincet.</li>
	<li>Maak een incisie door de huid en de buikwand, 2 tot 4 cm verticaal over de middellijn van de buik met behulp van chirurgische scharen.</li>
	<li>De buik bloot en verwijderen van de baarmoeder horens van de moeder met pincet snijden bloedvaten langs de innerlijke kromming van de baarmoeder met een chirurgische schaar.</li>
	<li>Verwijder de tekenreeks van embryo's en het overbrengen in een petrischaal op ijs met 10 mL ijskoud 0,01 M fosfaatbuffer zoutoplossing pH 7.4 (PBS).</li>
	<li>Zorgvuldig ontleden de embryo's uit van de baarmoeder onder een stereomicroscoop in een petrischaal met 10 mL verse ijskoude PBS. Pak de spier muur met horlogemakers pincet om het vruchtwater sac bloot te stellen, en vervolgens het scheuren van het vruchtwater membraan om de bijgevoegde embryo en de dooierzak met behulp van de tips van de verlostang te verwijderen.</li>
	<li>Verzamelen van de embryo's van littermate van zwangere muizen in vroege stadia (van E8.5 naar E12.5) (Figuur 2).</li>
	<li>De embryo's overbrengen in een verse schotel met 10 mL koude 1 x PBS met gebogen pincet of voor zeer kleine embryo's (E8.5-E9.5), kunststof overdracht pipetten te gebruiken voor het verzamelen van de monsters zonder embryo schade.</li>
	<li>Voordat u begint de fixatie, neemt een embryonale monster in de buis van een microcentrifuge voor genotypering door snijden van een klein stukje van het embryo of het nemen van het vruchtwater membraan in de kleinste embryo's (van E8.5 naar E9.5) met horlogemakers pincet. Opmerking: LacZ genotypering wordt bepaald door de polymerase-kettingreactie (PCR) inleidingen: forward, 5´-ATCGTGCGGTGGTTGAACTG-3´; omkeren, 5´-CGAGGCGTTAACCGTCAGCA-3´.</li>
</ol>2. fixatie van muis embryo 's
<ol><li>Pipetteer elk embryo in een tube van 2 mL microcentrifuge met een afgeronde basis met 1 mL 1 x PBS. Opmerking: Voer alle stappen in het protocol in deze buizen met agitatie met behulp van een rollende shaker.</li>
	<li>De embryo's in 1 x PBS voor 1 minuut bij kamertemperatuur te elimineren van het resterende bloed wassen. Gebruik plastic overdracht pipetten te veranderen van vloeistoffen in de buizen.</li>
	<li>Corrigeer het embryo in 1 mL van 0,125% Glutaaraldehyde op ijs. Opmerking: De tijd van fixatie hangt af van de grootte van het embryo: 20 min voor E8.5-E9.5 embryo's, 30 min voor E10.5 embryo's en 1 h voor E12.5 embryo's.</li>
	<li>Verwijder de fixeer en wassen van de embryo's in 1 x PBS tweemaal gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur alvorens het monster te verwerken voor X-gal kleuring.</li>
</ol>3. hele Mount β-galactosidase histochemie van muis embryo 's
<ol><li>Voorbereiden X-Gal Rinse buffer en X-Gal kleuring van de oplossing vóór het begin van de procedure (Zie tabel 1 en Tabel van materialen). Gebruik een wild-type (WT) littermate embryo's als negatieve controles voor de enzymatische reactie.</li>
	<li>Incubeer de embryo's X-Gal Rinse buffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (Figuur 2).</li>
	<li>Incubeer de embryo's X-Gal kleuring oplossing van 2 h tot overnachting bij 37 ° C beschermd tegen licht. Monitor de kleur reactie periodiek via een ontleden Microscoop totdat voldoende intensiteit van de blauwe vlekken zonder de achtergrond in het embryo wordt waargenomen. Houden van de pH van de oplossing tussen 8 en 9 te verminderen achtergrond tijdens de hele kleuring. Als de kleurstofoplossing begint te licht, vervangen door verse substraat oplossing uit te breiden van de enzymatische reactie.</li>
	<li>Zet de reactie stop wanneer het gewenste signaal wordt verkregen door wassen van embryo's in een microcentrifuge buis met 1 mL 1 x PBS tweemaal voor elke 10 min bij kamertemperatuur.</li>
	<li>1 mL 4% paraformaldehyde (PFA) opnieuw corrigeren, gebeitst embryo's overbrengen voor 1 h naar girale bij 4 ° C. Opmerking: Embryo's kunnen worden opgeslagen in 4% PFA/PBS voor langere tijd bij 4 ° C of onmiddellijk kan worden verwerkt voor het segmenteren. Deze laatste fixatie stap is cruciaal voor de instandhouding op lange termijn van de kleuring patroon.</li>
	<li>Het wassen van de embryo's in 1 mL 1 x PBS tweemaal gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Optie 1: Schakel embryo's door onderdompeling in een reeks van oplossingen met toenemende concentraties van glycerol (20%, 40%, 60% en 80% glycerol in 1 x PBS) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in elke oplossing. Opmerking: Wassen van embryo's in 80% glycerol voor langere tijden, zelfs dagen, totdat ze worden gewist, en vervolgens in 80% glycerol bij 4 ° C bij deze stap (Figuur 2 opgeslagen). Een zeer kleine hoeveelheid natrium azide ora kristal van thymol toe te voegen aan de embryo's opgeslagen bij 4 ° C in glycerol of 1 x wordt PBS aanbevolen om te voorkomen dat schimmel groei. Na verrekening, kunnen hele mount embryo's worden gebruikt voor het fotograferen (stap 4).</li>
	<li>Optie 2: Verwerken van embryo's voor paraffine insluiten en segmenteren gebruikend microtome (Figuur 2). Document het expressiepatroon in geheel gebeitst embryo's vóór het segmenteren (stappen 4 en 5).</li>
</ol>4. fotografie van de embryo's hele Mount
<ol><li>Verhard om te fotograferen hele mount gekleurd embryo's voorafgaand aan afdelen, hen overbrengen in een petrischaal bereid met een basis van 1-2% agarose in 1 x PBS.</li>
	<li>Betrekking hebben op het embryo volledig met 10 mL 1 x PBS in de agarose beklede gerechten om uitdroging en reflectie tijdens het fotograferen door de vloeistof te voorkomen.</li>
	<li>Het embryo ondergedompeld in 1 x PBS met pincet oriënteren. Voor oudere embryo's (E10.5-E12.5), maak een klein gaatje in de agarose met een tang te plaatsen en plaats het model binnen het onder verschillende hoeken en om te voorkomen dat de vrij zwevende tijdens fotografie.</li>
	<li>Plaats de schotel in het werkgebied van de stereomicroscoop, met behulp van het licht uitgezonden (onder fase). Wisselen tussen de 'dark-veld' en 'helder-veld' aanpassingen om de gewenste verlichting tijdens fotografie en voor het optimaliseren van de doorschijnendheid van het monster. Opmerking: Gebruik fiber optic verlichting voor later-stadium embryo's te voorkomen van reflectie op het oppervlak van het embryo. Bij het fotograferen van gewiste embryo's, volgt u dezelfde procedure maar hen overbrengen in een petrischaal met 100% glycerol en hen volledig te onderdompelen.</li>
</ol>5. de paraffine insluiten en segmenteren van X-gal gekleurd embryo 's
<ol><li>Paraffine insluiten<ol>
<li>Verwijderen van de X-gal gekleurd embryo's bij 4 ° C (stap 3.5) en spoel ze met 1 mL 1 x PBS driemaal te elimineren van de overdaad aan fixeerspray.</li>
		<li>Elk embryo overbrengen in een histologie cassette met pincet.</li>
		<li>Plaats de cassettes die met de embryo's in een bekerglas en vervolgens uitdrogen door hen door een gesorteerde ethanol reeks bij kamertemperatuur: 70% ethanol, eenmaal voor 30 min; 96% ethanol, twee keer voor 30 min elke; 100% ethanol, tweemaal voor elke 30 min. Opmerking: Embryo's kunnen worden opgeslagen in 70% ethanol voor een onbepaalde tijd bij 4 ° C tot aanvang van het proces van uitdroging.</li>
		<li>Laat de hele cassette in isopropanol en gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur inwerken.</li>
		<li>Met behulp van Tang, de cassettes overbrengen in een glas kleuring trog met voorverwarmde isopropanol en laat in een oven bij 60 ° C gedurende 30 minuten.</li>
		<li>Plaats de cassettes in een nieuwe glas kleuring trog met een mengsel van isopropanol en de 50% / 50% gesmolten paraffine en laat gedurende 4 uur in een oven van 60 ° C.</li>
		<li>Incubeer de cassettes met de embryo's met twee wijzigingen voor gesmolten paraffine, 30 minuten bij 60 ° C elke.</li>
		<li>Aan het einde van de laatste paraffine wassen, opent u de cassette en elk embryo overbrengen in een aparte weefsel schimmel om het monster onder een stereomicroscoop weer te embedding.</li>
		<li>Vul de put met gesmolten paraffine bij 60 ° C. Gebruik verwarmd pincet voorzichtig oriënteren het embryo in de mal te houden de was gesmolten. Opmerking: De juiste stand van het monster is een cruciale stap voor afdelen van het embryo in het gewenste vlak.</li>
		<li>Voordat paraffine in de mal stolt, plaats een cassette zonder het deksel op de bovenkant van het blok en vul deze met gesmolten paraffine. Laat de resterende wax afkoelen totdat gestold overnachting bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Zodra de paraffine is volledig verhard, de massief blok uit de mal te verwijderen en bewaren van de paraffineblokken bij kamertemperatuur of bij 4 ° C tot14segmenteren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Paraffine segmenteren<ol>
<li>Het mes op de microtoom oriënteren en het opzetten van 5-7 µm van dikte. 5.2.2. cool de paraffine-blok op het ijs en snijd het voor de productie van een kubus of een piramide.</li>
		<li>Koppelt het blok aan de microtoom houder met behulp van een kleine hoeveelheid gesmolten wax.</li>
		<li>Het blok voor optimale scherpe oriënteren. Sectie de paraffineblokken in 5-7 µm dikke sneden bij kamertemperatuur met behulp van standaard microtoom.</li>
		<li>Plaats een fijn penseel met de secties in een waterbad bij kamertemperatuur voor manipuleren en segmenten te selecteren.</li>
		<li>Secties uit het waterbad met een microscoopglaasje halen en ze vervolgens overbrengen naar een waterbad bij 42 ° C voor het uitrekken.</li>
		<li>Verwijderen van secties van het waterbad en plaats ze voorzichtig in hechting Microscoop dia's.</li>
		<li>De dia's in een oven bij 37 ° C's nachts om de secties zich volledig houden goed drogen, anders, ze kunnen krijgen verloren tijdens de kleuring. Opmerking: Bewaren de dia's bij 4 ° C tot starten van kleuring van procedures.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deparaffinization en Counterstaining van X-Gal-gekleurd paraffine secties<ol>
<li>Zet de dia's op een microscoopglaasje lade in een oven bij 60 ° C gedurende ten minste 45 min om de paraffine meer vloeistof.</li>
		<li>Overdracht van de dia's op een rek en glas kleuring gerechten gebruikt u de volgende stappen uitvoeren: dompelen de rek in de kleuring potten met alcoholen van PM10 voor volledige paraffine verwijdering en hydratatie van de weefsels: isopropanol voor 5 min op 60 ° C; isopropanol gedurende 3 minuten; 100% ethanol voor 2 min; 96% ethanol voor 1 min; 70% ethanol voor 1 minuut bij kamertemperatuur.</li>
		<li>Spoel secties in gedistilleerd water tweemaal om ervoor te zorgen dat er geen resten van alcohol zijn.</li>
		<li>Counterstain delen met een vlek (bijvoorbeeld nucleaire-Fast Red oplossing) voor 5 min (meestal tussen 3-8 min) bij kamertemperatuur (Figuur 2). Opmerking: Deze kleuring helpt te onthullen van de algehele structuur van het weefsel in de secties.</li>
		<li>Na kleuring, wassen van de dia's in gedestilleerd water gedurende 1 minuut en controleer sectie vlekken in de Microscoop. Opmerking: Als de gewenste kleuring te zwak is, counterstain afdelingen opnieuw voor een langere tijd.</li>
		<li>Uitdrogen van de secties in de volgende serie met toenemende concentraties van ethanol: twee wasbeurten in ethanol van 95% voor elke 2 min, twee wast in 100% ethanol voor 2 minuten elk, en, om te voorkomen dat ontbinding van de blauwe kleur precipitaten, slechts één snelle wassen in xyleen.</li>
		<li>De dia's uit het rek één voor één verwijderen en leg ze op een stuk papier. Mount en dekglaasje aan elke Schuif met behulp van een synthetische, permanente montage medium. Opmerking: Xyleen is een ontvlambaar product waarvan dampen irriterend zijn en schadelijk voor de menselijke gezondheid en voor waterorganismen zijn. Het moet binnen een kap worden gemanipuleerd en vereist het gebruik van de juiste beschermende uitrusting.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële interesse hebben.

Het LacZ-gen van E. coli is wijd verbeid gebruikt als verslaggever in studies van gen-expressiepatronen vanwege de hoge gevoeligheid en gebruiksgemak detectie. Dit protocol beschrijft een klassieke methode voor het opsporen van β-gal expressie gebaseerd op een enzymatische reactie die is eenvoudig en snel uit te voeren en goedkoop. Deze methode kan ook worden toegepast zonder belangrijke wijzigingen in de hele berg embryo's, intact organen, cryostaat weefselsecties of gekweekte cellen.
<p class="jove_content...

Om specifiek gen expressiepatronen beschrijven, is het gebruik van verslaggever genen als markeringen primordiaal van Drosophila tot zoogdieren geweest. In proeven met dieren van transgene en knockout, is het bacteriële β-galactosidase-gen (LacZ) van Escherichia coli (E. coli) één van de wijdst gebruikte1,,2,3, 4. β-galactosidase (β-gal) katalyseert de hydrolyse van β-galactosides (zoals lactose) in haar monosacchariden (glucose en galactose)5. Zijn meest gebruikte substraat is X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside), een glycoside dat is gehydrolyseerd door β-galactosidase schadeveroorzakende in 5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole en galactose. De eerste wordt geoxideerd tot een dimeer omgezet die, wanneer gebruikt in combinatie met kalium ferri- en ferro-cyanide, produceert een karakteristieke onoplosbare, blauwe kleur neerslag (Figuur 1)6.
Het LacZ -gen begon te worden gebruikt als een verslaggever gen meer dan dertig jaar geleden7,8. Meestal, LacZ is ingebracht stroomafwaarts van een endogene promotor in de plaats van de open leesraam, zodat het kan worden gebruikt in bacteriële en cel cultuur te visualiseren van cellen met een bepaalde invoegen, evenals in transgene dieren als een tracer van endogene Genetische expressiepatronen tijdens ontwikkeling9. In dit verband is de visualisatie van β-galactosidase-activiteit uitgebreid gebruikt in Drosophila te begrijpen van de ontwikkelings- en cellulaire processen van afzonderlijke cellen tot hele weefsels. Drosophila genetica gunst de generatie van stabiele lijnen waarin een gemodificeerde constructie van de P-element met het gen van de verslaggever dat lacz is ingevoegd op willekeurige locaties in het genoom. Dus, wanneer geplaatst onder invloed van enhancer elementen kan hij haar expressie rijden op een specifieke wijze van weefsel, waardoor een systematische analyse van de expressiepatronen van veel genen tijdens de afgelopen twee decennia10. Verder staat het gebruik van transgene muizen LacZ genuitdrukking controleren ook detectie van gene recombinatie gebeurtenissen door Cre-loxP gemedieerde recombinatie en lokalisatie van de mutant embryonale stamcellen derivaten in chimeer analyses 11, die de controle van LacZ expressie in specifieke weefsels zo goed als stoffelijk vergemakkelijkt. Ook in hele embryo's, kan detectie van de β-galactosidase-activiteit produceren differentiële kleuring patronen bij verschillende intensiteiten die gemakkelijk kunnen worden waargenomen in de verschillende ontwikkelingsstadia te analyseren van tijdelijke wijzigingen in genexpressie 8,12.
In dit artikel presenteren we een protocol om te visualiseren van genexpressie via X-gal vlekken in het weefsel van de hele berg op vroege ontwikkelingsstadia van muis embryo's. Wij presenteren deze histochemische methode als een zeer gevoelige en goedkope techniek die nauwkeurige detectie van de gelabelde cellen in de hele berg specimens of op cellulair niveau gunsten nadat paraffine-weefsels of embryo's ingebedde. De methode geschikt is voor de directe visualisatie van vlekken in het weefsel van de muis met de minimale achtergrond in vergelijking met andere methoden13.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>24137-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SCHARLAU</td><td>50004/ LE3Q2014</td><td></td></tr><tr><td>Aqueous mounting medium</td><td>VECTOR LABS</td><td>H-5501</td><td></td></tr><tr><td>Synthetic mounting media</td><td>MERCK</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>96% Ethanol</td><td>PROLABO</td><td>20824365</td><td></td></tr><tr><td>99.9% Ethanol absolute</td><td>SCHARLAU</td><td>ET00021000</td><td></td></tr><tr><td>50% Glutaraldehyde solution</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G6403-100ml</td><td></td></tr><tr><td>85% Glycerol</td><td>MERCK</td><td>104094</td><td></td></tr><tr><td>99.9% Glycerol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>63064</td><td></td></tr><tr><td>Nonionic surfactant (Nonidet P-40)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>542334</td><td></td></tr><tr><td>Nuclear Fast Red counterstain</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>N3020</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin pastilles</td><td>MERCK</td><td>111609</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>158127-500g</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (tablets)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>P4417-50TAB</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferrocyanate</td><td>MERCK</td><td>1049840500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium ferrocyanide</td><td>MERCK</td><td>1049731000</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>S8032</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihydrogen phosphate monohydrate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>Sodium phosphate dibasic dihydrate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>71638</td><td></td></tr><tr><td>Thymol</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T0501</td><td></td></tr><tr><td>Tris hydrochloride (Tris HCl)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>10812846001 (Roche)</td><td></td></tr><tr><td>X-GAL</td><td>VENN NOVA</td><td>R-0004-1000</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>VWR CHEMICALS</td><td>VWRC28973.363</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable plastic cryomolds 15x15x5 mm</td><td>SAKURA</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Rotatory Microtome</td><td>Leica</td><td>RM2235</td><td></td></tr><tr><td>Cassettes</td><td>Oxford Trade</td><td>OT-10-9046</td><td></td></tr><tr><td>Microscope Cover Glasses 24x60 mm</td><td>VWR</td><td>ECN631-1575</td><td></td></tr><tr><td>Microscope slides</td><td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&Auml;SER</td><td>AGAA000001#12E</td><td></td></tr><tr><td>Adhesion microscope slides</td><td>Thermo Scientific, MENZEL-GL&Auml;SER</td><td>J1820AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Flotation Water bath</td><td>Leica</td><td>HI1210</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Low Profile Microtome Blades</td><td>Feather</td><td>UDM-R35</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin oven</td><td>J.R. SELECTA</td><td>2000205</td><td></td></tr><tr><td>Wax Paraffin dispenser</td><td>J.R. SELECTA</td><td>4000490</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Leica</td><td>DM500</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene microcentrifuge tubes 2.0 mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T2795</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>IKA Labortechnik</td><td>HS250 BASIC</td><td></td></tr><tr><td>Stirring Hot Plate</td><td>Bibby</td><td>HB502</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Shaker</td><td>IKA Labortechnik</td><td>MS1</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory scale</td><td>GRAM</td><td>FH-2000</td><td></td></tr><tr><td>Precision scale</td><td>Sartorius</td><td>ISO9001</td><td></td></tr><tr><td>pHmeter</td><td>Crison</td><td>Basic 20</td><td></td></tr><tr><td>Optic fiber</td><td>Optech</td><td>PL2000</td><td></td></tr></tbody></table>

traceren van genexpressie door detectie van β-galactosidase-activiteit in hele muis embryo 's

Tracing Gene Expression Through Detection of &#946;-galactosidase Activity in Whole Mouse Embryos

De Escherichia coli LacZ gen, codering van β-galactosidase, wordt grotendeels gebruikt als verslaggever voor de expressie van genen en als een tracer in cel lineage studies. De klassieke histochemische reactie is gebaseerd op de hydrolyse van het substraat X-gal in combinatie met ijzer(III) en ferro ionen, die een onoplosbare blauwe neerslag die gemakkelijk produceert te visualiseren. Daarom, β-galactosidase-activiteit dient als een marker voor het patroon van de uitdrukking van het gen van belang aangezien de ontwikkeling te werk gaat. Hier beschrijven we het standaardprotocol voor de detectie van β-galactosidase-activiteit in vroege hele muis embryo's en de latere methode voor paraffine segmenteren en counterstaining. Bovendien is voorzien in een procedure voor de verduidelijking van de hele embryo's aan X-gal kleuring dieper de regio, van de embryo beter te visualiseren. Consistente resultaten worden verkregen door het uitvoeren van deze procedure, hoewel optimalisatie van omstandigheden nodig is om te minimaliseren van achtergrond activiteit. Beperkingen in de bepaling moeten ook worden overwogen, met name met betrekking tot de grootte van het embryo in het hele mount kleuring. Onze protocol biedt een gevoelige en een betrouwbare methode voor de detectie van de β-galactosidase tijdens de ontwikkeling van de muis die verder kan worden toegepast op de cryostaat secties, evenals de hele organen. Dus de dynamische gen expressiepatronen in de gehele ontwikkeling kunnen gemakkelijk worden geanalyseerd met behulp van dit protocol in hele embryo's, maar ook gedetailleerde expressie op het cellulaire niveau kan worden beoordeeld na paraffine segmenteren.

Hier tonen we de resultaten van de toepassing van het standaardprotocol voor de β-galactosidase histochemische reactie met behulp van X-gal als het substraat in hele muis embryo's (Figuur 1 en Figuur 2). Met behulp van dit protocol, onderzoeken we membraan type 4-matrix metalloproteinase (Mt4-mmp) expressie op verschillende embryonale ontwikkelingsstadia (E9.5, E11.5 en E12.5) met behulp van Mt4-mmp mutant muizen die uitdrukking ...

Hier beschrijven we het standaardprotocol voor de detectie van β-galactosidase-activiteit in vroege hele muis embryo's en de methode voor paraffine segmenteren en counterstaining. Dit is een gemakkelijke en snelle procedure om te controleren van genexpressie tijdens de ontwikkeling die ook kan worden toegepast op weefselsecties, organen of gekweekte cellen.

Traceren van genexpressie door detectie van β-galactosidase-activiteit in hele muis embryo 's

The Escherichia coli LacZ gene, encoding &#946;-galactosidase, is largely used as a reporter for gene expression and as a tracer in cell lineage studies. ...

Deze methode kan antwoordsleutelvragen hebben op het gebied van de ontwikkelingsbiologie, zoals de studie van genexpressiepatronen tijdens de embryonale ontwikkeling.De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn dat het zeer gevoelig is, gemakkelijk en snel uit te voeren is en directe visualisatie van de kleuring in het gehele weefsel of met hogere resolutie mogelijk maakt na paraffine-sectio van het monster.De procedure zal worden gedemonstreerd door Dr Maria Jose Blanco, Dr Anabel Learte, Dr Emma Munoz en Dr Miguel Marchena.Ze zijn allemaal senior post-doc uit mijn lab.Begin met het incuberen van glutaaraldehyde-gefixeerde transgene embryo's die galactosidase tot expressie brengen in vers bereide X-gal spoelbuffer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.Gebruik wild type litter-made embryo's als negatieve controles voor de enzymatische reactie.Vervolgens, vervang de spoelbuffer met X-gal kleuringsoplossing met een pH van 8-9.Bescherm tegen licht en incubeer gedurende 2 uur tot een nacht bij 37

tracing-gene-expression-through-detection-galactosidase-activity

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

We beschrijven een fluorescentie reporter test om snel te identificeren en karakteriseren genen die muis embryonale stamcellen onderhoud en zelfvernieuwing te reguleren.

Oct4GiP Reporter Assay van genen die muis embryonale stamcellen Onderhoud en Zelfvernieuwing Regel Studie

This video demonstrates a technique for assessing retinoic acid activity in mouse embryos. Upon isolating cells from the mouse embryos, the cells are co-cultured with retinoic acid (RA) reporter cells. Embryonic cells produce RA, which induces beta-galactosidase expression in reporter cells, indicating RA activity in the embryonic cells.

Employing Reporter Cells in a Co-Culture to Study Retinoic Acid Production by Mouse Embryonic Cells

We presenteren hier een geoptimaliseerd protocol om foetale muizen te genotyperen, kleuren en voorbereiden voor de beeldvorming van perifere nociceptor axon projecties in het hele dier, als een effectieve methode om sensorische axon groei fenotypen te beoordelen in zich ontwikkelende genetisch gemodificeerde muizen.

Whole-mount Imaging van Muis Embryo Sensory Axon Projecties

Door gebruik te maken van een binaire genetische strategie bieden we een gedetailleerd protocol voor het traceren van neurale circuits bij muizen die complementaire transsynaptische tracers tot expressie brengen na Cre-gemedieerde recombinatie. Omdat celspecifieke tracerproductie genetisch is gecodeerd, is onze experimentele aanpak geschikt om de vorming en rijping van neurale circuitreeksen te bestuderen tijdens de muis-embryonale hersenontwikkeling met een resolutie van één enkele cel.

Voorwaardelijke Genetische transsynaptische Tracing in de embryonale hersenen van muizen

Dit protocol geeft een werkwijze kwantitatieve eencellige voeren in situ analyse van eiwitexpressie van afstamming specificatie mouse pre-implantatie embryo bestuderen. De noodzakelijke voor het verzamelen van blastocysten procedures, whole-mount immunofluorescentie detectie van eiwitten, beeldvorming van de monsters op een confocale microscoop, en nucleaire segmentatie en beeldanalyse worden beschreven.

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

Het doel van dit protocol is een verliesgevende beschrijven en gain-of functiemethode dat geldt voor neogenin identificeren als een stadium-specifieke receptor die tot trophectoderm en binnenste celmassa differentiatie van pre-implantatie muizenembryo's is.

Verlies- en Gain-of-function Aanpak Early Cell Fate Determinanten Onderzoek in Pre-implantatie muizenembryo&#39;s

Hier presenteren we een protocol ter bevordering van de integratie van transgenic en productie van oprichter transgene muizen met hoge doeltreffendheid door een eenvoudige injectie van een lentivirale vector in de ruimte van de perivitelline van een bevruchte oöcyt.

Lentivirale gemedieerde productie van transgene muizen: een eenvoudige en zeer efficiënte methode voor directe studie van oprichters

Muis bevruchte eieren en vroege fase embryo's worden beschermd door de zona zitten, een glycoproteïne-matrix die een barrière tegen levering van het gen vormt. Dit artikel beschrijft een protocol voor de zona perforeren met een laser transduce van embryonale cellen met lentivirale vectoren en maken van transgene muizen.

Laser-assisted lentivirale Gene levering aan muis bevruchte eieren

Dit artikel stelt een pijplijn op voor hoogwaardige eencellige en kernsuspensies van gastrulerende muizenembryo's voor sequencing van individuele cellen en kernen.

Single-cell RNA-sequencing van gemuteerde hele muizenembryo's: van de epiblast tot het einde van de gastrulatie

We beschrijven methoden om beginnende transcriptie te visualiseren tijdens de activatie van het zygotische genoom in individuele cellen tijdens de vroege embryogenese.

Visualisering van activatie van het zygotische genoom in individuele cellen van vroege embryo's

Leer de detectie van β-galactosidase-activiteit in hele muizenembryo's voor het bestuderen van genexpressie tijdens de embryonale ontwikkeling. Deze methode biedt een snelle en betrouwbare visualisatie.

Traceren van genexpressie door detectie van β-galactosidase-activiteit in hele muis embryo 's

Meer video's verkennen