Biotine gebaseerde Pulldown Assay te valideren mRNA doelstellingen van cellulaire miRNAs

Deze methode kan ons helpen sleutelvragen te beantwoorden op het gebied van mRNA-biologie, zoals of een in silico voorspelde mRNA-doelwit direct kan interageren met een specifiek cellulair microRNA. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat het gebruikmaakt van gebiotinyleerde mimics om het doel-mRNA naar beneden te trekken. En deze gebiotinyleerde mimics hebben locked nucleic acids of LNA-gebaseerde mimic-chemie die helpt bij de vorming van zeer stabiele oligonucleotiden met een zeer hoge affiniteit die de specificiteit van de reactie kunnen verbeteren.

De implicaties van deze methodologie is dat het extra kan bijdragen aan het begrijpen van de biologie van de microRNA tot microRNA-gebaseerde therapieën. Dit komt voornamelijk omdat we allemaal weten dat microRNA's een cruciale rol spelen in elk aspect van cellulaire biologie. Dus door de doelen van de microRNA's te identificeren, dat zijn de mRNA's, kunnen we zeker kritische kennis leveren die belangrijk zou zijn voor ontdekking en therapieën.

Het demonstreren van het protocol zal Sabyasachi Dash zijn, een afgestudeerde student uit ons laboratorium. Om de magnetische kralen met streptavidin te coaten, eerst de kralen grondig te vortexen om opnieuw te suspenderen. Breng vervolgens 30 microliter van de gesuspendeerde kralen over in een twee millimeter nuclease-vrije microfugebuis.

Laat de buis gevuld met de magnetische kralensuspensie gedurende twee minuten op de magneet staan. Verwijder na twee minuten het supernatant met behulp van een micropipet wanneer de kralen naar de zijkant van de buis worden getrokken in contact met de magneet. Voeg vervolgens 100 microliter wasbuffer toe aan de kralen.

Na het toevoegen van de wasbuffer, verwijder de buis van de magneet. Vortex vervolgens de kralen gedurende 15 seconden om ze te wassen. Breng vervolgens de buis met de magnetische kralen op de magneet gedurende twee minuten.

Nadat de incubatie voorbij is, pipet het supernatant eruit en gooi het weg. Voeg vervolgens 100 microliter RNase-vrijmakingsoplossing toe aan de kralen. Vortex de kralen gedurende 15 seconden om de RNase-oplossing te mengen.

Incubeer vervolgens de kralen gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na vijf minuten incubatie, breng de buis met de magnetische kralen op de magneet gedurende twee minuten. Na de incubatie, pipet het supernatant eruit en gooi het weg.

Voeg vervolgens 100 microliter resuspensieoplossing toe aan de kralen en vortex gedurende 15 seconden. Na het vortexen, incubeer de buis gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na vijf minuten, breng de buis met de magnetische kralen op de magneet gedurende twee minuten.

Na twee minuten, pipet het supernatant eruit en gooi het weg. Voeg vervolgens 200 microliter bead-blokkeeroplossing toe aan de kralen. Om de kralen in de blokkeeroplossing op te schorsen, vortex deze grondig bij kamertemperatuur gedurende 15 seconden.

Laat vervolgens de buis op een multi-buisrotator staan bij vier graden Celsius gedurende 16 uur. Gebruik een celschraper om de getransfecteerde HEK293T-cellen onder de laminare kap te schrapen om de lysate voor te bereiden. Breng vervolgens de celsuspensie over in een twee milliliter microfugebuis.

Onderwerp vervolgens de celsuspensie aan centrifugatie bij 1.500g gedurende vijf minuten. Na centrifugatie, lost de celpellet op in 1x fosfaatgebufferd zout op pH 7,2. Herhaal het proces van centrifugatie om een restmediumvrij pellet te verkrijgen.

Nadat de centrifugatie voorbij is, breng de pellet snel op ijs over. Bereid vervolgens verse cellysebuffer. Nadat de buffer is voorbereid, voeg 260 microliter compleet cellysebuffer toe aan het monster in de microfugebuis.

Pipet de celpellet meerdere keren voor een homogene suspensie. Om de cellen te lyseren, incubeer de buizen gedurende 10 tot 15 minuten bij 80 graden Celsius. Laat vervolgens de cellen op ijs staan.

Herhaal het centrifugatieproces bij 16.000g gedurende vijf minuten in een tafelcentrifuge bij vier graden Celsius. Na de centrifugatie, breng het supernatant met lysate over in een steriele 1,7 milliliter microfugebuis op ijs en verwijder het pellet. Voeg aan het supernatant vijf molaire natriumchloride toe om een uiteindelijke concentratie van één molair te bereiken.

Bereid eerst de pull-down wasbuffer voor. Na overnachtelijke incubatie na bead-blokkering, breng de buis met de magnetische kralen op de magneet gedurende twee minuten. Gooi het supernatant weg na de incubatieperiode.

Voeg aan de kralen 150 microliter ijskoude pull-down wasbuffer toe. Vortex vervolgens de kralen gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur. En incubeer onmiddellijk gedurende 30 tot 60 seconden bij kamertemperatuur.

Na een minuut, breng de buis met de magnetische kralen op de magneet gedurende twee minuten. Gooi het supernatant weg na de incubatieperiode. Breng vervolgens de kralen opnieuw op in 300 microliter complete pull-down wasbuffer.

Na het toevoegen van natriumchloride, breng 300 microliter van de cellysaat over in een microfugebuis gevuld met 300 microliter kralen. Laat vervolgens het mengsel een uur op de nutating mixer staan bij kamertemperatuur. Breng na een uur de buis op de magneet gedurende vijf minuten.

Gooi het supernatant weg na de incubatieperiode. Voeg vervolgens 300 microliter ijskoude complete pull-down wasbuffer toe aan de kralen. Nadat de buffer is toegevoegd, vortex de kralen gedurende 15 seconden bij kamertemperatuur.

Plaats vervolgens de buis gedurende vijf minuten op de magneet. Gooi het supernatant weg na de incubatieperiode. Los vervolgens de kralen op in 100 microliter nuclease-vrij water en bewaar op ijs.

Isoleer het totale RNA van de kralen. Los vervolgens het geïsoleerde RNA op in 25 microliter nuclease-vrij water. Meet vervolgens de concentratie van RNA in de spectrofotometer.

Bereid tenslotte de werkoplossing van RNA voor op 50 nanogram per microliter. Gebruik vervolgens 50 nanogram van de totale geïsoleerde RNA om complementair DNA te synthetiseren volgens de instructies van de fabrikant. Voeg vervolgens oligo-primers toe tot een eindvolume van 20 microliter.

Plaats