Name: Membraan remodelleren van gigantische blaasjes in reactie op gelokaliseerde Calcium Ion verlopen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Ontdek een contactloze techniek voor micromanipulatie van gigantische lipidenvesikels met behulp van gelokaliseerde calciumionengradiënten. Deze methode maakt directe visualisatie van membraanremodellering mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. bereiding van lipide-kleine blaasjes
<ol><li>Bereid een oplossing van lipiden SPE/DOPS/ATTO488-DOPE in chloroform met een massa mengverhouding van 79/20/1.The definitieve concentratie van lipiden in chloroform is 1 mg/mL en de definitieve massa is 0,6 mg (meestal minder dan 1 mg). Gebruik wegwerp ronde onderkant glazen flesjes (ronde onderkant glazen buizen, 10 x 75 mm) bij de voorbereiding van de lipide oplossing zonder een vooraf schoonmaak stap.<ol>
<li>Vul in en spoel het glas spuiten (25 µL) met chloroform minstens 5 keer vóór gebruik. In te vullen en spoel de injectiespuit glazen minstens 5 keer, 3-4 mL chloroform volstaat. Let op: Wanneer behandeling van chloroform, gebruiken glas spuiten en uitvoeren van alle procedures in een zuurkast terwijl het dragen van geschikte handschoenen en beschermende brillen te allen tijde. Gebruik geen plastic flacons, spuiten, of pipetten bij het verwerken van chloroform.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wikkel de glazen ampul met het lipide-mengsel met bladmetaal te beschermen de inhoud tegen omgevingslicht en damp het oplosmiddel in een rotatieverdamper drooggedampt gedurende 3 uur te verwijderen van de chloroform, met de druk 7 kPa vacuüm bij 80 t/min te bereiken. Een droge lipide-film wordt gevormd aan de onderkant van de glazen ampul na verdamping (figuur 2A). Opmerking: Meerdere malen schaalvergroting en het gebruik van grotere hoeveelheden van lipiden kunnen duren langer roterende verdamping om volledige verwijdering van chloroform.</li>
	<li>Voeg langzaam 600 µL van fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS)-bufferoplossing (pH 7,8, zonder verdunning) op de top van de gedroogde lipide-film. Na de toevoeging van de buffer, voeg voorzichtig 6 µL glycerol ter bescherming van het monster van volledige uitdroging tijdens de GUV-MLV vorming stappen (het bereiken van een eindconcentratie van 1 wt % glycerol)36. Het zegel van de glazen ampul met parafilm en dekking bladmetaal om te beschermen tegen omgevingslicht. Bewaar in de koelkast bij 4 ° C's nachts. Opmerking: De PBS-bufferoplossing bestaat uit 0.151 g van Trizma base, 1.592 g K3PO4, 1.021 g van KH2PO4, 0.062 g van MgSO4 ·7H2O en 0.0465 g van EDTA in 250 mL gezuiverd water. De oplossing bij 4 ° C worden opgeslagen, en warm tot kamertemperatuur voorafgaand aan gebruik. Een equivalente hoeveelheid 10 mM HEPES-buffer kan worden gebruikt in plaats van PBS oplossing. De HEPES-buffer-oplossing is bereid door verdunning van een 1 M HEPES-stockoplossing met gezuiverd water.</li>
	<li>De volgende dag, bewerk ultrasone trillingen ten van de glazen ampul met de oplossing voor 1 min met behulp van een bad met ultrasone trillingen bij kamertemperatuur. Verwijder de parafilm en Pipetteer tot een visueel uniforme oplossing van lipide-kleine blaasjes ontstaat (figuur 2B). Aliquot 30 µL van de verkregen kleine lipide vesikel oplossing in individuele 0,5 mL plastic buizen. Houd deze voorraad aliquots bij-18 ° C voor een maximum van 6 maanden. Opmerking: Als de kleine lipide vesikel oplossing is visueel niet uniform, vortex de oplossing 4 keer voor 1-2 s met behulp van een vortex-mixer op maximale snelheid.</li>
</ol>2. voorbereiding van GUV-MLV complexen
<ol><li>Ontdooien op kamertemperatuur een plastic buis met een aliquoot gedeelte van de bevroren ophanging van lipide-kleine blaasjes. Vortex de buis 4 keer voor 1-2 s met behulp van een vortex-mixer op maximale snelheid.</li>
	<li>Plaats 5 µL van de kleine lipide vesikel vering op het oppervlak van een glas cover slip (24 x 60 mm) vormen een kleine ronde druppel. Gebruik een glas cover slip zonder vooraf schoonmaak stappen.</li>
	<li>De glazen cover slip plaats in een vacuüm exsiccator (< 100 kPa vacuüm) voor 20 min.</li>
	<li>Opslaan van de film van de gedroogde lipide bij kamertemperatuur gedurende 4 minuten, dan langzaam Pipeteer 50 µL van 10 mM HEPES-buffer op de top van de droge lipide-film voor rehydratie. Wacht 5 min om vooraf de GUV-MLV-complexen (figuur 2C).</li>
	<li>Centreren van een glas cover slip op het podium van de Microscoop, dan Pipetteer 300 µL van HEPES-buffer op het en het midden van de druppel boven de doelstelling (figuur 3B).</li>
	<li>Breng de 50 µL van de pre-gevormde GUV-MLV-oplossing in de HEPES-oplossing (300 µL). 25 min wachten dat dunbevolkte gevormde GUV-MLV complexen stevig vasthouden aan het oppervlak van het glas cover slip (figuur 2D). Opmerking: Soms de GUV-MLV-complexen geen uitmaken op de glazen cover slip en in plaats daarvan lipide patches of alleen MLVs in acht worden genomen. Dit kan worden verklaard door toevallige schudden van het monster tijdens stappen 2.4 of 2.6, of talrijke bevriezen-ontdooien cycli van de kleine vesikel-ophanging. Herhaal stap 2.1-2.6 of gebruiken van vers bereide lipide-stockoplossing (stap 1.1) te verkrijgen de GUV-MLV-complexen.</li>
</ol>3. micropipet voorbereiding en Microinjection
<ol><li>Rond de randen van de haarvaten borosilicaatglas zachtjes doordat het capillair eindigt in de vlam van een kaars om te voorkomen dat de micropipet wordt gebroken terwijl aan de micropipet houder kunt koppelen.</li>
	<li>Trek ten minste 3 glazen capillairen met behulp van een automatische laser trekker met behulp van het programma set: warmte = 400, Fil = 4, Vel = 50, Del = 225, Pul =; Warmte = 400, Fil = 4, Vel = 60, Del = 150, Pul = 120. De programma-set moet worden ingevoerd met de eerste waarde van Pul leeg gelaten. Met behulp van borosilicaatglas haarvaten van inwendige diameter (I.D.) 1.00 mm en buitendiameter (OD) 0.78 mm resulteert in een micropipet met de opening van een tip van ongeveer 0,3 µm in diameter.</li>
	<li>Back-fill elke micropipet met 8 µL van 5 mM CaCl2 oplossing in HEPES-buffer (10 mM) met behulp van een microloader. Filtreer de CaCl2 oplossing met behulp van een 0,2-0,5 µm filter van de spuit vóór gebruik om verstopping van het uiteinde van de pipet. Opmerking: Zorg ervoor dat de CaCl2 volledig is opgelost in de HEPES-buffer-oplossing, die ook wordt gebruikt voor stappen 2.4-2.6.</li>
	<li>Sluit de houder van een micropipet aan een micromanipulator. Monteer de micropipet in de micropipet houder strak. Sluit de inspuitpomp en capillaire houder met behulp van de buis van de levering.</li>
	<li>Start de inspuitpomp. Pas de instellingen op de inspuitpomp aan 20 hPa (de druk van de injectie) en een 5 hPa compensatie druk, ingesteld op automatische modus. De injectie pomp worden onderbroken totdat de micropipet klaar voor de microinjection is.</li>
	<li>Stel de Microscoop op helderveld modus. Configureren voor differentiële interferentie contrast (DIC). 63 X of 100 X hoog nb (1.3) doelstellingen gebruiken om de optimale membraan rand oplossing te bereiken.</li>
	<li>Gebruik de grof micromanipulator om de positie van de micropipet boven de druppel met de GUV-MLV-complexen. Zoek het topje van de micropipet boven de doelstelling.</li>
	<li>Het concentreren van de Microscoop op het middelpunt van het complex GUV-MLV en vervolgens ongeveer 50 µm boven de GUV heroriënteren. De grof modus van de micromanipulator gebruiken om voorzichtig de micropipet in beeld.</li>
	<li>De micromanipulator naar de fijne modus schakelen. Langzaam heroriënteren naar de oppervlakte GUV terwijl het vertalen van het micropipet uiteinde naar beneden en het houden van de tip in focus. Plaats de micropipet tip ongeveer 20 µm van het GUV-oppervlak. Als het uiteinde van de micropipet is gebroken als gevolg van toevallige contacten met de glazen cover slip (voorbeeld in figuur 5B), vervangen onmiddellijk om te voorkomen dat geen onnodige calcium ion introductie in de bulk van de monsteroplossing.</li>
</ol>4. vorming en vertaling van MTPs met behulp van de Ion-bron van Calcium
<ol><li>Zet de Microscoop in fluorescentie modus. Instellen van dichroics te wekken op 488 nm en detecteren de uitstoot op 505-550 nm.</li>
	<li>Zet de inspuitpomp en start de calcium ion injectie. Gebruik de fijne wijze van de micromanipulator, en langzaam aanpak de GUV met het topje van de micropipet. Plaats het uiteinde van de micropipet op een afstand van 3 µm van het membraan oppervlak terwijl het injecteren van de CaCl2 oplossing van de micropipet om MTPs te vormen (Figuur 4).</li>
	<li>Voor het vertalen van de MTPs langs het oppervlak van de GUV, langzaam de pipet tip (met een snelheid van 0,1-0,3 µm/s) rond de GUV oppervlakte met behulp van de fijne micromanipulator (Figuur 6). Ongeveer dezelfde afstand (3 µm) tussen de GUV oppervlak en de micropipet tip handhaven terwijl de calcium ion injectie. Opmerking: Bij hoge vertaaltarieven van de micropipet tip (boven de 0,7 µm/s), de MTPs zal niet migreren in sync met de micropipet. In plaats daarvan, zal zij verstrooien en verkorten, terwijl nieuwe MTPs zal worden gevormd op de nieuwe locatie van de micropipet tip (Figuur 7).</li>
	<li>Stop de microinjection, uitschakelen van de inspuitpomp en verplaatsen van de micropipet uit de buurt van het oppervlak GUV.</li>
</ol>

<ol><li>Monteith, G. R., McAndrew, D., Faddy, H. M., Roberts-Thomson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+cancer%3A+Targeting+Ca2%2B+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Calcium and cancer: Targeting Ca2+ transport.</a> Nature Reviews Cancer. 7 (7), 519-530 (2007).</li>
<li>Meldolesi, J., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endoplasmic+reticulum+Ca2%2B+store%3A+A+view+from+the+lumen%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Science%22%5BJournal%5D)">The endoplasmic reticulum Ca2+ store: A view from the lumen.</a> Trends in Biochemical Science. 23 (1), 10-14 (1998).</li>
<li>Bygrave, F. L., Benedetti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+the+concentration+of+calcium+ions+in+the+endoplasmic+reticulum%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">What is the concentration of calcium ions in the endoplasmic reticulum?</a> Cell Calcium. 19 (6), 547-551 (1996).</li>
<li>Mogami, H., Tepikin, A. V., Petersen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Termination+of+cytosolic+Ca2%2B+signals%3A+Ca2%2B+reuptake+into+intracellular+stores+is+regulated+by+the+free+Ca2%2B+concentration+in+the+store+lumen%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Termination of cytosolic Ca2+ signals: Ca2+ reuptake into intracellular stores is regulated by the free Ca2+ concentration in the store lumen.</a> The EMBO Journal. 17 (2), 435-442 (1998).</li>
<li>SantoDomingo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+in+bovine+adrenal+medulla+chromaffin+cell+secretory+granules%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics in bovine adrenal medulla chromaffin cell secretory granules.</a> European Journal of Neuroscience. 28 (7), 1265-1274 (2008).</li>
<li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+in+catecholamine-containing+secretory+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics in catecholamine-containing secretory vesicles.</a> Cell Calcium. 37 (6), 555-564 (2005).</li>
<li>Bulenda, D., Gratzl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+free+Ca2%2B+in+isolated+chromaffin+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Matrix free Ca2+ in isolated chromaffin vesicles.</a> Biochemistry. 24 (26), 7760-7765 (1985).</li>
<li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromaffin-cell+stimulation+triggers+fast+millimolar+mitochondrial+Ca2%2B+transients+that+modulate+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromaffin-cell stimulation triggers fast millimolar mitochondrial Ca2+ transients that modulate secretion.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 57-61 (2000).</li>
<li>Villalobos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redistribution+of+Ca2%2B+among+cytosol+and+organella+during+stimulation+of+bovine+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Redistribution of Ca2+ among cytosol and organella during stimulation of bovine chromaffin cells.</a> The FASEB Journal. 16 (3), 343-353 (2002).</li>
<li>Brown, E. M., Hofer, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+calcium+sensing+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Extracellular calcium sensing and signalling.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 4 (7), 530-538 (2003).</li>
<li>Tarafdar, P. K., Chakraborty, H., Dennison, S. M., Lentz, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine+inhibits+and+calcium+promotes+model+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine inhibits and calcium promotes model membrane fusion.</a> Biophysical Journal. 103 (9), 1880-1889 (2012).</li>
<li>Boettcher, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+view+of+calcium-induced+clustering+of+phosphatidylserine+in+mixed+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Atomic view of calcium-induced clustering of phosphatidylserine in mixed lipid bilayers.</a> Biochemistry. 50, 2264-2273 (2011).</li>
<li>Binder, H., Zschörnig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+metal+cations+on+the+phase+behavior+and+hydration+characteristics+of+phospholipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">The effect of metal cations on the phase behavior and hydration characteristics of phospholipid membranes.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 115, 39-61 (2002).</li>
<li>Sinn, C. G., Antonietti, M., Dimova, R. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0927775705007351">Binding of calcium to phosphatidylcholine-phosphatidylserine membranes.</a> Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects. 282-283, 410-419 (2006).</li>
<li>Pedersen, U. R., Leidy, C., Westh, P., Peters, G. N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+calcium+on+the+properties+of+charged+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The effect of calcium on the properties of charged phospholipid bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , 573-582 (2006).</li>
<li>Melcrova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complex+nature+of+calcium+cation+interactions+with+phospholipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">The complex nature of calcium cation interactions with phospholipid bilayers.</a> Scientific Reports. 6, 38035(2016).</li>
<li>Roux, M., Bloom, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B%2C+Mg2%2B%2C+Li%2B%2C+Na%2B%2C+and+K%2B+distributions+in+the+headgroup+region+of+binary+membranes+of+phosphatidylcholine+and+phosphatidylserine+as+seen+by+deuterium+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Ca2+, Mg2+, Li+, Na+, and K+ distributions in the headgroup region of binary membranes of phosphatidylcholine and phosphatidylserine as seen by deuterium NMR.</a> Biochemistry. 29 (30), 7077-7089 (1990).</li>
<li>Waldbillig, R. C., Robertson, J. D., McIntosh, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Images+of+divalent+cations+in+unstained+symmetric+and+asymmetric+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Act%22%5BJournal%5D)">Images of divalent cations in unstained symmetric and asymmetric lipid bilayers.</a> Biochimica et Biophysica Act. 448 (1), 1-14 (1976).</li>
<li>Kay, J. G., Koivusalo, M., Ma, X., Wohland, T., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine+dynamics+in+cellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine dynamics in cellular membranes.</a> Molecular Biology of the Cell. 23, 2198-2212 (2012).</li>
<li>Vernier, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+formation+and+phosphatidylserine+externalization+in+a+phospholipid+bilayer+at+high+transmembrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Nanopore formation and phosphatidylserine externalization in a phospholipid bilayer at high transmembrane potential.</a> Journal of the American Chemical Society. 128, 6288-6289 (2006).</li>
<li>Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Preparation+of+Giant+Unilamellar+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Rapid Preparation of Giant Unilamellar Vesicles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (21), 11443-11447 (1996).</li>
<li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Giant+Vesicles%3A+Preparations+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">Giant Vesicles: Preparations and Applications.</a> ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).</li>
<li>Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+Transmembrane+Protein%2C+the+Voltage-gated+Ion+Channel%2C+KvAP%2C+into+Giant+Unilamellar+Vesicles+for+Microscopy+and+Patch+Clamp+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a Transmembrane Protein, the Voltage-gated Ion Channel, KvAP, into Giant Unilamellar Vesicles for Microscopy and Patch Clamp Studies.</a> Journal of Visualized Experiments. (95), e52281(2015).</li>
<li>Khalifat, N., Puff, N., Bonneau, S., Fournier, J. B., Angelova, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+deformation+under+local+pH+gradient%3A+mimicking+mitochondrial+cristae+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Membrane deformation under local pH gradient: mimicking mitochondrial cristae dynamics.</a> Biophysical Journal. 95, 4924-4933 (2008).</li>
<li>Ali Doosti, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Tubulation+in+Lipid+Vesicles+Triggered+by+the+Local+Application+of+Calcium+Ions%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Membrane Tubulation in Lipid Vesicles Triggered by the Local Application of Calcium Ions.</a> Langmuir. 33 (41), 11010-11017 (2017).</li>
<li>Barber, M. A. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/pdf/30071878.pdf">A Technic for the Inoculation of Bacteria and Other Substances into Living Cells.</a> The Journal of Infectious Diseases. 8 (3), 348-360 (1911).</li>
<li>Taylor, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+accurately+controllable+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An accurately controllable micropipette.</a> Science. 1329, 617-618 (1920).</li>
<li>Jesorka, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+phospholipid+vesicle-nanotube+networks+and+transport+of+molecules+therein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of phospholipid vesicle-nanotube networks and transport of molecules therein.</a> Nature Protocols. 6 (6), 791-805 (2011).</li>
<li>Lobovkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tweezer+action+by+self-tightening+knots+in+surfactant+nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Mechanical tweezer action by self-tightening knots in surfactant nanotubes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 7949-7953 (2004).</li>
<li>Karlsson, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/35051656">Networks of nanotubes and containers.</a> Nature. 409 (6817), 150(2001).</li>
<li>Wegrzyn, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protrusion+coarsening+and+nanotubulation+within+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Membrane protrusion coarsening and nanotubulation within giant unilamellar vesicles.</a> Journal of the American Chemical Society. 133, 18046-18049 (2011).</li>
<li>Mellander, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+modes+of+exocytosis+in+an+artificial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Two modes of exocytosis in an artificial cell.</a> Scientific Reports. 4, (2014).</li>
<li>Cans, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+Cells%3A+Unique+Insights+into+Exocytosis+Using+Liposomes+and+Lipid+Nanotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Artificial Cells: Unique Insights into Exocytosis Using Liposomes and Lipid Nanotubes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (2), 400-404 (2003).</li>
<li>Hampton, M. B., Vanags, D. M., Isabella Pörn-Ares, M., Orrenius, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+extracellular+calcium+in+phosphatidylserine+exposure+during+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Involvement of extracellular calcium in phosphatidylserine exposure during apoptosis.</a> FEBS Letters. 399 (3), 277-282 (1996).</li>
<li>Criado, M., Keller, B. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+membrane+fusion+strategy+for+single-channel+recordings+of+membranes+usually+non-accessible+to+patch-clamp+pipette+electrodes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">A membrane fusion strategy for single-channel recordings of membranes usually non-accessible to patch-clamp pipette electrodes.</a> FEBS Letters. 224, 172-176 (1987).</li>
<li>Duzgunes, N. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/bookseries/methods-in-enzymology/vol/464/suppl/C">Methods in Enzymology. Liposomes Part F.</a> Elsevier Science. , (2009).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archiv+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Orwar, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-Clamp+Detection+of+Neurotransmitters+in+Capillary+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Patch-Clamp Detection of Neurotransmitters in Capillary Electrophoresis.</a> Science. 272 (5269), 1779-1782 (1996).</li>
<li>Pevost, C., Tsai, F. C., Bassereau, P., Simunovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulling+Membrane+Nanotubes+from+Giant+Unilamellar+Vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Pulling Membrane Nanotubes from Giant Unilamellar Vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (130), e56086(2017).</li>
<li>Graber, Z. T., Shi, Z., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cations+induce+shape+remodeling+of+negatively+charged+phospholipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Chemistry+Chemical+Physics%22%5BJournal%5D)">Cations induce shape remodeling of negatively charged phospholipid membranes.</a> Physical Chemistry Chemical Physics. 19 (23), 15285-15295 (2017).</li>
<li>Pezeshkian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+Shiga+Toxin+Clustering+on+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Mechanism of Shiga Toxin Clustering on Membranes.</a> ACS Nano. 11 (1), 314-324 (2017).</li>
<li>Angelova, M. I., Tsoneva, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+DNA+with+giant+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+and+Physics+of+Lipids%22%5BJournal%5D)">Interactions of DNA with giant liposomes.</a> Chemistry and Physics of Lipids. 101 (1), 123-137 (1999).</li>
<li>Liu, Y. G., Agudo-Canalejo, J., Grafmuller, A., Dimova, R., Lipowsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+Flexible+Nanotubes+Formed+by+Liquid-Ordered+and+Liquid-Disordered+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Patterns of Flexible Nanotubes Formed by Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Membranes.</a> ACS Nano. 10 (1), 463-474 (2016).</li>
<li>Stepanyants, N., Jeffries, G. D. M., Orwar, O., Jesorka, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radial+Sizing+of+Lipid+Nanotubes+Using+Membrane+Displacement+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Radial Sizing of Lipid Nanotubes Using Membrane Displacement Analysis.</a> Nano Letters. 12 (3), 1372-1378 (2012).</li>
<li>Billerit, C., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2011/sm/c1sm05444a#!divAbstract">Heat-induced formation of single giant unilamellar vesicles.</a> Soft Matter. (20), (2011).</li>
<li>Gauthier, N. C., Fardin, M. A., Roca-Cusachs, P., Sheetz, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporary+increase+in+plasma+membrane+tension+coordinates+the+activation+of+exocytosis+and+contraction+during+cell+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Temporary increase in plasma membrane tension coordinates the activation of exocytosis and contraction during cell spreading.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (35), 14467-14472 (2011).</li>
<li>Garten, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.pnas.org/content/114/2/328">Whole-GUV patch-clamping.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (2), 328-333 (2017).</li>
<li>Messina, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+and+Quantifying+the+Passive+Transport+of+Molecules+Through+Patch-Clamp+Suspended+Real+and+Model+Cell+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Monitoring and Quantifying the Passive Transport of Molecules Through Patch-Clamp Suspended Real and Model Cell Membranes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 126 (12), 3256(2014).</li>
</ol>

Biomimetische cel systemen kunnen voor de studie van membraan gedrag bij de blootstelling aan externe prikkels zoals ionen, eiwitten of nanodeeltjes. GUVs, wordt een dergelijk model, kunnen inspelen op veranderingen in de chemische omgeving door een aanpassing van hun vorm, waarbij vaak de vorming van buisvormige structuren en invaginations24,41,42,43 .
Dit artikel biedt een aanpak voor het genereren van MTPs in een contactloze wijze via het remodelleren van het oppervlak van de GUV na gelokaliseerde injectie van calciumionen aan het GUV-oppervlak. Het protocol beschrijft de voorbereiding van het GUV-MLV-complex, die een plasma celmembraan, evenals bootst hoe te een microinjection techniek voor het genereren van calcium ion verlopen dichtbij de GUV aan formulier MTPs oppervlakte. De meerderheid van de eerdere experimentele studies die calcium ion-membraan interacties gericht blootgesteld lipide blaasjes om bulk calcium ion concentratie14,17. Afhankelijk van de experimentele omstandigheden, zo'n bulk blootstelling kan leiden tot een reactie van de verschillende membraan met buisvormige uitsteeksels gevormd25.
De vorming van de GUV-MLV-complexen is vrij eenvoudig en vereist alleen standaard laboratoriumapparatuur, zoals een roterende verdamper, ultrasoonbad en vacuüm exsiccator. Toch zijn er verschillende kritische stappen te overwegen tijdens de voorbereiding van het vesikel. Het is belangrijk om ervoor te zorgen dat de uitdroging van de blaasjes voltooid (tijdens stap 2.3 van het protocol is) en een droge circulaire lipide-film met slechts een kleine hoeveelheid zout kristallen op het oppervlak van het glas cover slip wordt gevormd. Tijdens het experiment, zorgvuldige behandeling van het vesikel-oplossing, met behulp van de stockoplossing van het verse lipide in chloroform, evenals verse HEPES-buffer, is essentieel voor succesvolle voorbereiding van de GUV-MLV-complexen. Bovendien, veilige gehechtheid van het GUV-MLV-complex aan de glazen cover slip oppervlak is cruciaal voor micromanipulation en microinjection. Om te bevestigen voldoende hechting van de GUV-MLV complex, de micropipet (zonder injectie stroom) kan worden gebruikt om Duw voorzichtig tegen de GUV-oppervlak. Een stevig zelfklevend blaasje zal niet glijden langs het oppervlak na direct fysiek contact. Omdat de experimenten zijn uitgevoerd in een open buffer druppel, die kan worden ondervraagd voor enkele uren, moet rekening worden gehouden met verdamping. Verdamping van de buffer druppel zal het veranderen van de osmotische voorwaarden, die kon beïnvloeden en destabiliseren de blaasjes. Om te herstellen osmotische voorwaarden, weer periodieke toevoeging van zuiver water aan het monster om te herstellen van de oorspronkelijke volume in het systeem homeostase.
Als u de lipiden membraan samenstelling wijzigt, is het van cruciaal belang dat de blaasjes worden geproduceerd in de vorm van een GUV-MLV-complex, omdat de MLV zorgt voor de overdracht van het lipide-materiaal naar de GUV tijdens het membraan hervormen. Eerdere studies hebben aangetoond dat de bestanddelen van het mengsel van de SPE te vervangen door zuivere lipiden, of het toevoegen van 5-30% van cholesterol, ook GUV-MLV complexvorming28,44 voorziet. De meerderheid van de voorbereide GUVs zijn unilamellar45.
Bovendien, bij het testen van andere divalente kationen, zoals magnesium ionen, de vorming van de MTPs zwaar afhankelijk van de aanwezigheid van negatief geladen DOPS in het lipide-mengsel. Zonder DOPS vormen de MTPs geen in de blaasjes beschreven in dit protocol. Ook monovalent kationen, zoals kalium en natrium, niet leiden tot de vorming van MTPs, zelfs in DOPS-bevattende blaasjes25.
Naast de kritische stappen wat betreft voorbereiding en manipulatie van de GUVs zijn er verschillende belangrijke factoren te overwegen tijdens de procedure microinjection. De succesvolle microinjection van calciumionen is sterk afhankelijk van goed functionerende glas micropipetten, die bereid zijn op de dag van het experiment. Er zijn verschillende factoren die kunnen zorgen dat de micropipet kuren te vertonen. Een gemeenschappelijke reden is een verstopte tip-opening. Lipide-kleine deeltjes, die zijn bijproducten van de voorbereiding van het vesikel zijn verspreid in de oplossing en hebben de neiging vast te houden aan het uiteinde van de micropipet, waardoor het genereren van een verstopping. Reinigen van de pipet tip gebeurt best door omhoog tillen van het vesikel oplossing en brengen het terug dichtbij de GUV-oppervlak. Het gebruik van de functie van de blow-out van de microinjection pomp moet worden vermeden omdat het resulteert in enorme injectie van calciumionen in de oplossing van de bulk. Bovendien, kleine luchtbellen binnen de micropipet in de val gelokt voorkomen juiste microinjection, in dat geval de micropipet moet worden vervangen door een nieuwe. Tip breuk kan aanzienlijk worden geminimaliseerd door het plaatsen van de experimentele opstelling op een trillingsdemping tabel om te minimaliseren van tip oscillaties.
Bovendien moet zorg worden genomen bij het kiezen van een observatie-schema aan photobleaching minimaliseren terwijl het verkrijgen van de beste tijd-opgelost-beelden. Breed-gebied laser-geïnduceerde fluorescentie microscopie werd gebruikt in dit protocol, omdat het voorziet in een relatief hoge beeldsnelheid voor acquisitie op een diepte van objectieve beperkt sonde. Bovendien zorgt gebruik van omgekeerde microscopie voor gelijktijdige microinjection en observatie van de lipide blaasjes en MTPs.
Een van de belangrijkste beperkingen van de onderhavige methode is de eis van uitgebreide handmatige werk en voldoende micromanipulation vaardigheden. Omdat de complexen worden gevormd door een spontane zwelling proces, kan niet de grootte van de GUVs en de MLVs worden gecontroleerd. Dit protocol staat bovendien geen voor controle van de spanning van de membraan van de bereid GUV-MLV-complexen, die wellicht noodzakelijk om te verzamelen aanvullende gegevens met betrekking tot het remodelleren van de membraan. De GUVs zijn verbonden met de MLVs met het laatste gegevensverstrekkende lipide-materiaal voor de aanzienlijke groei van de MTPs tot op zekere hoogte dat zou onmogelijk zijn om uitsluitend gebruik te maken van het membraan van de GUVs beschikbaar. De MLVs ook bijdragen aan het verlagen van de laterale oppervlaktespanning variaties binnen de GUV-MLV complexe44, die de pogingen om de spanning van het vesikel regelen met behulp van micropipet streven zou bemoeilijken. Dit GUV-MLV-gebaseerde model biedt een lagere spanning die beter de regimes van de spanning in cellulaire membraan structuren verbonden met membraan stuwmeren, zoals membraan plooien en invaginations46gevonden bootst. Op hetzelfde moment, kan de micropipet aspiratie techniek met succes worden toegepast om te bepalen van de spanning van de membraan in één GUVs. Bijvoorbeeld verstrekt het werk van Graber et al. details over de vorming van de tubulaire invaginations van de membraan in één GUVs bij binding van calciumionen aan het membraan op bulk voorwaarden gevarieerde spanning regimes €40. Tot slot, de vergelijking van het membraan gedrag op zowel lokale als bulk blootstelling aan calcium vereist betere controle van de membraan hechting aan het oppervlak, dat buiten het bestek van dit protocol valt.
Samenvattend, zorgt de voorgestelde techniek voor contactloze membraan remodelleren en vorming van MTPs bij gelokaliseerde stimulatie met calciumionen. Toekomstige toepassingen van deze methode center op de vertaling van synthetische vesikel systemen naar inheemse biologische membranen, zoals de cel blebs. De voorgestelde methode kan dan worden samengebouwd met andere eencellige ondervraging regelingen, zoals patch-clamp of micro-elektrode amperometry, gecombineerd met gelokaliseerde verwarming strategieën31,47,48. Testen van het effect van andere ionen of moleculen is eenvoudig en gaat gewoon de calciumionen te vervangen met de moleculen van belang. Bovendien, complexe synthetische lipide blaasjes kunnen worden geproduceerd door membraan functionalization met transmembraan eiwitten, die ons begrip van de biofysica van cel omvormen en celmembraan dynamiek gekoppeld sensing van lokale kan uitbreiden chemische verlopen. Laatste, maar daarom niet minder belangrijk, contactloze stimulatie van het lipide membraan kan ook vertaald worden naar polymere zachte materie systemen, het aanbieden van een basis voor een nieuwe contactloze manipulatie-platform.

De rol van calciumionen binnen biologische processen, specifiek hun betrokkenheid bij signalering, celdeling en membraan fusion, is de focus van vele studies mechanistische1. De intracellulaire cytoplasmatische calcium ion concentratie is over de volgorde van 100 nM, terwijl het calcium in organellen, zoals endoplasmatisch reticulum, secretoire blaasjes en mitochondriën, bereiken niveaus tot tientallen millimolars in concentratie. Dit leidt tot steile calcium ion concentratie verloop ordes van grootte over intracellulaire membranen2,3,4,5,6,7,8 ,9. De extracellulaire calcium ion niveau is ongeveer 2 mM en vandaar, de variaties van calcium ion concentratie treden bij zowel de extracellulaire en intracellulaire niveaus. Bovendien, de recente studies bewijzen dat ion van intracellulair calcium signalering gebeurtenissen en neuronale activiteit kan optreden onder de voorwaarden van lokale fluctuaties van extracellulaire calcium ion concentraties, het belang van gesynchroniseerd intra- en extracellulaire calcium ion variaties10.
Gericht op het begrijpen van de interactie tussen calciumionen en biologische membranen, een synthetische benadering waarbij native celmembranen worden vervangen met lipide dubbelgelaagde blaasjes met succes is uitgevoerd. Bloot blaasjes calcium ion oplossingen leidt tot veranderingen in lipide hoofd groepen en koolwaterstof keten verpakking, verhoogde membraan spanning, en vesikel aggregatie, evenals de segregatie van lipiden en membraan fase overgang11,12 ,13,14,15,16. De eigenschappen van het lipide membraan bij blootstelling aan calciumionen zijn onderzocht met behulp van dergelijke experimentele technieken als X-ray, 1H-NMR en spectroscopische of thermodynamische studies11,16, 17 , 18. in deze studies, de membraan samenstelling is vaak afgestemd om te lijken op inheemse celmembranen en bevat deze fysiologische lipiden als fosfatidylserine (PS), dunlaag (PC) en phosphatidylethanolamine (PE). PS is vooral belangrijk in kunstmatige vesikel voorbereiding want het is een essentieel onderdeel in veel cellulaire processen zoals intracellulaire membraan mensenhandel exocytose en apoptosis19,20.
De grootte van gesynthetiseerde lipide blaasjes varieert vaak van nanometer tot enkele micrometers. Verschillende vesikel preparaten, gigantische unilamellar blaasjes (GUVs), die behoren tot verschillende tot tientallen micrometers diameter, van bijzonder belang zijn vanwege hun relatief grote omvang, vertonen met de afmetingen van individuele cellen21 , 22 , 23. het beschikbaar oppervlak van de GUVs kan het effect van lokale chemische verlopen op membraan biofysische eigenschappen worden bestudeerd. Door slechts een deel van het oppervlak van de membraan op de externe prikkels bloot te leggen, kunnen de membraan dynamiek nauwer worden onderzocht. Het heeft bijvoorbeeld aangetoond dat gelokaliseerde toepassing van chemische of pH verlopen op het oppervlak van GUVs leidt tot de vorming van buisvormige uitsteeksels, die niet werden waargenomen bij bulk blootstelling24,25. De waargenomen verschillen in gedrag van de membraan bellen voor verdere ontwikkeling van de methode van single-vesikel ondervraging regelingen te krijgen sommige inzicht in de mechanismen van het remodelleren van de celmembraan.
Voortbouwend op de methoden van microinjection en micromanipulation uit de vroege jaren 190026,27, in het kader van meer recente ontwikkelingen op het gebied van single-vesikel manipulatie regelingen van de 2000s23,28 , dit artikel presenteert een aanpak in welke membraan remodelleren en vorming van membraan buisvormige uitsteeksels (MTPs) in het membraan van de GUV worden gegenereerd in reactie op lokale toepassing van calciumionen.
Onze aanpak maakt gebruik van een blaasje complex bestaande uit een GUV aangesloten op een multilamellar blaasje (MLV) als een biomimetische membraan modelsysteem (figuur 1A). De MLV is vereist als een lipide reservoir voor het complex lipide materiaal aan de GUV tijdens de blootstelling aan een calcium ion verloop opgeeft. Deze aansluiting kunt u het complex te compenseren voor de toename van de membraan spanning tijdens geïnduceerde remodelleren en vorm van de overgang van het membraan GUV lipiden voorzien MTP groei. Bovendien, de MLV vergemakkelijkt de oppervlakte immobilisatie, omdat de massa groter is vergeleken met die van de GUV. De GUV-MLV-complexen, wanneer geïmmobiliseerd op een stevige ondergrond, is eerder hebt gebruikt voor het produceren van nanotube-vesikel netwerken, polymeer-membraan interactie te bestuderen, en het nabootsen van de late stadia van exocytose29,30, 31,32,33.
Eerdere protocollen gebruikt soja polar lipide extract (SPE) om te bereiden GUV-MLV complexen28. De SPE bestaat uit een mengsel van fosfolipiden waarin PC (45,7%), PE (22,1%), phosphatidylinositol (PI, 18,4%), phosphatidic zuur (PA, 6,9%), en een mengsel van andere lipiden (6,9%). In ons protocol hierin, is het SPE-mengsel doped met 20% van de 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (natriumzout) (DOPS) om na te bootsen de innerlijke folder van de celmembraan van de plasma. Een extra 1% van ATTO 488-1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-DOPE) wordt gebruikt om de lipide dubbelgelaagde zodat toezicht op de membraan remodelleren met behulp van fluorescentie microscopie vlek. De GUVs hebben van lipide-symmetrische compositie over het dubbelgelaagde en lokaal blootgesteld aan 5 mM concentraties van de calcium chloride (CaCl2). Dergelijke experimentele omstandigheden, met een verhoogde calcium ion concentratie, nabootsen ook de bijsluiter van de buitenmembraan van apoptotic cellen, waar de PS-moleculen uitgedrukt34 zijn. De vorming van de GUV-MLV-complexen vereist het gebruik van een gemodificeerde rehydratie-uitdroging methode die oorspronkelijk is ontwikkeld door Criado en Keller35. Het blaasje voorbereiding protocol bevat de vorming van een droge lipide-laag, die vervolgens wordt gebruikt om kleine blaasjes in oplossing vormen. Deze oplossing is vervolgens gedehydrateerde en gerehydrateerd te vormen van de uiteindelijke GUV-MLV-complexen. Figuur 2A -D illustreert de belangrijkste stappen ter voorbereiding van een typische GUV-MLV-complex.
Nadat de vesikel voorbereiding is afgerond en het blaasje complex is geïmmobiliseerd op het glas-substraat, wordt de microinjection techniek gebruikt voor het leveren van kleine hoeveelheden van calciumionen aan het buitenste de bijsluiter van de GUV door middel van een open-tip glas micropipet. De stroom van calcium oplossing uit de tip genereert een gelokaliseerde calcium ion kleurovergang aan de GUV membraan oppervlak, wat leidt tot membraan remodelleren en generatie van de MTPs. De MTPs zijn weg van de bron van calcium ion georiënteerd en groeien binnen de GUV. Deze formatie MTP rechtstreeks kan worden gecontroleerd met behulp van fluorescentie microscopie en opgenomen met behulp van een digitale camera. Figuur 3 toont de experimentele opzet gebruikt voor de productie van het remodelleren van de membraan. De vorming van de MTPs (figuur 2E en Figuur 4) in dit protocol toont een contrasterende resultaat calcium ion blootstelling experimenten uitgevoerd in bulk volume voorwaarden. Omstandigheden van de bulk, de GUVs scheuren en vormen van membraan patches die zich houden aan het oppervlak van glas25kunnen worden waargenomen.
Verdere details over de vorming van de GUV-MLV-complexen, evenals de procedure voor het uitvoeren van de microinjection van calciumionen, worden uitgelegd in dit artikel. De protocollen zijn grotendeels gericht op calcium ion microinjection; Deze benadering kan echter eenvoudig worden aangepast voor gebruik bij het bestuderen van de membraan reacties als gevolg van de lokale blootstelling aan andere ionen of eiwitten. Bovendien is de samenstelling van de blaasjes kan worden afgestemd om te isoleren van de lipide onderdeel rollen in het proces van het remodelleren van het membraan. Het gepresenteerde protocol vereist geen verfijnde apparatuur voor de productie van de GUV-MLV-complexen en wordt gekenmerkt door een hoge graad van reproduceerbaarheid.

<table><tbody><tr><td>Soy bean polar lipid extract</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)</td><td>541602C</td><td>100 mg</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (sodium salt) DOPS</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, USA)</td><td>840035C</td><td>1x25 mg</td></tr><tr><td>ATTO 488- 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE)</td><td>ATTO-TEC (Germany)</td><td>AD 488-31</td><td>1 mg</td></tr><tr><td>Hamilton&nbsp;syringe, 700 series, fixed needle, 702N, volume 25&nbsp;&mu;L, needle size 22s ga (bevel tip), needle L 51&nbsp;mm (2&nbsp;in.)</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>20735&nbsp;SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Tube, culture, disposable, rimless, 10x75 mm, Borosilicate glass 250/pack</td><td>Corning Incorporated (Corning, NY 14831)</td><td>99445-10</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;CHROMASOLV&nbsp;Plus, for HPLC, &ge;99.9%, contains amylenes as stabilizer</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>650498-1L-D</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>B&uuml;chi Rotavapor R-144 Switzerland</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kalciumklorid purum torkad minimum 95% medelkornig 5-10 mm</td><td>KEBO lab (Sweden)</td><td>MA00360500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate reagent grade ACS, ISO</td><td>Sharlau Chemie S.A. (Spain)</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, SigmaUltra, minimum 99.0%</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, SigmaUltra, minimum 99.5%</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>G5516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol, for molecular biology, minimum 99%</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>T-1503 2050 g</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>P5629-500G</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate tribasic (K3PO4)</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>5886</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck (USA)</td><td>34549-100 g</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>H0887 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES solution 1&nbsp;M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>Z260282-1PAK</td><td>24x60 mm</td></tr><tr><td>Acrodisc&nbsp;syringe filters,&nbsp;PVDF membrane, diam. 13&nbsp;mm, pore size 0.2&nbsp;&mu;m</td><td>Sigma Aldrich (Missouri, USA)</td><td>631-1339&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Menzel Gl&auml;zer #1, glass cover slip</td><td>VWR (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Diaphragm vacuum pump for the desiccator</td><td>Vacuubrand (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonicate bath</td><td>Bandelin Sonolex (Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VX-100 Lab vortexer vortex mixer</td><td>Labnet International (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>488 nm laser line&nbsp;</td><td>Cobolt MLD-488 nm (Solna, Sweden)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica Microsystems&nbsp;immersion oil for microscopes</td><td>Leica (Germany)</td><td>12847995&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscopy system&nbsp;</td><td>Leica DM IRB (Wetzlar, Germany)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camera (Prosilica Ex 1920, Allied Vision)</td><td>Technologies GmbH (Thuringia, Germany)</td><td>300038</td><td></td></tr><tr><td>PatchStar Micromanipulator</td><td>Scientifica (Uckfield, UK)</td><td>612-7933</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillaries, GC100TF-10,&nbsp; 1.00mm O.D. X 0.78mm I.D.&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus U.K</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf microloader (pipette tips)</td><td>VWR (USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P-2000 CO2 laser-puller&nbsp;</td><td>Sutter Instruments (Novato, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Femtoliter automatic injection pump, Eppendorf Femtojet</td><td>Eppendorf (Germany)</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

membraan remodelleren van gigantische blaasjes in reactie op gelokaliseerde calcium ion verlopen

Membrane Remodeling of Giant Vesicles in Response to Localized Calcium Ion Gradients

In een breed scala aan fundamentele cel processen, zoals membraan mensenhandel en apoptosis, optreden celmembraan vorm overgangen gelijktijdig met lokale variaties in calcium ion concentratie. De belangrijkste moleculaire componenten die bij deze processen betrokken zijn geconstateerd; de specifieke interactie tussen calcium ion verlopen en de lipiden in het celmembraan is echter veel minder bekend, vooral vanwege de complexe aard van de biologische cellen en het moeilijk van observatie regelingen. Om deze kloof, is een synthetische benadering succesvol geïmplementeerd te onthullen het gelokaliseerde effect van calciumionen op celmembraan nabootsers. Tot oprichting van een nagebootst om te lijken op de voorwaarden binnen een cel is een severalfold probleem. Eerst, een voldoende biomimetische model met de juiste afmetingen en membraan samenstelling is vereist voor het vastleggen van de fysische eigenschappen van de cellen. Ten tweede, een micromanipulation setup is moest leveren een kleine hoeveelheid calciumionen naar de locatie van een bepaald membraan. Tot slot is een observatie-regeling vereist om te detecteren en registreren van de reactie van het lipide membraan op de externe stimulatie. Dit artikel biedt een gedetailleerde biomimetische benadering voor het bestuderen van de calcium ion-membraan interactie, waar een lipide vesikel systeem, bestaande uit een gigantische unilamellar blaasje (GUV) aangesloten op een multilamellar blaasje (MLV), wordt blootgesteld aan een gelokaliseerde calcium kleurovergang gevormd met behulp van een systeem van microinjection. De dynamiek van de Ionische invloed op het membraan werden waargenomen met behulp van fluorescentie microscopie en opgenomen op video framesnelheden. Als gevolg van de membraan stimulatie, zeer gebogen membraan buisvormige uitsteeksels (MTPs) gevormd binnen de GUV, uit de buurt van het membraan gericht. De beschreven aanpak induceert de verbouwing van het lipide membraan en MTP productie in een volledig contactloze en gecontroleerde manier. Deze benadering introduceert een middel om de adresgegevens van calcium ion-membraan interacties, bieden nieuwe wegen om te bestuderen van de mechanismen van het omvormen van de celmembraan.

In dit werk tonen we de oprichting van GUV-MLV complexen en hoe ze kunnen worden gebruikt voor het ophelderen van het effect van calcium ion verlopen op de dynamiek van de celmembraan. Oppervlakte-ingeschrevenen GUV-MLV complexen zijn vereist voor deze experimenten mogelijk te maken voor een vaste cel-sized mimic terwijl de oprichting van een ion verloop via microinjection. Het membraan GUV reageert op gelokaliseerde calcium concentratie door vorming van MTPs die gericht is weg van de bron van calcium ion. Bovendien, de MTPs kunnen worden vertaald rond de GUV contactloze wijze door het uiteinde van de micropipet rond het membraan-oppervlak te bewegen.
Een schematische illustratie van de GUV-MLV voorbereiding procedure is afgebeeld in Figuur 2. Hoewel in het voorgestelde protocol, zijn de GUV-MLV-complexen al vooraf gevormd tijdens stap 2.4 (figuur 2C), kan de vesikel oplossing overbrengen naar een andere 300 µL druppel van buffer (stap 2.6 van het protocol) de dunbevolkte gevormde GUV-MLV-complexen om te voldoende zich te houden aan het glas-substraat. Op deze manier ontstaat een geschikt complex voor micromanipulation en microinjection (figuur 2D). De GUVs bevatten soms één of meerdere prikroller lipide-blaasjes, die hebben geen invloed op de vorming van MTP, zoals weergegeven in figuur 4A. Deze GUVs produceren MTPs; de beeldvorming kan echter worden belemmerd als de prikroller blaasjes groot zijn. De meerderheid van de voorbereide GUVs (tot 75%) verschijnen hemisferische en zijn gekoppeld aan de MLVs, zoals getoond in figuur 1A. Deze blaasjes zijn de belangrijkste focus van dit protocol en zijn geschikt voor de microinjection procedure. Ongeveer 25% van de resterende GUVs verschijnen golvende (figuur 1B), die is een indicatie van een lagere membraan spanning regeling. Deze golvende blaasjes ook toestaan voor de vorming van de tubulaire uitsteeksels; zij vertonen echter verschillende kinetiek en een verschillende morfologie van het gevormde MTPs, die buiten het bestek van dit protocol25 valt. De typische diameter van de bereid blaasjes varieert tussen 2 tot 15 µm voor de MLVs, en tussen 2 tot 40 µm voor de GUVs. De optimale GUV groot voor de blootstelling aan calciumionen 5 µm is of groter.
Micropipetten werden gebruikt in singe-cel ondervraging regelingen alsmede in procedures vereisen manipulatie van synthetische GUVs voor verschillende decennia37,38. De meeste van deze toepassingen betrokken direct fysiek contact tussen de micropipet en het oppervlak van cellen of blaasjes. Voorbeelden zijn de patch-clamp techniek of het trekken van membraan aanbinden van de GUV-membraan, naast het gebouw van nanotube-vesikel netwerken23,28,39. Onlangs, micropipetten zijn ook gebruikt voor het genereren van gelokaliseerde gradiënten van ionen en moleculen rond GUVs te reconstrueren van heterogene mobiele microenvironments24,25. In het voorgestelde protocol is een goed functionerende micropipet (figuur 5A) een cruciale factor voor de vaststelling van een calcium ion kleurovergang aan de oppervlakte GUV door het vrijgeven van de oplossing binnen. Juiste positionering van de micropipet aan het oppervlak GUV en het vermijden van contact met het lipide membraan zijn essentieel voor succesvolle microinjection. De tip van micropipet wordt gehouden op een afstand van ongeveer 3 µm van het GUV-oppervlak, dat een optimale afstand voor het genereren van MTPs terwijl het nabootsen van variaties van calcium in de buurt van de celmembraan. Als het uiteinde van de micropipet is per ongeluk gebroken (figuur 5B), is een vervanging nodig is. De eerder geteste concentratie bereik van CaCl2 binnen het micropipet, dat voorziet in de vorming van MTP, is tussen 2 en 5 mM25, hetgeen overeenkomt met extracellulaire calcium concentraties. Bij concentraties lager CaCl-2 , dat wil zeggen, 1 mM, geen MTPs in acht worden genomen.
De vorming van MTPs bij de calcium-microinjection begint met de vorming van kleine membraan-invaginations, die tot MTPs op de site van de blootstelling (figuur 4B uitgroeien). De MTPs blijven groeien, zolang de GUV membraan blijft blootgesteld aan de calciumionen. Ze fluctueren en wijs weg van de bron van calcium ion (figuur 4C, aanvullende film 1). Wanneer de levering van calcium ion wordt beëindigd, de MTPs verspreid over de GUV-oppervlak, waardoor het moeilijk is om af te sluiten of de MTPs blijven of uiteindelijk verdwijnen.
De vorming van MTPs kan worden verklaard door de gelokaliseerde calcium ion binding met het blootgestelde buitenste bijsluiter van het GUV-membraan en triggering spontane kromming (m), die rechtstreeks is verbonden met de vorming van spontane spanning σ = 2κm2 (Κ is de buigende stijfheid), dat induceren buigen van het membraan en de vorming van innerlijke MTPs. Eerdere rapporten hebben aangetoond dat de vervorming van het membraan worden kan verklaard door condensatie en/of clustering van de negatief geladen lipiden op de binding van de calciumionen aan het membraan, wat resulteert in negatieve spontane kromming40. U kunt ook neutraliseert de sterke binding van Ca2 + op het oppervlak van de negatief geladen dubbelgelaagde de oppervlakte ladingsdichtheid van de blootgestelde lipide dubbelgelaagde bijsluiter. Dit leidt tot de ladingsdichtheid verschil over de dubbelgelaagde, wat resulteert in niet-nulzijnde spontane kromming, voldoende om te buigen van membraan25.
De waargenomen vorming van MTPs toont een gevoeligheid van lipide membranen aan calciumionen en biedt een nieuwe contactloze benadering voor het produceren van membraan buisvormige structuren. Het ophelderen van de oorsprong van dit membraan-tubulation kan van belang zijn voor het inzicht in de dynamiek van de membraan shape overgang tijdens diverse functies van de cel en de cel omvormen en kan nuttig zijn voor het verkrijgen van inzicht in lipide organisatie binnen de cel membranen.
De waargenomen MTPs zijn altijd gegenereerd op de site op het membraan die calcium ion blootstelling ondergaat. Door te kiezen voor de locatie van de micropipet tip, is het dus mogelijk om het gebied van het oppervlak van de GUV voor de groei van het uitsteeksel te definiëren. Volgende, als de micropipet langzaam (0,1-0,3 µm/s) verplaatst de GUV-oppervlak, met behoud van de afstand van het membraan, de MTPs zijn vertaald in tandem met de micropipet. Figuur 6 en de corresponderende aanvullende Movie 2 demonstreren dergelijke migratie van de MTPs rond de GUV-oppervlak. Dit proces is waarschijnlijk vergezeld van de vorming van nieuwe MTPs op continue calcium ion injectie25. Bij hoge vertaaltarieven (boven de 0,7 µm/s), de MTPs niet in staat zijn te volgen van de micropipet-tip. In plaats daarvan nieuwe uitsteeksels ontstaan op de nieuwe locatie van de micropipet tip (Figuur 7).
De waargenomen contactloze calcium ion-geleide vertaling van MTPs rond de GUV oppervlak kan verder ons begrip van de drijvende achter de dynamiek van membraan buisvormige structuren binnen cellen krachten. Bovendien biedt deze aanpak een nieuwe contactloze modus voor de controle op het vervoer van materiaal in zachte materie systemen met behulp van chemische verlopen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig1.jpg"> Figuur 1 : Representatief fluorescent microscopie beelden van GUV-MLV complexen geïmmobiliseerd op het oppervlak van een glas cover slip. (A). voorbeeld van een sferische GUV. De GUV wordt weergegeven in de vorm van een halve bol aan de MLV gekoppeld. (B). voorbeeld van een golvende GUV. De zwarte pijlen geven de vervormde gebieden van het membraan. De beelden zijn verbeterd en ondersteboven om de visualisatie van de fluorescently geëtiketteerde GUV-membranen. De schaal staaf vertegenwoordigt 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig2.jpg"> Figuur 2 : Schematische illustraties van de GUV-MLV-voorbereiding en de regelingen van microinjection. (A). een droge lipide-laag aan de onderkant van de glazen ampul als gevolg van de roterende verdamping van chloroform uit de lipide-oplossing wordt gevormd. (B). de gerehydrateerd lipide-laag is sonicated, en lipide-kleine blaasjes worden gevormd. (C). een kleine druppel van de oplossing van het vesikel (5 µL) is geplaatst op het oppervlak van een glas cover slip en overgebracht in een exsiccator voor 20 min tot de lipide-oplossing uitdrogen en vormen een droge lipide-film (deze stap wordt niet weergegeven). De droge lipide-film met 50 µL van de bufferoplossing vochtinbrengende produceert de pre-gevormde GUV-MLV-complexen. (D). de overdracht van de pre-gevormde complexen tot een grotere hoeveelheid buffer resulteert in de vorming van dun gescheiden GUV-MLVs gekoppeld aan het oppervlak van het glas cover slip. (E). de micropipet in de buurt van het oppervlak van de GUV positionering en het vrijgeven van de calciumionen triggers de vorming van MTPs. De illustraties worden niet getekend op schaal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig3.jpg"> Figuur 3 : Experimentele opstelling voor de microinjection van calciumionen. (A). de onderdelen van de experimentele opstelling vereist voor het genereren van de MTPs in de GUVs. (B). Details van de opstelling microinjection. De glazen dekglaasje aan met de oplossing van de GUV-MLV-complexen in het werkgebied van de Microscoop geplaatst. De hoek tussen de micropipet en het oppervlak van het glas cover slip is 30° (gemarkeerd in wit). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig4.jpg"> Figuur 4 : Vorming van MTPs bij de microinjection van de calciumionen aan het oppervlak van de GUV. (A). The GUV-MLV complex voorafgaand aan blootstelling aan een calcium ion verloop. De pijl geeft een lipide blaasje binnen de GUV in de val gelokt en niet verhindert dat de waarneming van de MTPs. (B). Kleine MTPs worden gevormd bij de microinjection van calciumionen (5 mM concentratie voor CaCl2 in de micropipet). (C). groei van de MTPs bij voortdurende blootstelling aan calciumionen. De fluorescentie-beelden worden verbeterd en omgekeerd voor visualisatie doeleinden. De schaal staaf vertegenwoordigt 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig5.jpg"> Figuur 5 : Glazen micropipetten gebruikt voor calcium ion microinjection. (A). een voorbeeld van een goed functionerende micropipet. (B). een voorbeeld van een micropipet met een gebroken tip (het beschadigde gedeelte wordt aangeduid met een zwarte pijl). Beide beelden zijn verbeterd en ondersteboven voor betere visualisatie. De schaal staaf vertegenwoordigt 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig6.jpg"> Figuur 6 : Calcium ion-geleide vertaling van de MTPs rond het oppervlak van de GUV. (A). The MTPs aan het oppervlak van de GUV op microinjection van 5 mM CaCl2 oplossing worden gevormd. (B-C). Vertaling van de micropipet tip (0,2-0,3 μm/s) rond het membraan oppervlak activeert het verkeer van de MTPs in de richting van de ion-bron van calcium. De zwarte pijlen wijzen op de richting van de beweging van de micropipet. De beelden worden verbeterd en omgekeerd om membraan visualisatie. De schaal staaf vertegenwoordigt 5 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57789/57789fig7.jpg"> Figuur 7 : MTPs van de micropipet tip tempo hoge vertaal. (A). The MTPs aan het oppervlak van de GUV op de microinjection van de 5 mM CaCl2 oplossing (witte lijn) worden gevormd. (B-C). Een hoge vertaal-tarief van de micropipet rond de GUV oppervlak (1 micrometer/s) resulteert in de vorming van nieuwe MTPs op de nieuwe locatie van de micropipet tip (magenta lijn), evenals de verstrooiing van de eerder gevormde MTPs (witte lijn). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/57789fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57789/57789mov1.jpg"> Aanvullende film 1: Vorming van MTPs in GUV bij gelokaliseerde blootstelling aan de certificeringsinstantie 2 + verloop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/Lobovkina_Movie_1.avi" target="_blank">Klik hier om te downloaden van deze film.</a> 
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57789/57789mov2.jpg"> Aanvullende film 2: Calcium ion-geleide migratie rond het oppervlak GUV MTP.   <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57789/Lobovkina_Movie_2.avi" target="_blank">Klik hier om te downloaden van deze film.</a>

Presenteren we een techniek voor contactloze micromanipulation van blaasjes, met behulp van de gelokaliseerde calcium ion verlopen. Microinjection van een calcium Ionenoplossing, in de nabijheid van een gigantische lipide blaasje, is gebruikt om het remodelleren van het lipide membraan, wat resulteert in de productie van membraan buisvormige uitsteeksels.

Membraan remodelleren van gigantische blaasjes in reactie op gelokaliseerde Calcium Ion verlopen

In a wide variety of fundamental cell processes, such as membrane trafficking and apoptosis, cell membrane shape transitions occur concurrently with local ...

We presenteren een techniek voor manipulatie van gigantische blaasjes met behulp van gelokaliseerde calcium-ionen gradienten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de volledig contactloze stimulatie van het oppervlak van het blaasje en de directe visualisatie van de lipide membraan remodellering bij interactie met calcium-ionen. Onze aanpak introduceert een manier om de details van calcium-ionen membraaninteracties aan te pakken, en biedt nieuwe mogelijkheden om de mechanismen van celmembraan hermodellering te bestuderen bij veranderingen in de cel micro-omgeving.Om deze procedure te beginnen, bereid een oplossing van lipiden in chloroform. De uiteindelijke concentratie van lipiden in chloroform is één milligram per milliliter, en de uiteindelijke massa is 0,6 milligram. Wikkel het glazen flacon met de lipidenmengsel in metaalfolie om de inhoud te beschermen tegen omgevingslicht.Plaats de met metaalfolie omwikkelde monsterviaal in een glazen beker. Om het chloroform te verwijderen, laat het oplosmiddel gedurende drie uur verdampen in een roterende verdamper met een druk van zeven kilopascals vacuüm bij 80 rpm. Een droge lipidefilm wordt gevormd op de bodem van de glazen flacon na verdamping.Voeg langzaam 600 microliters fosfaatgebufferde zoutoplossing toe bovenop de gedroogde lipidefilm. Voeg na het toevoegen van de buffer voorzichtig zes microliters glycerol toe om het monster te beschermen tegen volledige uitdroging tijdens de vorming van een groot unilamelair blaasje verbonden aan een multilamellair blaasje, of GUV-MLV. Sluit de glazen flacon met Parafilm.En bedek met metaalfolie om te beschermen tegen omgevingslicht. Bewaar de flacon een nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag, soniceer de glazen flacon met de oplossing gedurende één minuut met behulp van een ultrasone bad bij kamertemperatuur.Verwijder de Parafilm en pipetteer tot een visueel uniforme oplossing van kleine lipideblaasjes is gevormd. Pipetteer 30 microliters van de verkregen kleine lipideblaasje oplossing in afzonderlijke 0,5 milliliter plastic buisjes. Ontdooi een plastic buisje met een aliquot van de bevroren suspensie van kleine lipideblaasjes bij kamertemperatuur.Vortex de buis vier keer gedurende één tot twee seconden met behulp van een vortex mixer op maximale snelheid. Plaats vijf microliters van de kleine lipideblaasjes suspensie op het oppervlak van een glazen dekglas om een kleine, ronde druppel te vormen. Gebruik een glazen dekglas zonder enige voorafgaande reinigingsstappen.Plaats nu het glazen dekglas in een vacuümdroger gedurende 20 minuten. Bewaar de gedroogde lipidefilm bij kamertemperatuur gedurende vier minuten. Pipetteer vervolgens langzaam 50 microliters van 10 millimolair HEPES-buffer op de droge lipidefilm voor rehydratatie.Wacht vijf minuten om de GUV-MLV complexen te vormen. Centreer een glazen dekglas op de stage van de microscoop. Pipetteer vervolgens 300 microliters HEPES-buffer erop en positioneer het centrum van de druppel boven het objectief.Breng de 50 microliters van de voorgevormde GUV-MLV oplossing over in de HEPES oplossing. Wacht 25 minuten om slechts gevormde GUV-MLV complexen stevig te laten hechten aan het oppervlak van het glazen dekglas. Rond de randen van de borosilicaat glas capillairen af door de capillaire uiteinden voorzichtig in de vlam van een kaars te plaatsen om te voorkomen dat de micropipet kapot gaat terwijl deze aan de micropipet houder wordt bevestigd.Trek ten minste drie glas capillairen met behulp van een automatische laser trekker. Gebruik de borosilicaat glas capillairen die in de tekst worden genoemd om een micropipet te verkrijgen met een tipopening van ongeveer 0,3 micrometer in diameter. Om verstopping van de pipettip te voorkomen, filter een vijf millimolair calciumchloride oplossing in HEPES buffer oplossing met behulp van een 0,2 tot 0,5 micron spuitfilter voor gebruik.Vervolgens vult u elke micropipet achterwaarts met acht microliters van de calciumchloride oplossing met behulp van een Microloader. Verbind een micropipet houder met een micromanipulator. Monteer de micropipet stevig in de micropipet houder.Verbind vervolgens de injectiepomp en capillair houder met behulp van de toevoerslang. Na het starten van de injectiepomp, pas de instellingen op de injectiepomp aan op een injectiedruk van 20 hectopascal. Stel ook een compensatiedruk van vijf hectopascal in.Stel de microscoop in op helderveldmodus. Configureer deze voor differentiële interferentiecontrastering. Gebruik de grove micromanipulator om de micropipet boven de druppel met de GUV-MLV complexen te positioneren.Loceer de tip van de micropipet boven het objectief en breng de pipet naar de druppel met behulp van de grove micromanipulator. Stel de microscoop in op fluorescentiemodus. Positioneer de micropipettip op een afstand van drie micrometer van het membraanoppervlak terwijl de calciumchloride oplossing uit de micropipet wordt geïnjecteerd om MTP's te laten vormen.Om de MTP's langs het GUV oppervlak te vertalen, beweeg de pipettip langzaam rond het GUV oppervlak met behulp van de fijne micromanipulator. Houd ongeveer dezelfde afstand tussen het GUV oppervlak en de micropipettip terwijl u de calcium-ionen injectie voortzet. Om de micro-injectie te stoppen, zet u de injectiepomp uit.Een representatieve fluorescentie microscopie afbeelding van een GUV-MLV complex geïmmobiliseerd op het oppervlak van een glazen dekglas wordt hier getoond. De membraan tubulaire uitsteeksels gegenereerd bij gelokaliseerde injectie van calcium-ionen op het oppervlak van de GUV zijn in deze afbeeldingen te zien. Vertaling van de micropipettip rond het membraanoppervlak zoals aangegeven door de pijl veroorzaakt beweging van de membraan tubulaire uitsteeksels in de richting van de calcium-ionen bron.Kortom, we stellen een techniek voor die contactloze hermodellering van gigantische lipideblaasjes mogelijk maakt, wat resulteerde in de vorming van membraan tubulaire uitsteeksels bij gelokaliseerde stimulatie met calcium-ionen. Toekomstige toepassingen van deze methode omvatten het overgaan van synthetische lipideblaasjes naar native biologische membranen of het toepassen van deze a

membrane-remodeling-giant-vesicles-response-to-localized-calcium-ion

Research

JoVE Journal

Chemistry

Scheikunde

Het endoplasmatisch reticulum speelt een belangrijke rol in de eiwit-biogenese en in de calcium homeostase. We hebben een experimenteel systeem dat ons in staat stelt om de rol van Ca2 + lekkage te verhelpen en om hun vermeende regulerende mechanismen te karakteriseren. Dit systeem houdt in siRNA gemedieerde gene silencing en live cell imaging Ca2 +.

Live-Cell Calcium Imaging Gecombineerd met siRNA gemedieerde gen-silencing Identificeert Ca 2 + Lek Kanalen in het ER membraan en de regulerende mechanismen

Gerichte-esterase geïnduceerde kleurstof laden (TED) ondersteunt de analyse van de intracellulaire calcium winkel dynamiek door fluorescentie beeldvorming. De methode baseert op richten van een recombinant carboxylesterase het endoplasmatisch reticulum (ER), waar het verbetert de lokale ontmaskering van synthetische lage affiniteit...

Direct Imaging van ER Calcium met Targeted-esterase-Induced Dye Loading (TED)

De reconstitutie van het transmembraan eiwit, KvAP, in grote unilamellaire vesicles (GUVs) is aangetoond voor twee dehydratatie-rehydratatie methode - electroformation en gel ondersteunde zwelling. In beide werkwijzen worden kleine unilamellaire blaasjes die het eiwit gefuseerd aan GUVs die vervolgens kan worden onderzocht door fluorescentie microscopie en patch-clamp elektrofysiologie vormen.

Reconstructie van een transmembraaneiwit, de Voltage-gated ionkanalen, KvAP, in Giant Unilamellaire Blaasjes voor Microscopie en Patch Clamp Studies

Veel proteïnen in de cel zin en membraan kromming veroorzaken. Beschrijven we een methode om te halen membraan nanotubes van lipide blaasjes te bestuderen de interactie van proteïnen of elke kromming-actieve molecuul met gebogen membranen in vitro.

Membraan Nanotubes trekken van Giant Unilamellar blaasjes

Solid-ondersteund, eiwit-vrij, dubbele fosfolipide dubbelgelaagde membranen (DLBM) kunnen worden omgezet in complexe en dynamische lipide nanobuis netwerken en kunnen dienen als 2D onderop modellen van het endoplasmatisch reticulum.

Spontane vorming en omlegging van kunstmatige lipide nanobuis netwerken als een Bottom-Up-Model voor endoplasmatisch Reticulum

Hier presenteren we een protocol voor Ca2 + imaging in zenuwcellen en gliacellen, waarmee de dissectie van Ca2 + signalen bij subcellular resolutie. Dit proces is van toepassing op alle celtypes waarmee de expressie van genetisch gecodeerde Ca2 + indicatoren.

Dissectie van lokale Ca2 + signalen in gekweekte cellen door membraan-gerichte Ca2 + indicatoren

Celvrije reconstitutie is een belangrijk hulpmiddel geweest om de cytoskeletassemblage te begrijpen, en het werk in het afgelopen decennium heeft benaderingen vastgesteld om septinedynamica in minimale systemen te bestuderen. Hier worden drie complementaire methoden gepresenteerd om septineassemblage in verschillende membraancontexten te observeren: vlakke bilayers, sferische steunen en staafsteunen.

Reconstitutie van septineassemblage bij membranen om biofysische eigenschappen en functies te bestuderen

Dit artikel presenteert een methode voor het bereiden van samengestelde Giant Unilamellaire blaasjes (cGUV's) met een blaasje-in-blaasjesstructuur, met aangepaste elektrische geleidbaarheid in binnenste, ringvormige en buitenste gebieden. Elektroformatie synthetiseert eenvoudige GUV's, die via osmotische shock worden omgezet in stomatocyten en cGUV's, wat een waardevol model biedt voor het bestuderen van de biofysica van cellen met kern.

Synthese van samengestelde reusachtige unilamellaire blaasjes: een biomimetisch model van nucleaatcellen

Kanalen voor het transport van watermoleculen in enzymen beïnvloeden actieve plaats solvatatie en katalyse. Hierin presenteren we een protocol voor de engineering van deze extra katalytische motieven op basis van in silico computermodellen en experimenten. Dit zal ons begrip van de invloed van oplosmiddel dynamiek op enzymkatalyse verbeteren.

Ontrafelen Entropic Rate Versnelling geïnduceerd door Solvent Dynamiek in Membrane Enzymen

β-vat buitenmembraaneiwitten (OMP's) hebben veel functies binnen de buitenmembraan van gramnegatieve bacteriën, mitochondriën en chloroplasten. Hier hopen we een bekende knelpunt in structurele studies te verlichten door protocollen te presenteren voor de productie van β-vat OMP's in voldoende hoeveelheden voor structuurbepaling door röntgenkristallografie of NMR-spectroscopie.

Van Constructen naar Crystals - Naar Structuur Bepaling van β-barrel Outer Membrane Proteins

Ontdek een contactloze techniek voor micromanipulatie van gigantische lipidenvesikels met behulp van gelokaliseerde calciumionengradiënten. Deze methode maakt directe visualisatie van membraanremodellering mogelijk.

Membraan remodelleren van gigantische blaasjes in reactie op gelokaliseerde Calcium Ion verlopen

Meer video's verkennen