Membraan remodelleren van gigantische blaasjes in reactie op gelokaliseerde Calcium Ion verlopen
16 juli 2018
Presenteren we een techniek voor contactloze micromanipulation van blaasjes, met behulp van de gelokaliseerde calcium ion verlopen. Microinjection van een calcium Ionenoplossing, in de nabijheid van een gigantische lipide blaasje, is gebruikt om het remodelleren van het lipide membraan, wat resulteert in de productie van membraan buisvormige uitsteeksels.
We presenteren een techniek voor manipulatie van gigantische blaasjes met behulp van gelokaliseerde calcium-ionen gradienten. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de volledig contactloze stimulatie van het oppervlak van het blaasje en de directe visualisatie van de lipide membraan remodellering bij interactie met calcium-ionen. Onze aanpak introduceert een manier om de details van calcium-ionen membraaninteracties aan te pakken, en biedt nieuwe mogelijkheden om de mechanismen van celmembraan hermodellering te bestuderen bij veranderingen in de cel micro-omgeving.
Om deze procedure te beginnen, bereid een oplossing van lipiden in chloroform. De uiteindelijke concentratie van lipiden in chloroform is één milligram per milliliter, en de uiteindelijke massa is 0,6 milligram. Wikkel het glazen flacon met de lipidenmengsel in metaalfolie om de inhoud te beschermen tegen omgevingslicht.
Plaats de met metaalfolie omwikkelde monsterviaal in een glazen beker. Om het chloroform te verwijderen, laat het oplosmiddel gedurende drie uur verdampen in een roterende verdamper met een druk van zeven kilopascals vacuüm bij 80 rpm. Een droge lipidefilm wordt gevormd op de bodem van de glazen flacon na verdamping.
Voeg langzaam 600 microliters fosfaatgebufferde zoutoplossing toe bovenop de gedroogde lipidefilm. Voeg na het toevoegen van de buffer voorzichtig zes microliters glycerol toe om het monster te beschermen tegen volledige uitdroging tijdens de vorming van een groot unilamelair blaasje verbonden aan een multilamellair blaasje, of GUV-MLV. Sluit de glazen flacon met Parafilm.
En bedek met metaalfolie om te beschermen tegen omgevingslicht. Bewaar de flacon een nacht bij vier graden Celsius. De volgende dag, soniceer de glazen flacon met de oplossing gedurende één minuut met behulp van een ultrasone bad bij kamertemperatuur.
Verwijder de Parafilm en pipetteer tot een visueel uniforme oplossing van kleine lipideblaasjes is gevormd. Pipetteer 30 microliters van de verkregen kleine lipideblaasje oplossing in afzonderlijke 0,5 milliliter plastic buisjes. Ontdooi een plastic buisje met een aliquot van de bevroren suspensie van kleine lipideblaasjes bij kamertemperatuur.
Vortex de buis vier keer gedurende één tot twee seconden met behulp van een vortex mixer op maximale snelheid. Plaats vijf microliters van de kleine lipideblaasjes suspensie op het oppervlak van een glazen dekglas om een kleine, ronde druppel te vormen. Gebruik een glazen dekglas zonder enige voorafgaande reinigingsstappen.
Plaats nu het glazen dekglas in een vacuümdroger gedurende 20 minuten. Bewaar de gedroogde lipidefilm bij kamertemperatuur gedurende vier minuten. Pipetteer vervolgens langzaam 50 microliters van 10 millimolair HEPES-buffer op de droge lipidefilm voor rehydratatie.
Wacht vijf minuten om de GUV-MLV complexen te vormen. Centreer een glazen dekglas op de stage van de microscoop. Pipetteer vervolgens 300 microliters HEPES-buffer erop en positioneer het centrum van de druppel boven het objectief.
Breng de 50 microliters van de voorgevormde GUV-MLV oplossing over in de HEPES oplossing. Wacht 25 minuten om slechts gevormde GUV-MLV complexen stevig te laten hechten aan het oppervlak van het glazen dekglas. Rond de randen van de borosilicaat glas capillairen af door de capillaire uiteinden voorzichtig in de vlam van een kaars te plaatsen om te voorkomen dat de micropipet kapot gaat terwijl deze aan de micropipet houder wordt bevestigd.
Trek ten minste drie glas capillairen met behulp van een automatische laser trekker. Gebruik de borosilicaat glas capillairen die in de tekst worden genoemd om een micropipet te verkrijgen met een tipopening van ongeveer 0,3 micrometer in diameter. Om verstopping van de pipettip te voorkomen, filter een vijf millimolair calciumchloride oplossing in HEPES buffer oplossing met behulp van een 0,2 tot 0,5 micron spuitfilter voor gebruik.
Vervolgens vult u elke micropipet achterwaarts met acht microliters van de calciumchloride oplossing met behulp van een Microloader. Verbind een micropipet houder met een micromanipulator. Monteer de micropipet stevig in de micropipet houder.
Verbind vervolgens de injectiepomp en capillair houder met behulp van de toevoerslang. Na het starten van de injectiepomp, pas de instellingen op de injectiepomp aan op een injectiedruk van 20 hectopascal. Stel ook een compensatiedruk van vijf hectopascal in.
Stel de microscoop in op helderveldmodus. Configureer deze voor differentiële interferentiecontrastering. Gebruik de grove micromanipulator om de micropipet boven de druppel met de GUV-MLV complexen te positioneren.
Loceer de tip van de micropipet boven het objectief en breng de pipet naar de druppel met behulp van de grove micromanipulator. Stel de microscoop in op fluorescentiemodus. Positioneer de micropipettip op een afstand van drie micrometer van het membraanoppervlak terwijl de calciumchloride oplossing uit de micropipet wordt geïnjecteerd om MTP's te laten vormen.
Om de MTP's langs het GUV oppervlak te vertalen, beweeg de pipettip langzaam rond het GUV oppervlak met behulp van de fijne micromanipulator. Houd ongeveer dezelfde afstand tussen het GUV oppervlak en de micropipettip terwijl u de calcium-ionen injectie voortzet. Om de micro-injectie te stoppen, zet u de injectiepomp uit.
Een representatieve fluorescentie microscopie afbeelding van een GUV-MLV complex geïmmobiliseerd op het oppervlak van een glazen dekglas wordt hier getoond. De membraan tubulaire uitsteeksels gegenereerd bij gelokaliseerde injectie van calcium-ionen op het oppervlak van de GUV zijn in deze afbeeldingen te zien. Vertaling van de micropipettip rond het membraanoppervlak zoals aangegeven door de pijl veroorzaakt beweging van de membraan tubulaire uitsteeksels in de richting van de calcium-ionen bron.
Kortom, we stellen een techniek voor die contactloze hermodellering van gigantische lipideblaasjes mogelijk maakt, wat resulteerde in de vorming van membraan tubulaire uitsteeksels bij gelokaliseerde stimulatie met calcium-ionen. Toekomstige toepassingen van deze methode omvatten het overgaan van synthetische lipideblaasjes naar native biologische membranen of het toepassen van deze a
Overzicht
Deze studie presenteert een contactloze techniek voor micromanipulatie van gigantische lipidenvesikels met behulp van gelokaliseerde calciumiongradiënten. De methode maakt directe visualisatie van het herstructureren van lipidemembranen mogelijk, wat leidt tot de vorming van tubulaire membraanutstulpingen.
Belangrijkste studieonderdelen
Wetenschapsgebied
- Neurowetenschap
- Biofysica
- Celbiologie
Achtergrond
- Reusachtige unilamellaire vesicles (GUVs) zijn belangrijke modellen voor het bestuderen van celmembranen.
- Calciumionen spelen een cruciale rol bij membraandynamiek en remodellering.
- Contactloze manipulatietechnieken kunnen de experimentele precisie verhogen.
- Het begrijpen van membraaninteracties kan inzicht geven in cellulaire processen.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een methode voor contactloze manipulatie van vesicles.
- Het onderzoeken van de effecten van gelokaliseerde calciumiongradiënten op lipide membranen.
- Het verkrijgen van inzicht in mechanismen van membraanherstructurering.
Gebruikte methoden
- Bereiding van lipidoplossingen en vorming van GUV-MLV-complexen.
- Gebruik van micropipetten voor lokale injectie van calciumionen.
- Fluorescentiemicroscopie voor visualisatie van membraanveranderingen.
- Controle van injectieparameters om effectieve manipulatie te waarborgen.
Belangrijkste resultaten
- Gelokaliseerde injectie van calciumionen induceerde succesvol tubulaire membraanutstulpingen.
- De techniek demonstreerde effectieve contactloze manipulatie van vesikels.
- Fluorescentie-imaging onthulde dynamische veranderingen in de membraanmorfologie.
- De resultaten suggereren potentiële toepassingen bij het bestuderen van biologische membranen.
Conclusies
- De voorgestelde techniek maakt innovatieve benaderingen voor membraanstudies mogelijk.
- Toekomstige toepassingen kunnen worden uitgebreid naar natuurlijke biologische membranen en polymere systemen.
- Deze methode opent nieuwe wegen voor onderzoek naar de dynamiek van celmembranen.
Veelgestelde vragen
Industriële Relevantie
Deze contactloze techniek voor membraanremodellering maakt nauwkeurig onderzoek mogelijk naar calciumion-gemedieerde lipidedynamiek, een sleutelmechanisme bij membraantransport en apoptose dat relevant is voor het verminderen van risico's bij targetselectie. Door een biomimetisch systeem te bieden om de effecten van calciumgradiënten op de membraanmorfologie te isoleren, ondersteunt het het mechanistische begrip van lipide-eiwitinteracties in ziektepaden. De aanpak biedt een schaalbaar, reproduceerbaar platform voor het bestuderen van membraanbiofysica in een vroeg stadium van discovery, wat bijdraagt aan het ontwerp van assays en voorspellende modellering van de effecten van verbindingen op de membraanintegriteit.
Strategische toepassingen in biofarmaceutische R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt onderzoek naar calciumafhankelijke membraanremodellering mogelijk als functionele readout voor targetvalidatie in signaleringspaden.
- Operationele waarde: Biedt een contactloos, controleerbaar systeem om effecten van calciumionen te isoleren zonder cellulaire complexiteit, waardoor storende variabelen in mechanistische studies worden verminderd.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Genereert kwantificeerbare vorming van tubulaire membraanuitstulpingen als een dynamische, op beeldvorming gebaseerde assay-output voor compound-screening.
- Operationele waarde: Maakt gebruik van gestandaardiseerde GUV-MLV-complexen en fluorescentiemicroscopie voor reproduceerbare, schaalbare read-outs over compound-bibliotheken.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Slaat een brug tussen synthetische membraanmodellen en native biologie door lipidereacties op fysiologisch relevante calciumgradiënten te bestuderen.
- Operationele waarde: Ondersteunt de continuïteit van mechanistische ontdekking naar preklinische validatie door oorzaak-gevolgrelaties in membraanherstructurering vast te stellen.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen vroege discovery-workflows waarin mechanistische risicoreductie van membraangeassocieerde targets cruciaal is, in het bijzonder in therapeutische gebieden die betrekking hebben op calciumsignalering, zoals de neurowetenschappen en oncologie.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetesten van calciumgevoelige targets door directe visualisatie van lipidemembraan-remodellering bij blootstelling aan een gradiënt.
- Screening: Maakt assay-gereedheid mogelijk via gestandaardiseerde vesicle-vorming en kwantificeerbare uitstulpingsmetrieken voor hit-identificatie.
- Analytiek: Levert ruimtelijke en temporele gegevens over membraanmorfologie via fluorescentie-imaging om verbindingen of gradiëntcondities te vergelijken.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij ziekterelevante systemen door lokale calciumfluctuaties na te bootsen zoals die voorkomen in cellulaire micro-omgevingen.
- Enterprise-hergebruik: Vestigt een herbruikbaar biomimetisch platform dat aanpasbaar is aan diverse lipidsamenstellingen en stimulatieparadigma's over verschillende projecten heen.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen bij targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit rond calcium-membraaninteracties te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt reproduceerbaarheid via gestandaardiseerde lipidepreparatie, gecontroleerde micro-injectie en imaging-protocollen.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroege, mechanisme-gebaseerde inzichten te verschaffen in de effecten van verbindingen op membraanstabiliteit.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van targets mogelijk op basis van gevalideerde fenotypes van membraanremodellering.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in de preparatie van lipide vesicles, micromanipulatie en fluorescentiemicroscopie.
- Is afhankelijk van met laser getrokken glazen capillairen, spuitfilters en nauwkeurige, drukgestuurde injectiesystemen.
- Maakt standaardisatie van de lipidesamenstelling, vesicle-grootte en calciumconcentratie noodzakelijk voor consistentie tussen experimenten.
- Aanpassing aan native membranen of polymere systemen kan optimalisatie van de buffercondities en stimulatieparameters vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de stabiliteit van vesicles over tijd en potentiële variabiliteit in de efficiëntie van protrusion-vorming.
Biopharma Veelgestelde Vragen
Chapters in this video
0:04
Title
0:41
Preparation of Small Lipid Vesicles
2:38
Preparation of GUV-MLV Complexes
4:12
Micropipette Preparation and Microinjection
6:09
Formation and Translation of Membrane Tubular Protrusions (MTPs) using the Calcium Ion Source
6:57
Results: Formation of Membrane Tubular Protrusions in Giant Vesicles Upon Localized Application of Calcium Ion Gradients
7:37
Conclusion
