Name: Differentiatie, onderhoud en analyse van menselijke retinale Pigment epitheel cellen: een ziekte-in-a-schotel-Model voor BEST1 mutaties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 39 s
Description: Leer hoe menselijke pluripotente stamcellen gedifferentieerd worden naar retinale pigmentepitheelcellen met BEST1-mutaties. Deze ziekte-in-een-schaal-methode ondersteunt onderzoek naar bestrofinopathieën en mogelijke celvervangingstherapieën.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit project werd gefinancierd door de NIH grants EY025290, GM127652 en Universiteit van Rochester start-up financiering.

1. differentiatie van hPSC aan RPE
<ol><li>Onderhouden en passage hPSCs18zoals hiervoor is beschreven. Opmerking: Alle cellen (met inbegrip van hPSCs en hPSC-RPEs) worden gekweekt in 37 ° C bij 5% CO2 gedurende de looptijd van de groei en differentiatie protocollen.</li>
	<li>
Voorafgaand aan de differentiatie, splitsen confluente hPSCs aan vooraf gecoate 6-Wells-platen.
	<ol>
<li>Jas van platen, kelder membraan matrix op ijs gedurende ongeveer 1 uur ontdooien, schorten liquidized matrix in 4 ° C DMEM medium op een 1:50 verdunning, 800 µL coating mengsel toevoegen aan elk putje en incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 37 ° C.</li>
		<li>Wanneer coating voltooid is, gecombineerd het mengsel en voeg onmiddellijk 1,5 – 2 mL medium in de putjes.</li>
		<li>Te heffen hPSCs aan de oude cultuur platen, cellen met PBS plus 0,5 mM EDTA gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen de oplossing gecombineerd en resuspendeer de cellen in kleine bosjes met kweekmedium.</li>
		<li>Zaad-cellen op ~ 20% confluentie in de nieuwe platen. Opmerking: Kelder membraan matrix opgeslagen in 100 µL aliquots bij-20 ° C en gebruik één aliquot jas van een 6-well-plate. De tijd voor coating kan worden uitgebreid tot 4 uur bij 37 ° C, of 's nachts bij kamertemperatuur. Het is belangrijk op te schorten en zaad van hPSCs als kleine bosjes van 3 – 5 cellen in plaats van afzonderlijke cellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wanneer de cellen worden gekweekt aan volledige confluentie, vervang het kweekmedium met differentiatie medium (4 mL/putje) (tabel 1, zonder activin-A). Cultuur voor 14 dagen, het veranderen van het medium (4 mL/putje) 3 x / week. Opmerking: De hPSC plaat dichtheid verdubbelt ongeveer elke 24 h. aanzienlijke celdood wordt verwacht na het begin van de procedure van de differentiatie. Aggregaten van de dode cellen en puin in de putjes kunnen worden gezien met het blote oog tijdens middellange wijzigingen.</li>
	<li>Van dag 15 tot dag 28, door differentiatie medium te vullen met 100 ng/mL mens activin-A (tabel 1, met mens activin-A). Wijzigen van het medium (4 mL/putje) 3 x / week.</li>
	<li>Stop activin-A suppletie beginnen op dag 29 (tabel 1, zonder menselijk activin-A). Blijven cel kweken in differentiatie medium voor 8-10 weken totdat gepigmenteerde hPSC-RPE clusters (figuur 1A-B) verschijnen. Opmerking: Clusters van gepigmenteerde cellen kunnen worden gezien als kleine donkere puntjes op een cel cultuur plaat met het blote oog (figuur 1A-B, bovenaan). Afzonderlijke gepigmenteerde cellen met de handtekening geplaveide vorm kunnen worden gezien onder een 20 X Microscoop (figuur 1A-B, bodem).</li>
</ol>2. isolatie en de cultuur van gedifferentieerde RPE cellen
<ol><li>Verwijder het medium van de differentiatie, wassen met PBS, voeg 1 mL 0,05% trypsine plus 1 U/µL van collagenase in elk putje, Incubeer bij 37 ° C gedurende 20-30 min. verwijderen de trypsine/collagenase en zachtjes, voeg 2 mL van voorverwarmde RPE medium in elk putje van de plaat 6-well (< C0 > tabel 2). Opmerking: Gebruik een omgekeerde Microscoop om te controleren van de morfologie van de hPSC-RPE-cellen, die vóór de behandeling van de trypsine/collagenase veelhoekige, en ronde na voldoende spijsvertering.</li>
	<li>
Het gebruik van een bunsenbrander met pull glas Pasteur pipettes.
	<ol>
<li>Met beide handen, houdt een lange (9 inch) Pipet van Pasteur aan beide uiteinden zodat er horizontale en boven de Bunsenbrander ongeveer 2/3 van de lengte van het dunne deel van de pipet.</li>
		<li>Zodra het glas zachte van de vlam wordt, snel Trek de twee kanten uit elkaar, zodanig dat een micro schraper-achtige tip wordt gevormd op het nieuwe einde van de Pipet (Figuur 2).</li>
		<li>Herhaal meerdere keren maken meerdere "cel schrapers". Spray de getrokken pipetten met 70% ethanol voor sterilisatie en ze drogen in de cel cultuur kap.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Onder een Microscoop, gebruik een micro "cel schraper" zachtjes verwerpen gepigmenteerde hPSC-RPE clusters van de plaat.
	<ol>
<li>Zachtjes Tik (doen niet schrapen) direct op de gepigmenteerde cellen, die wordt een zwevende werkbalk omhoog in het kweekmedium zodra ze van de bodem van de put distantiëren.</li>
		<li>Onmiddellijk kunt een 20 µL micropipet zachtjes zuignap van de cellen gedissocieerde hPSC-RPE en overbrengen naar een vooraf gecoate 6-well plaat met RPE middellange24.</li>
		<li>~ 5 x 103 cellen (~ 10% confluentie zoals waargenomen onder een Microscoop X 20) verzamelen in elk vooraf gecoat goed van een 12-well plaat door herhalende stappen 2.3.1–2.3.2 meerdere malen, indien nodig. Breng het eindvolume van medium tot 2 mL. Opmerking: Om te voorkomen dat gedissocieerde hPSC-RPE cellen zwevend weg, Vermijd beweging van de platen tijdens het dissociatie zodanig dat de gedissocieerde cellen in het medium zweven, maar nog steeds lokaal geconcentreerd.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cultuur de nieuwe geïsoleerde hPSC-RPE cellen (P,0) op 12-Wells-platen in RPE medium voor een ander 6-8 weken te laten vormen een gepigmenteerde enkelgelaagde (Figuur 1 c).</li>
	<li>Wijzigen van het medium 3 x / week. Bij het wijzigen van het medium, laat ongeveer 1/3 deel van het oude medium in elk putje en 2/3 volume verse, voorverwarmde RPE medium toevoegen. In dit stadium 2 mL van RPE medium te gebruiken voor elk putje in een 12-well-plate (dus wisselen 1.3 mL medium elke keer). Opmerking: De enkelgelaagde P0 hPSC-RPE cellen kan uitmaken koepels, suggereren dat de cellen actief van vloeistoffen transport zijn, en door strakke kruispunten25zijn verankerd. Daarom is koepel vorming een indicator van volwassen RPE status.</li>
</ol>3. RPE lot validatie door Immunoblotting
<ol><li>Maak de cel hPSC-RPE lysate met behulp van zoogdieren afkomstig eiwit extractie buffer aangevuld met proteïnase inhibitor cocktail. Incubeer de cel lysate op ijs voor 30 min vóór centrifugeren bij 13.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C tot het negeren van onopgeloste cel puin. Meet de totale eiwitconcentratie van lysate.</li>
	<li>Denatureren van 40 µg totaal eiwit in Laemmli SDS monster buffer bij 75 ° C voor 10 min. het eiwit scheiden monsters op een 10% Tris-glycine SDS-pagina gel bij een constante spanning van 90 V voor 15 min en dan 150 V tot de voorste regionen van kleurstof de onderkant van de gel.</li>
	<li>Overdracht van de eiwitten op een membraan van het nitrocellulose in vooraf gekoelde Tris-glycine buffer aangevuld met 10% methanol bij 100 V gedurende 1 uur.</li>
	<li>Het blokkeren van het membraan in Tris gebufferde zoutoplossing met 0,1% niet-ionogene wasmiddel (TBST) en 5% non-fat droge melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Incubeer het membraan met primaire antilichamen verdund in de blokkeerbuffer bij 4 ° C's nachts. Verdun de antilichamen gericht op RPE specifieke marker eiwitten als volgt: RPE65, 1:1 000; CRALBP, 1:1 000; BEST1, 1:1, 000. Verdun het antilichaam tegen β-actine op 1:10,000 te detecteren van β-actine als een besturingselement laden.</li>
	<li>Het wassen van het membraan met TBST 3 keer, met 5 min. voor elke wasbeurt.</li>
	<li>Het membraan met fluorophore geconjugeerd geit-antimuis IgG secundair antilichaam verdund 1:10,000 in de blokkeerbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur incuberen.</li>
	<li>Het wassen van het membraan met TBST 4 keer, met 10 min. voor elke wasbeurt.</li>
	<li>Detecteren van de eiwitten via een infrarood imaging systeem (Figuur 3).</li>
</ol>4. controle van de BEST1 Subcellular Localisatie van immunokleuring
<ol><li>HPSC-RPE cellen met 2 mL PBS keer wassen en op te lossen in 2 mL zuiver 4% paraformaldehyde gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen met 2 mL PBS tweemaal, en de cellen in 2 mL PBS met 0,1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof en 2% ezel serum voor 45 min voor het blokkeren van de aspecifieke bandplaatsen uit te broeden.</li>
	<li>Incubeer de cellen met BEST1 antilichaam (1:200 verdunning) gedurende 2 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>De cellen met 2 mL PBS 3 keer wassen. Incubeer met fluorophore vervoegd secundaire IgG (1:1, 000) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen met 2 mL PBS 3 keer voor het verwijderen van niet-afhankelijke secundair antilichaam.</li>
	<li>Observeren gekleurde cellen door confocale microscopie (Figuur 4).</li>
</ol>5. opname Ca2 +-afhankelijke Cl- -stroom in hPSC-RPE door geheel-cel Patch-Clamp
<ol><li>24-72 uur voordat de patch-klem, split een volledig confluente goed (op een 12-well-plate) voor volwassen P0 hPSC-RPE cellen (geplaveide-vormige en gepigmenteerde). De middellange, wassen eenmaal met PBS gecombineerd en voeg 1 mL 0,05% trypsine plus 1 U/µL collagenase in de put. Opmerking: Vooraf warm de trypsine/collagenase tot 37 ° C vlak voor gebruik.</li>
	<li>Incubeer bij 37 ° C gedurende 8 minuten. Opmerking: Na deze stap, de hPSC-RPE cellen zijn nog steeds aanhangend en aangesloten.</li>
	<li>Voorzichtig wassen de cellen uit de plaat met een micropipet van 1 mL en cellen in het mengsel spijsvertering overbrengen in een conische tube van 15 mL. Wassen van de put met 1 mL voorverwarmde trypsine/collagenase te verzamelen van de resterende cellen en hen te combineren in de conische tube van 15 mL. Opmerking: De hPSC-RPE-cellen zijn op dit punt nog steeds in grote klontjes. Probeer niet te breken van de cel klontjes door krachtig pipetteren. Enkele klontjes kunnen vasthouden aan de binnenwand van de tip 1 mL.</li>
	<li>Incubeer de conische buis in een droge bad van 37 ° C gedurende 8 minuten.</li>
	<li>Gebruik een micropipet van 1 mL met pipet zachtjes en neergaande 10-15 keer de spijsvertering mix. Opmerking: Cel bosjes veel kleiner maar nog steeds zichtbaar geworden. Vermijd krachtig pipetteren.</li>
	<li>Herhaal de vorige twee stappen. Opmerking: Allermeest naar de cellen moet in eencellige schorsing na pipetteren. Er kunnen nog enkele kleine cel bosjes, die aanvaardbaar zijn. Optioneel: Incubeer de conische buis bij 37 ° C gedurende een extra 5 minuten gevolgd door zachte pipetteren. De totale tijd in de trypsine/collagenase bij 37 ° C mag niet meer dan 30 min (8 + 8 + 8 + 5 = 29).</li>
	<li>Voeg 5 mL van voorverwarmde RPE medium aan de conische tube van 15 mL, met de cellen die verteerd. Spin bij 200 x g gedurende 5 min voor het verzamelen van de cellen. Resuspendeer en zaad cellen op vooraf gecoate 35 mm gerechten op 10 – 20% confluentie (bijv., een 100% confluente goed op een 12-well plaat aan vijf 35 mm gerechten voor 10% confluentie). Opmerking: Te allen tijde vermijden krachtig pipetteren, die aanzienlijke celdood kan veroorzaken, zoals vertegenwoordigd door schijnbare donkere cel puin in het supernatans dat na het centrifugeren. Goed gescheiden eencellige zaaien is essentieel voor patch klem opname.</li>
	<li>Uitvoeren van de patch geheel-cel klem zoals eerder beschreven18,26,27,28,29,30,31. Verwerven van de huidige sporen uit een familie van stap potentieel (-100 tot + 100 mV van een bedrijf potentieel van 0 mV) (Figuur 5). Opmerking: De recepten van interne en externe oplossingen worden beschreven in tabel 3 en tabel 4, respectievelijk.</li>
</ol>

<ol><li>Allikmets, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Best+disease+gene+in+patients+with+age-related+macular+degeneration+and+other+maculopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Best disease gene in patients with age-related macular degeneration and other maculopathies.</a> Hum Genet. 104 (6), 449-453 (1999).</li>
<li>Burgess, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biallelic+mutation+of+BEST1+causes+a+distinct+retinopathy+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Biallelic mutation of BEST1 causes a distinct retinopathy in humans.</a> Am J Hum Genet. 82 (1), 19-31 (2008).</li>
<li>Davidson, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Missense+mutations+in+a+retinal+pigment+epithelium+protein%2C+bestrophin-1%2C+cause+retinitis+pigmentosa%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Missense mutations in a retinal pigment epithelium protein, bestrophin-1, cause retinitis pigmentosa.</a> Am J Hum Genet. 85 (5), 581-592 (2009).</li>
<li>Kramer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+VMD2+gene+are+associated+with+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+%28Best+disease%29+and+adult+vitelliform+macular+dystrophy+but+not+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in the VMD2 gene are associated with juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best disease) and adult vitelliform macular dystrophy but not age-related macular degeneration.</a> Eur J Hum Genet. 8 (4), 286-292 (2000).</li>
<li>Marquardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+a+novel+gene%2C+VMD2%2C+encoding+a+protein+of+unknown+properties+cause+juvenile-onset+vitelliform+macular+dystrophy+%28Best%27s+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Mutations in a novel gene, VMD2, encoding a protein of unknown properties cause juvenile-onset vitelliform macular dystrophy (Best's disease).</a> Hum Mol Genet. 7 (9), 1517-1525 (1998).</li>
<li>Petrukhin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+gene+responsible+for+Best+macular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of the gene responsible for Best macular dystrophy.</a> Nat Genet. 19 (3), 241-247 (1998).</li>
<li>Yardley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+of+VMD2+splicing+regulators+cause+nanophthalmos+and+autosomal+dominant+vitreoretinochoroidopathy+%28ADVIRC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Mutations of VMD2 splicing regulators cause nanophthalmos and autosomal dominant vitreoretinochoroidopathy (ADVIRC).</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (10), 3683-3689 (2004).</li>
<li>Yang, T., Justus, S., Li, Y., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEST1%3A+the+Best+Target+for+Gene+and+Cell+Therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">BEST1: the Best Target for Gene and Cell Therapies.</a> Mol Ther. 23 (12), 1805-1809 (2015).</li>
<li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bestrophin%2C+the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+%28VMD2%29%2C+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bestrophin, the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li>
<li>Boon, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spectrum+of+ocular+phenotypes+caused+by+mutations+in+the+BEST1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The spectrum of ocular phenotypes caused by mutations in the BEST1 gene.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (3), 187-205 (2009).</li>
<li>Marmorstein, A. D., Cross, H. E., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+bestrophins+in+ocular+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Functional roles of bestrophins in ocular epithelia.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (3), 206-226 (2009).</li>
<li>Fujii, S., Gallemore, R. P., Hughes, B. A., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+for+a+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+toad+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Direct evidence for a basolateral membrane Cl- conductance in toad retinal pigment epithelium.</a> Am J Physiol. 262, C374-C383 (1992).</li>
<li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+DIDS+on+the+chick+retinal+pigment+epithelium.+II.+Mechanism+of+the+light+peak+and+other+responses+originating+at+the+basal+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of DIDS on the chick retinal pigment epithelium. II. Mechanism of the light peak and other responses originating at the basal membrane.</a> J Neurosci. 9 (6), 1977-1984 (1989).</li>
<li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium%3A+the+light+peak+and+fast+oscillation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> J Neurophysiol. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li>
<li>Li, Y., Nguyen, H. V., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+Biopsy+and+Patient-Specific+Stem+Cell+Lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Skin Biopsy and Patient-Specific Stem Cell Lines.</a> Methods Mol Biol. 1353, 77-88 (2016).</li>
<li>Milenkovic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bestrophin+1+is+indispensable+for+volume+regulation+in+human+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bestrophin 1 is indispensable for volume regulation in human retinal pigment epithelium cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (20), E2630-E2639 (2015).</li>
<li>Moshfegh, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BESTROPHIN1+mutations+cause+defective+chloride+conductance+in+patient+stem+cell-derived+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">BESTROPHIN1 mutations cause defective chloride conductance in patient stem cell-derived RPE.</a> Hum Mol Genet. 25 (13), 2672-2680 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+mutations+impair+BESTROPHIN1%27s+essential+role+in+mediating+Ca2%2B-dependent+Cl-+currents+in+human+RPE%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Patient-specific mutations impair BESTROPHIN1's essential role in mediating Ca2+-dependent Cl- currents in human RPE.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+%28best-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> J Gen Physiol. 127 (5), 577-589 (2006).</li>
<li>Volland, S., Esteve-Rudd, J., Hoo, J., Yee, C., Williams, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+some+organizational+characteristics+of+the+mouse+central+retina+and+the+human+macula%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A comparison of some organizational characteristics of the mouse central retina and the human macula.</a> PLoS One. 10 (4), e0125631(2015).</li>
<li>Kamao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigment+epithelium+cell+sheets+aiming+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of human induced pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelium cell sheets aiming for clinical application.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 205-218 (2014).</li>
<li>Idelson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+retinal+pigment+epithelium+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional retinal pigment epithelium cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (4), 396-408 (2009).</li>
<li>Mandai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+Induced+Stem-Cell-Derived+Retinal+Cells+for+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous Induced Stem-Cell-Derived Retinal Cells for Macular Degeneration.</a> N Engl J Med. 376 (11), 1038-1046 (2017).</li>
<li>Maminishkis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confluent+monolayers+of+cultured+human+fetal+retinal+pigment+epithelium+exhibit+morphology+and+physiology+of+native+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).</li>
<li>Maruotti, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+scalable+process+for+the+differentiation+of+retinal+pigment+epithelium+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">A simple and scalable process for the differentiation of retinal pigment epithelium from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cells Transl Med. 2 (5), 341-354 (2013).</li>
<li>Yang, T., He, L. L., Chen, M., Fang, K., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bio-inspired+voltage-dependent+calcium+channel+blockers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Bio-inspired voltage-dependent calcium channel blockers.</a> Nat Commun. 4, 2540(2013).</li>
<li>Yang, T., Hendrickson, W. A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preassociated+apocalmodulin+mediates+Ca2%2B-dependent+sensitization+of+activation+and+inactivation+of+TMEM16A%2F16B+Ca2%2B-gated+Cl-+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Preassociated apocalmodulin mediates Ca2+-dependent sensitization of activation and inactivation of TMEM16A/16B Ca2+-gated Cl- channels.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (51), 18213-18218 (2014).</li>
<li>Yang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+selectivity+in+bestrophin+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure and selectivity in bestrophin ion channels.</a> Science. 346 (6207), 355-359 (2014).</li>
<li>Yang, T., Puckerin, A., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+RGK+GTPases+differentially+use+alpha1-+and+auxiliary+beta-binding-dependent+mechanisms+to+inhibit+CaV1.2%2FCaV2.2+channels%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Distinct RGK GTPases differentially use alpha1- and auxiliary beta-binding-dependent mechanisms to inhibit CaV1.2/CaV2.2 channels.</a> PLoS One. 7 (5), e37079(2012).</li>
<li>Yang, T., Suhail, Y., Dalton, S., Kernan, T., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+encoded+molecules+for+inducibly+inactivating+CaV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetically encoded molecules for inducibly inactivating CaV channels.</a> Nat Chem Biol. 3 (12), 795-804 (2007).</li>
<li>Yang, T., Xu, X., Kernan, T., Wu, V., Colecraft, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rem%2C+a+member+of+the+RGK+GTPases%2C+inhibits+recombinant+CaV1.2+channels+using+multiple+mechanisms+that+require+distinct+conformations+of+the+GTPase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rem, a member of the RGK GTPases, inhibits recombinant CaV1.2 channels using multiple mechanisms that require distinct conformations of the GTPase.</a> J Physiol. 588 (Pt 10), 1665-1681 (2010).</li>
<li>Gong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Human+Protein-Induced+Pluripotent+Stem+Cells+toward+a+Retinal+Pigment+Epithelial+Cell+Fate%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Human Protein-Induced Pluripotent Stem Cells toward a Retinal Pigment Epithelial Cell Fate.</a> PLoS One. 10 (11), e0143272(2015).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+activates+bestrophin+ion+channels+through+direct+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ATP activates bestrophin ion channels through direct interaction.</a> Nat Commun. 9 (1), 3126(2018).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De belangrijkste procedure voor de ziekte-in-a-schotel-benadering is om te onderscheiden van hPSCs met een ziekte-veroorzakende mutatie naar de juiste cel bloedlijn, oftewel RPE voor BEST1. Dus, na elk experiment van differentiatie, de resulterende hPSC-RPE-cellen moeten worden zorgvuldig gevalideerd voor hun volwassen status RPE-specifieke morphologies en eiwit markeringen16,17,18. U wilt minimaliseren klonale artefact...

Het is gedocumenteerd die ten minste vijf retinale degeneratieve ziekten worden veroorzaakt door genetische mutaties in het BEST1 gen1,2,3,,4,5,6 , 7 , 8, met het aantal gerapporteerde mutaties al meer dan 200 en nog steeds groeiende. Deze BEST1-geassocieerde ziekten, ook bekend als bestrophinopathies, progressieve visie verlies en zelfs blindheid veroorzaken en er zijn momenteel geen doeltreffende behandelingen. Het eiwit product van BEST1, namelijk BESTROPHIN1 (BEST1), is een Ca2 +-geactiveerde Cl- -kanaal (CaCC) speciaal onder het retinale pigment epitheel (RPE) van de ogen5,6, uitgedruktin 8,9. Nog belangrijker is, een klinische fenotype van BEST1-geassocieerde ziekten is de verminderde visuele reactie op lichte stimuli, genaamd lichte piek (LP) gemeten in de electrooculogram10,11; LP wordt verondersteld te worden bemiddeld door een CaCC in RPE12,13,14. Om de pathologische mechanismen van BEST1 mutaties beter te begrijpen en te streven naar mogelijke therapieën, is het essentieel om te studeren van mutant BEST1 kanalen endogeen uitgedrukt in menselijke RPE cellen.
Verkrijgen van RPE cellen rechtstreeks uit levende patiënten echter zeer onpraktisch. Hoewel inheemse RPE cellen kunnen worden geoogst vanaf Biopten van menselijke kadavers en foetussen, beperkt de moeilijke toegang tot deze bronnen aanzienlijk wetenschappelijk onderzoek. Daarom is het essentieel dat alternatieve RPE bronnen dan menselijke ogen. Deze oproep is beantwoord door de recente vooruitgang in de cel van de stam technieken, zoals functionele RPE cellen nu van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs), met inbegrip van embryonale stamcellen (hESCs) kunnen worden onderscheiden en pluripotente stamcellen (hiPSCs), de laatste geïnduceerde wordt gegenereerd door de herprogrammering van de primaire huid fibroblasten van donoren16,17,18. Nog belangrijker is, zorgen de zelf-vernieuwing en pluripotent van hPSCs voor een betrouwbare bron voor het genereren van RPEs, terwijl de patiënt-specificiteit van hiPSCs en het potentieel van de genomic wijziging van hESCs (bijvoorbeelddoor CRISPR) bieden een veelzijdige ziekte-in-a-schotel-model voor gewenste BEST1 mutaties.
hPSC-RPE heeft diverse voordelen ten opzichte van muizen RPE modellen: 1) BEST1 knock-out muizen worden niet weergegeven voor elk netvlies abnormaliteit19, verhogen van de mogelijkheid van verschillende genetische vereiste van BEST1 in RPE tussen muizen en mensen; 2) slechts 3% van menselijke RPE cellen zijn binucleate, in tegenstelling tot 35% in muizen20; 3) hiPSC-RPE potentiates autologe transplantatie in de klinische behandeling van retinale stoornissen21. Niettemin, dierlijke modellen zijn nog steeds onmisbaar voor het bestuderen van RPE fysiologie en pathologie in een live systeem en het oncogene potentieel van hiPSC mag niet worden genegeerd.
De procedure hier beschrijft een nuttig en matig eenvoudige hPSC RPE differentiatie protocol die kunnen worden gebruikt voor onderzoek en klinische doeleinden. Dit protocol gebruikt nicotinamide (vitamine B3) om te vergroten van differentiatie van hPSCs naar zenuwweefsel, die verder wordt veroorzaakt om te differentiëren in RPE door behandeling met activin-A. Nicotinamide behandeling is aangetoond dat het verhogen van het aantal gepigmenteerde cellen (een teken van differentiatie in RPE), eventueel door de activiteit van de apoptotic cellen22differentiëren verzachtende. De resulterende hPSC-RPE cellen weergeven de dezelfde belangrijke markeringen, geplaveide morfologie en cellulaire functionaliteit als inheemse menselijke RPE cellen22. Dus, in de instelling van een onderzoek, de resulterende hPSC-RPE cellen zijn geschikt voor downstream functionele analyses, met inbegrip van immunoblotting, immunokleuring en geheel-cel patch-klem, waarvoor gedetailleerde experimentele procedures zijn ook beschikbaar. RPE cellen afgeleid van stamcellen hebben klinisch, zowel dierlijke studies en menselijke proeven23zien groot potentieel voor transplantatie behandeling van macula degeneratie.

<table><tbody><tr><td>Knock-Out (KO) DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>KO serum replacement</td><td>ThermoFisher</td><td>10829028</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential amino acids</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>ThermoFisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin</td><td>ThermoFisher</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>Nicotinamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Human activin-A</td><td>PeproTech</td><td>120-14</td><td></td></tr><tr><td>MEM (a modification)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>N1 supplement</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6530</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine-penicillin-streptomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1146</td><td></td></tr><tr><td>Nonessential amino acids</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7156</td><td></td></tr><tr><td>Taurine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0386</td><td></td></tr><tr><td>Triiodo-thyronin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5516</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR-1 medium</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>VWR</td><td>45000-664</td><td></td></tr><tr><td>M-PER mammalian protein extraction reagent</td><td>Pierce</td><td>78501</td><td></td></tr><tr><td>proteinase inhibitor cocktail</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td></td></tr><tr><td>RPE65 antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-355</td><td></td></tr><tr><td>CRALBP antibody</td><td>Abcam</td><td>ab15051</td><td></td></tr><tr><td>BEST1 antibody</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-164</td><td></td></tr><tr><td>Beta Actin antibody</td><td>ThermoFisher</td><td>MA5-15739</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-mouse IgG</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG</td><td>ThermoFisher</td><td>SA5-35521</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>HEKA EPC10 patch clamp amplifier</td><td>Warner Instruments</td><td>895000</td><td></td></tr><tr><td>Patchmaster</td><td>Warner Instruments</td><td>895040</td><td></td></tr></tbody></table>

differentiatie, onderhoud en analyse van menselijke retinale pigment epitheel cellen: een ziekte-in-a-schotel-model voor best1 mutaties

Differentiation, Maintenance, and Analysis of Human Retinal Pigment Epithelium Cells: A Disease-in-a-dish Model for BEST1 Mutations

Hoewel meer dan 200 genetische mutaties in het menselijk BEST1 -gen zijn geïdentificeerd en gekoppeld aan retinale degeneratieve ziekten, blijven de pathologische mechanismen ongrijpbare voornamelijk te wijten aan het ontbreken van een goede in-vivo -model voor het bestuderen van BEST1 en zijn mutaties onder fysiologische omstandigheden. BEST1 codeert een ionkanaal, namelijk BESTROPHIN1 (BEST1), die werkt in de retinale pigment epitheel (RPE); echter vormt de uiterst beperkte toegankelijkheid aan inheemse menselijke RPE cellen een grote uitdaging voor wetenschappelijk onderzoek. Dit protocol beschrijft hoe te genereren van menselijke RPEs, rekening houdend met BEST1 ziekte-veroorzakende mutaties door geïnduceerde differentiatie van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs). Als hPSCs zelf hernieuwbare zijn, deze aanpak kan onderzoekers hebben een constante bron van hPSC-RPEs voor verschillende experimentele analyses, zoals immunoblotting, immunofluorescentie, en patch-klem, en biedt dus een zeer krachtige model van het ziekte-in-a-schotel voor BEST1-netvlies voorwaarden verbonden. Met name kan deze strategie worden toegepast om te studeren RPE (patho) fysiologie en andere genen van belang native uitgedrukt in RPE.

De meest technisch uitdagende stap is de handmatige isolatie, die streeft naar een hoge zuiverheid van een gedifferentieerde P0 hPSC-RPE bevolking. Na een succesvolle isolatie, > 90% cellen in de P0 bevolking zal groeien en volwassen om handtekening RPE morphologies (Figuur 1 c) weer te geven. Het bestaan van een kleine gedeelte van niet-RPE of onrijpe RPE cellen in de P0 bevolking is bijna onvermijdelijk, maar zal niet interf...

Hier presenteren we een protocol om te onderscheiden van de retinale pigment epitheel (RPE) cellen van menselijke pluripotente stamcellen rekening houdend met patiënt afkomstige mutaties. De mutant cellijnen kunnen worden gebruikt voor functionele analyses, met inbegrip van immunoblotting, immunofluorescentie, en patch klem. Deze aanpak van ziekte-in-a-schotel omzeilt de moeilijkheidsgraad van het verkrijgen van inheemse menselijke RPE cellen.

Differentiatie, onderhoud en analyse van menselijke retinale Pigment epitheel cellen: een ziekte-in-a-schotel-Model voor BEST1 mutaties

Although over 200 genetic mutations in the human BEST1 gene have been identified and linked to retinal degenerative diseases, the pathological mechanisms ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van ionkanaalgerelateerde retinale ziekten over de moleculaire mechanismen van BEST1-mutaties en de pathologie van bestrophinopathieën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de moeilijkheid om direct RPE-cellen van mensen te verkrijgen, omzeilt. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van bestrophinopathieën, inclusief de ziekte van Best, omdat de RPE-cellen kunnen worden gebruikt voor zowel onderzoeksdoeleinden als celvervangende therapieën.Wanneer de hPSC-cultuur confluency bereikt, vervang het cultuurmedium met vier milliliters differentiatiemedium per putje van een zes-putjesplaat. Na twee weken cultiveren, supplementeer het differentiatiemedium met 100 nanogram per milliliter humane activin-A, ververs het gesupplementeerde medium drie keer per week gedurende nog eens 14 dagen. Op dag 29, schakel over naar niet-gesupplementeerd differentiatiemedium voor nog eens acht tot tien weken totdat er gepigmenteerde RPE-celclusters verschijnen.Om de gepigmenteerde RPE-cellen te isoleren, houdt u eerst individuele negen-duim glazen Pasteur-pipetten horizontaal over

differentiation-maintenance-analysis-human-retinal-pigment-epithelium

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Wij bieden een reproduceerbare methode voor het kweken van samenvloeiing monolagen van de menselijke foetus retinale pigment epitheelcellen (hfRPE) cellen die vertonen morfologie, fysiologie, polariteit, en eiwit-en genexpressie-patronen van de volwassen autochtone weefsel. Dit werk is uitgebreid tot een diermodel van verschillende oogziekten.

Experimentele modellen voor Studie van het retinale pigmentepitheel fysiologie en pathofysiologie

Stamcellenafgeleide retinale pigmentepitheel (RPE) cellen kunnen voor meerdere toepassingen worden gebruikt, waaronder cel-gebaseerde therapieën voor retinale degeneratie, ziektemodellering en geneesmiddelstudies. Hier presenteren we een eenvoudig protocol voor het reproduceerbaar verkrijgen van RPE uit stamcellen.

Efficiënte Afleiding van retinale pigment epitheel cellen uit stamcellen

Dit protocol wordt beschreven hoe retinale pigment epitheliale cellen (RPE) uit pluripotente stamcellen te produceren. De methode gebruikt een combinatie van factoren die de groei en de kleine molecules om direct de differentiatie van stamcellen in onvolwassen RPE in veertien dagen en volwassen, functionele RPE na drie maanden.

Snelle, gerichte differentiatie van de epitheliale cellen van de retinale Pigment van menselijke embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen

Het doel van dit protocol is om aan te tonen dat het kweken van retinale pigment epitheliale (RPE) cellen op leeftijd en/of zieke mens Bruch membraan. Deze methode is geschikt om te bestuderen het gedrag van de cel van de RPE op een gecompromitteerde extracellulaire matrix.

Kweken van de epitheliale cellen van de retinale Pigment op een Ex Vivo Model van leeftijd menselijke Bruch membraan

Dit protocol, dat oorspronkelijk werd gerapporteerd door Fernandez-Godino et al. in 20161, beschrijft een methode om RPE-cellen van muizen efficiënt te isoleren en te cultiseren, die binnen een week een functionele en gepolariseerde RPE-monolaag vormen op Transwell-platen. De procedure duurt ongeveer 3 uur.

Efficiënte dissectie en cultuur van primaire muis retinale pigment epitheelcellen

De niet-menselijke primaat (NHP) is een ideaal model voor het bestuderen van menselijke retinale cellulaire therapieën vanwege de anatomische en genetische overeenkomsten. Dit manuscript beschrijft een methode voor submaculaire transplantatie van retinale pigmentepitheelcellen in het NHP-oog en strategieën om intraoperatieve complicaties geassocieerd met maculaire manipulatie te voorkomen.

Retinale pigmentepitheeltransplantatie in een niet-humaan primaatmodel voor degeneratieve retinale ziekten

Dit manuscript beschrijft een vereenvoudigd protocol voor de isolatie van retinale gepigmenteerde epitheelcellen (RPE) uit muizenogen op een stapsgewijze manier. Het protocol omvat de enucleatie en dissectie van muizenogen, gevolgd door de isolatie, zaaiing en kweek van RPE-cellen.

Isolatie van primaire retinale gepigmenteerde epitheelcellen van muizen

Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het differentiëren van hiPSC's in oogveldclusters en het genereren van neuro-retinale organoïden met behulp van vereenvoudigde kweekomstandigheden waarbij zowel adherente als suspensiecultuursystemen betrokken zijn. Andere oculaire celtypen, zoals de RPE en het hoornvliesepitheel, kunnen ook worden geïsoleerd uit volwassen oogvelden in retinale culturen.

Generatie van retinale organoïden uit gezonde en retinale ziekte-specifieke door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Muismodellen kunnen nuttige hulpmiddelen zijn voor het onderzoeken van de biologie van het retinale gepigmenteerde epitheel (RPE). Er is vastgesteld dat muizen een reeks RPE-pathologieën kunnen ontwikkelen. Hier beschrijven we een fenotyperingsprotocol om RPE-pathologieën bij muizen op te helderen en te kwantificeren met behulp van licht, transmissie-elektron en confocale microscopie.

Een protocol voor het evalueren en kwantificeren van retinale gepigmenteerde epitheelpathologieën in muismodellen van leeftijdsgebonden maculaire degeneratie

Hier presenteren we protocollen voor humane celcultuur om factoren voor translatie-initiatie te analyseren die zich binden aan de 5' dop van mRNA tijdens fysiologische zuurstofcondities. Deze methode maakt gebruik van een agarose-gekoppelde m7GTP dop-analogon en is geschikt om dop-bindende factoren en hun interacterende partners te onderzoeken.

Analyse van Cap-bindende eiwitten in menselijke cellen blootgesteld aan Physiological Oxygen Voorwaarden

Leer hoe menselijke pluripotente stamcellen gedifferentieerd worden naar retinale pigmentepitheelcellen met BEST1-mutaties. Deze ziekte-in-een-schaal-methode ondersteunt onderzoek naar bestrofinopathieën en mogelijke celvervangingstherapieën.

Differentiatie, onderhoud en analyse van menselijke retinale Pigment epitheel cellen: een ziekte-in-a-schotel-Model voor BEST1 mutaties (Video) | JoVE Journal

Differentiatie, onderhoud en analyse van menselijke retinale Pigment epitheel cellen: een ziekte-in-a-schotel-Model voor BEST1 mutaties

Meer video's verkennen