Differentiatie, onderhoud en analyse van menselijke retinale Pigment epitheel cellen: een ziekte-in-a-schotel-Model voor BEST1 mutaties

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het veld van ionkanaalgerelateerde retinale ziekten over de moleculaire mechanismen van BEST1-mutaties en de pathologie van bestrophinopathieën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het de moeilijkheid om direct RPE-cellen van mensen te verkrijgen, omzeilt. De implicaties van deze techniek strekken zich uit tot de therapie van bestrophinopathieën, inclusief de ziekte van Best, omdat de RPE-cellen kunnen worden gebruikt voor zowel onderzoeksdoeleinden als celvervangende therapieën.

Wanneer de hPSC-cultuur confluency bereikt, vervang het cultuurmedium met vier milliliters differentiatiemedium per putje van een zes-putjesplaat. Na twee weken cultiveren, supplementeer het differentiatiemedium met 100 nanogram per milliliter humane activin-A, ververs het gesupplementeerde medium drie keer per week gedurende nog eens 14 dagen. Op dag 29, schakel over naar niet-gesupplementeerd differentiatiemedium voor nog eens acht tot tien weken totdat er gepigmenteerde RPE-celclusters verschijnen.

Om de gepigmenteerde RPE-cellen te isoleren, houdt u eerst individuele negen-duim glazen Pasteur-pipetten horizontaal over de vlam van een Bunsen-brander, ongeveer tweederde van de lengte van het dunne gedeelte van de pijp. Wanneer het verwarmde glas zacht wordt, trekt u snel de twee uiteinden uit elkaar om een microschraper-achtige punt te vormen aan het nieuwe uiteinde van de pijp. Spuit de getrokken pipetten met 70%ethanol en laat ze in een celcultuurkap drogen.

Wanneer de pipetten klaar zijn, was elk putje van de differentiatiecultuur met PBS en voeg een milliliter 0,05% trypsine toe, gesupplementeerd met één eenheid per microliter collageenase, aan elk putje. Na 20 tot 30 minuten bij 37 graden Celsius, stopt u de vertering met twee milliliter 37-graden Celsius RPE-medium per putje van een zes-putjesplaat en plaatst u de plaat op een microscooptafel. Gebruik een getrokken pijp om voorzichtig op de gepigmenteerde RPE-clusters te tikken.

Zodra de cellen loslaten van de bodem van het putje, gebruikt u een 20-microliter micropipet om gedissocieerde cellen over te brengen naar individuele putjes van een nieuwe celcultuurplaat met RPE-medium. Wanneer er ongeveer 5.000 RPE-cellen zijn toegevoegd aan elk putje van een 12-putjesplaat, brengt u het eindvolume op twee milliliter met vers RPE-medium en cultiveert u de geïsoleerde hPSC-RPE-cellen nog eens zes tot acht weken totdat een monolaag van gepigmenteerde en kasseienvormige volgroeide RPE-cellen wordt waargenomen. 24 tot 72 uur vóór de patch-clamp, wast u de gepigmenteerde monolaagcellen met twee milliliter PBS, vervolgens, na het verwijderen van het PBS, voegt u een milliliter 0,05% trypsine plus één eenheid per microliter collageenase toe aan de cellen in elk putje van een 12-putjesplaat voor een acht minuten durende incubatieperiode bij 37 graden Celsius.

Wanneer de cellen beginnen los te laten, gebruikt u een één-milliliter micropipet om de cellen voorzichtig van de bodem van het putje te wassen en de celsuspensie in een 15-milliliter conische buis te verzamelen. Voeg een milliliter 37-graden Celsius trypsine-collageenase-oplossing toe aan het putje. Incubeer nog eens acht minuten bij 37 graden Celsius, was vervolgens alle resterende cellen van de bodem van het putje en combineer de celsuspensie met dezelfde 15-milliliter conische buis.

Incubeer de cellen binnen een 37-graden Celsius droge bad gedurende acht minuten, gebruik vervolgens een één-milliliter micropipet om de cellen voorzichtig 10 tot 15 keer te tritureren. Na het incuberen en tritureren van de cellen nog twee keer, voegt u vijf milliliter 37-graden Celsius RPE-medium toe aan de enkelcelsuspensie en pellet de cellen door centrifugatie. Resuspendeer het pellet in het geschikte volume voor zaaien op vooraf gecoate platen met dekglas bij 10 tot 20%confluency en voer hele-cel patch-clamp uit volgens standaardprotocollen.

Na succesvolle isolatie, zou meer dan 90%van de cellen in de passage nul populatie moeten rijpen om de karakteristieke RPE-celmorfologie te vertonen. Met de hPSC-RPE-gebaseerde ziekte-in-een-schaal-benadering, kan elke patiëntspecifieke BEST1-mutatie volledig worden gekarakteriseerd op zijn eiwitexpressie, membraantransport en ionkanaalfunctie om kritieke informatie te verkrijgen voor het verduidelijken van RPE-pathologische mechanismen. Er moet worden opgemerkt dat sommige BEST1-mutaties de eiwitexpressie kunnen beïnvloeden, dus andere goed gevestigde RPE-markers moeten ook worden gecontroleerd.

Differentiatie van humane pluripotente stamcellen naar RPE-cellen duurt drie tot zes maanden, afhankelijk van de humane pluripotente stamcellijn en mutatietype, en isolatie van de gedifferentieerde humane pluripotente cellen kan worden voltooid in twee uur als het goed wordt uitgevoerd. Terwijl geprobeerd wordt de cellen te splitsen voor de patch-clamp, is het belangrijk om te onthouden de cellen heel voorzichtig te tritureren om overtollige celdood te voorkomen. Na deze procedure kunnen andere methoden zoals 3D RPE-celcultuur worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden over hoe iontransport op de apicale en basale membranen van RPE-cellen wordt beïnvloed door BEST1-mutaties.

Na de ontwikkeling van deze techniek, heeft het de weg gebaand voor onderzoekers op het gebied van retinale degeneratieve ziekten om de fysiologische fenotipen en pathologische mechanismen van patiëntafgeleide RPE-cellen te verkennen. Na het bekijken van deze video, zou u een goed begrip moeten hebben van hoe pluripotente stamcellen kunnen worden gedifferentieerd in retinale pigmentepitheelcellen en om de RPE-cellen voor hele-cel patch-clamp voor te bereiden.