Snelle, schaalbare montage en laden van bioactieve eiwitten en Immunostimulants in verschillende synthetische Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Wij geloven dat het gebruik van flash nanoprecipitatie om complexe nanostructuren samen te stellen, onderzoekers die geen uitgebreide ervaring hebben met chemie, techniek of nanomateriaalkunde, in staat zal stellen om zelfstandig geavanceerde geneesmiddelafgiftesystemen te fabriceren voor hun specifieke toepassingen en behoeften. Het grootste voordeel van deze techniek is de generatie van grote volumes van diverse nanostructuren met een hoge concentratie, lage polydispersiteit en geladen met bioactieve moleculen, inclusief kleine moleculaire geneesmiddelen en eiwitten, allemaal gevormd onder steriele omstandigheden. Over het algemeen kunnen individuen die nieuw zijn in polymeersynthese worstelen omdat de polypropyleensulfide component zeer gevoelig is voor oxidatie door blootstelling aan lucht.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal omdat de meerdere botsingsstappen moeilijk te leren zijn omdat ze zeer snel achter elkaar moeten worden uitgevoerd. Om de beperkte botsingsstralen, of CIJ-mixer, te steriliseren, werk binnen een biologische veiligheidskast om de mixer met alle gedemonteerde onderdelen in nul punt één molaire natriumhydroxide gedurende een nacht te laten weken. Monteer de CIJ-mixer weer in elkaar en laat endotoxine-vrij water door de mixer stromen met behulp van luerlock-spuitpompjes, test de pH van het water en blijf water laten stromen tot de pH neutraal is.

Om botsingsoplossing één voor te bereiden, weeg eerst 20 milligram van het gesynthetiseerde polymeer in een buisje van een punt vijf milliliter. Voeg dan hydrofobe kleurstoffen, geneesmiddelen of andere lading toe. Voeg ten slotte 500 microliter 100% tetrahydrofuran toe aan het polymeer en de lading, en meng krachtig om op te lossen.

Om botsingsoplossing twee voor te bereiden, lost de hydrofiele lading die in de polymeerblaasjes moet worden geladen op in 500 microliter van een waterige buffer. Voeg 2,5 milliliter van een waterige buffer naar keuze toe aan een reservoir van geschikte grootte. Plaats nu het reservoir onder de CIJ-mixer zodat de uitstroom van de mixer direct het reservoir binnenkomt.

Laad de botsingsoplossingen in afzonderlijke plastic wegwerpspuiten van één milliliter, bots de oplossingen tegen elkaar om gelijktijdig nanostructuren te vormen door spuiten in luerlock-adapters aan de bovenkant van de CIJ-mixer te steken. In een enkele, vloeiende en snelle beweging drukt u beide spuiten tegelijkertijd en met gelijke kracht in. Als er meerdere botsingen worden uitgevoerd, is het van cruciaal belang dat deze zo snel mogelijk worden uitgevoerd om het verlies van valtower organisch oplosmiddel te verminderen.

Om meerdere botsingen uit te voeren, verdeelt u de pas gevormde nanostructuuroplossing tussen twee spuiten en herhaalt u deze stap tot vier keer. Verzamel de uitstroom in het met waterige buffer gevulde reservoir en roer voorzichtig om te zorgen voor menging. Er zijn verschillende opties om de ongeladen lading en het organische oplosmiddel te verwijderen.

De nanocarrierformulering kan worden verwijderd door middel van exclusie door uitsnijden of ontzoutingskolom, door een tangentieel flow filtratiesysteem, door vacuüm drogen of door middel van dialyse zoals hier gedemonstreerd. Dialyseer de nanocarrierformulering in dezelfde waterige buffer en reservoir die voor botsing werd gebruikt. Gebruik buiswerk met een geschikte molecuulgewichtsgrenswaarde gedurende ten minste 24 uur, met ten minste twee bufferwisselingen.

Zodra de ongeladen lading uit het organische oplosmiddel is verwijderd, concentreert u de nanocarrierformulering met behulp van een spinconcentratorsysteem volgens de instructies van de fabrikant. Nanocarriers kunnen gedurende weken tot maanden worden bewaard bij vier graden Celsius. Vóór gebruik na opslag, moeten nanocarrierformuleringen kort worden gevormd.

Voer de fabricage van een hogesnelheids spuitpomp uit zoals beschreven in het tekstprotocol. Om de automatische uitvoermodus te gebruiken, selecteert u automatisch uitvoeren vanuit het hoofdmenu. Het systeem zal gebruikers vragen om de motor toe te staan de spuitexpulsieplatform automatisch naar het begin van de precisieschuifbaan te positioneren.

Zorg ervoor dat de weg voor en achter de metalen plaat vrij is voordat u verdergaat. Laad de CIJ-mixer in de rechthoekige opening van de achterste expulsiegedragen. Laad vervolgens plastic spuiten van één milliliter zoals eerder en monteer spuiten op de vrouwelijke lure connectoren van de CIJ-mixer.

Voordat u het instrument gebruikt, stelt u de gewenste motorsnelheid in en controleert u of het systeem vrij is zoals beschreven in het tekstprotocol. Om reagentia uit de spuiten en in de CIJ-mixer te drukken, drukt u op de knop 'uitvoeren' in de software-interface. Representatieve cryogeen transmissie-elektronenmicrografieën tonen kleinere en meer monodisperse polymerosomen na herhaalde botsingen.

Dynamische lichtverstrooiingsanalyse bevestigde een linkse verschuiving van de grootteverdeling van de polymerosomen na herhaalde botsingen. Na vijf herhaalde botsingen komen het gemiddelde diameter en de polydispersiteit van de polymerosomen overeen met die van de geëxtrudeerde monsters gevormd door rehydratatie van dunne films. Flash nanoprecipitatie kan worden gebruikt om een verscheidenheid aan hydrofobe en hydrofiele kleine moleculen en macromoleculen in polymerosomen te laden.

Hoewel deze methode inzicht kan geven in hoe immunotherapieën en vaccins functioneren, kan deze ook worden toegepast op het onderzoek naar hoe polymeren zichzelf assembleren in complexe nanostructuren. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden zoals intraveneuze of subcutane toediening aan diermodellen worden uitgevoerd om te bepalen welke celsubsets de nanodeeltjes internaliseren of wat de route van klaring is voor verschillende nanostructuren. De implicaties van deze techniek strekken zich uit naar de behandeling van hartziekten en kanker, evenals de ontwikkeling van vaccins voor infectieziekten, omdat deze nanocarriers meerdere geneesmiddelen kunnen richten op zeer specifieke immuuncellen.