Name: Ovariële weefselkweek te visualiseren verschijnselen in muis eierstok (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Leer ovariële weefselkweek om follikelontwikkeling en atresie te bestuderen in muizen. Deze methode maakt real-time observatie van eierstokprocessen onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Dr. Naojiro Minami (Universiteit van Kioto) voor het verstrekken van de Oog1pro3.9 muizen. Dit onderzoek werd gesteund door de JSPS (KAKENHI # JP15H06275) en de Stichting van de Nitto.

Muizen werden gehuisvest in een milieuvriendelijke gecontroleerde kamer op 23 ± 1 ° C met een 12 h licht/12 h donker cyclus. Dierenverzorgers protocollen en experimenten werden uitgevoerd overeenkomstig de richtsnoeren voor dier experimenten Aichi medische universiteit en door de zittende Animal Care en gebruik Comité zijn goedgekeurd.
1. voorbereiding van de voedingsbodem en gerechten
<ol><li>Toevoegen om te bereiden fundamentele kweekmedium, foetale runderserum (FBS, 5% v/v), FSH (100 mIU/mL), LH (10 mU/mL), en penicilline-streptomycine (100 U/mL penicilline; streptomycine, 100 mg/mL) minimale essentiële middellange Alfa (MEM-α) en mix in 50 mL tubes. Opmerking: Totale hoeveelheid vereiste voedingsbodems variëren tussen experimenten, maar 1 mL gestolde voedingsbodem is over het algemeen voldoende voor 3,5 cm glas-onder cultuur gerechten.</li>
	<li>Giet 1 mL aliquots van gemengde kweekmedium in 3,5 cm glas-onder cultuur gerechten en stel plaats 30 mm cel cultuur inzetstukken in gerechten. Vooraf warm media en gerechten in een incubator (5% CO2 en 37 ° C).</li>
</ol>2. voorbereiding van eierstokweefsel
<ol><li>Vooraf warm met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (−) en MEM-alpha met 5% FBS, 100 U/mL penicilline en 100 mg/mL streptomycine in een incubator (5% CO2 en 37 ° C). Opmerking: Ongeveer 3 mL aliquots van PBS (−) per eierstok volstaan voor gebruik tijdens de eierstok ontledingen en 1 mL aliquots van MEM-alpha volstaan voor tijdelijke opslag van één van de eierstokken in 3,5 cm schotels.</li>
	<li>
Accijnzen eierstokken van 4 - weken oude vrouwelijke ICR (de naam na de Instituut van kankeronderzoek) muizen en versiering van de weefsels rond de eierstok met schaar en pincet onder een stereoscopische Microscoop. De verwijderde eierstokken in een kweekvloeistof reserveren (zie stap 2.1) tot gebruik.
	<ol>
<li>Plaats één van de eierstokken op filterpapier bevochtigd met vooraf opgewarmd PBS (−) (zie stap 2.1) en snijd in 4 stukken met behulp van een microtoom mes onder een stereoscopische Microscoop. Opmerking: Eierstokken van 4 - weken oude ICR muizen zijn ongeveer 2 mm in diameter. Het aantal stuks is afhankelijk van de grootte van de eierstok; evenwel toestaan dat ongeveer 500 µm dikke stukken voor juiste follikel waarnemingen (in stukken dikker dan 500 mm, weefsel transparantie wordt verlaagd; in stukken dunner dan 500 mm, vele follikelgroei follikels zijn gebroken en verloren).</li>
		<li>Na dissectie, plaatst u de gesneden eierstok specimens in voorverwarmde kweekmedium in 3,5 cm schotels (zie stap 2.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ovariële weefselkweek
<ol><li>Drop ongeveer 0,5 µL cultuurmedium per gesneden ovariaal weefsel op de cel cultuur invoegen waar de ovariaal weefsel zal worden ingesteld met behulp van een micropipet.</li>
	<li>Plaats elk gesneden specimen in een druppel kweekmedium op de cel cultuur inzetstukken met pincet.</li>
	<li>Cultuur van de eierstok weefsels in 5% CO2 bij 37 ° C.</li>
	<li>Vervang het kweekmedium met verse voorverwarmde medium om de 2 dagen. Opmerking: Het schema voor middellange wijzigingen voor de cultuur van de eierstok secties van 4 - weken oude ICR muizen wordt gepresenteerd in Figuur 1.<ol>
<li>Voor het reproduceren van de LH-piek, gekweekte 4 - weken oude ICR muizen eierstokken te behandelen met het medium waarin 100 mU/mL FSH en LH voor 12u elke 4 dagen (Figuur 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Microscoop beelden van gekweekte eierstokken
<ol><li>Start de gekweekte eierstokken imaging na dag 1, wanneer de weefsels hebben gehouden op de cel cultuur inserts en confocal of omgekeerde Microscoop-analyses uitvoeren om voldoende groei van de follikel tussen tijdstippen tussenpozen 24 h. Opmerking: Confocale microscopie is superieur aan omgekeerde microscopie om follikels in hele gekweekte eierstokken te observeren.</li>
</ol>5. time-lapse beeldvorming van gekweekte eierstokken
<ol><li>
Optimaliseer de time-lapse imaging voorwaarden, waaronder laser intensiteiten en blootstelling tijden voor het imaging systeem (tabel 1).
	<ol>
<li>Selecteer gekoppelde eierstok exemplaren van één muizen voor gebruik als behandeling en controlegroepen. Variëren laser intensiteiten en belichtingstijd te bereiken de beste beelden (tabel 1).</li>
		<li>Vergelijk follikel groei onder de voorwaarde van elke cultuur door het meten van de follikel gebieden in beelden van controlemonsters 24u tussenpozen en time-lapse imaging monsters (zie stap 6). Gelijktijdig, het aantal algemeen eicellen in elke eierstok-set en kies de optimale time-lapse imaging voorwaarden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Opnamen tussenpozen 30 min met behulp van de time-lapse imaging systeem onder bepaalde voorwaarden (tabel 1).</li>
</ol>6. follikel groei analyse
<ol><li>
Meten om te analyseren de ontwikkeling van de follikel, de gebieden van de follikel in de opnames ImageJ softwarematig (http://resbweb.nih.gov/ij/).
	<ol>
<li>Aanvankelijk, stel de schaal van de afbeelding door te klikken op "Schaal ingesteld" onder "Analyseren" in de werkbalk. Voer de lengte van de zijde van de opname en het overeenkomstige aantal pixels in de lege velden van "De afstand van de bekende" en "Afstand in pixels", respectievelijk.</li>
		<li>Klik op "Vrije hand" in de werkbalk en een overzicht van de follikels in de beelden gevangen helder veld.</li>
		<li>Klik op "Maatregel" onder "Analyseren" in de werkbalk. Opmerking: Als andere meetgegevens gewenst zijn, klikt u op "meting" onder "Analyseren" in de werkbalk en schakel de juiste selectievakjes in de lijst.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. analyse van de ontwikkeling van de follikel met behulp van transgene muizen
<ol><li>Eierstokken van postnatale dagen 0 en 4 (P0 en P4) vrouwelijke transgene muizen met de transgenen Oog1pro3.9 R26-H2B-mCherr, en cultuur op inserts zoals beschreven in stappen 1.1 – 3.2, behalve niet plak de P0 en P4 eierstokken verzamelen.</li>
	<li>Vervang het kweekmedium met verse, voorverwarmde medium in 3,5 cm schotels in een broedmachine met 5% CO2 bij 37 ° C om de 2 dagen. Opmerking: De concentratie van LH in het kweekmedium van P0 en P4 eierstokken kan ongewijzigd omdat LH spanningspieken niet in P0 en P4 muizen komen.</li>
	<li>Stel de Microscoop te visualiseren alleen AcGFP1-positieve primaire follikels in de eierstokken van gekweekte P4 (tabel 1). Opmerking: Alleen primordiaal en primaire follikels zijn aanwezig in P4 vrouwelijke muis eierstokken.</li>
	<li>Foto's vastleggen van gekweekte P0 Oog1pro3.9/R26-H2B-mCherry transgene muizen eierstokken tussenpozen 30 min met behulp van de instellingen die worden gebruikt voor P4 eierstokken (zie stap 5.2).</li>
	<li>Traceren en analyseren van de follikel ontwikkelen met behulp van AcGFP1 en H2B-mCHerry signalen.</li>
</ol>

<ol><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li>
<li>Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+ovarian+follicular+dynamics+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.</a> Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).</li>
<li>Palma, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+biotechnology+of+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+World+J%22%5BJournal%5D)">Biology and biotechnology of follicle development.</a> Sci World J. , (2012).</li>
<li>Knight, P. G., Glister, C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16885529">TGF-beta superfamily members and ovarian follicle development.</a> Reproduction. 132 (2), 191-206 (2006).</li>
<li>Picton, H. M., Harris, S. E., Muruvi, W., Chambers, E. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19074213">The in vitro growth and maturation of follicles.</a> Reproduction. 136 (6), 703-715 (2008).</li>
<li>Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li>
<li>Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effect+of+follicle-follicle+interactions+and+declining+follicle-stimulating+hormone+on+murine+follicle+health+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro.</a> Biol Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).</li>
<li>Komatsu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Effect+of+Leukemia+Inhibitory+Factor+on+Follicular+Growth+in+Cultured+Murine+Ovarian+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Effect of Leukemia Inhibitory Factor on Follicular Growth in Cultured Murine Ovarian Tissue.</a> Biol Reprod. 93 (1), 18(2015).</li>
<li>Komatsu, K., Masubuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+concentration-dependent+effect+of+progesterone+on+follicle+growth+in+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">The concentration-dependent effect of progesterone on follicle growth in the mouse ovary.</a> J Reprod Dev. 63 (3), 271-277 (2017).</li>
<li>Murase, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+dynamics%3A+visualization+and+analysis+of+follicle+growth+and+maturation+using+murine+ovarian+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assist+Reprod+Genet%22%5BJournal%5D)">Follicle dynamics: visualization and analysis of follicle growth and maturation using murine ovarian tissue culture.</a> J Assist Reprod Genet. , 1-5 (2017).</li>
<li>Ishida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter+of+the+oocyte-specific+gene%2C+Oog1%2C+functions+in+both+male+and+female+meiotic+germ+cells+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The promoter of the oocyte-specific gene, Oog1, functions in both male and female meiotic germ cells in transgenic mice.</a> PLoS One. 8 (7), 68686(2013).</li>
<li>Minami, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oogenesin+is+a+novel+mouse+protein+expressed+in+oocytes+and+early+cleavage-stage+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Oogenesin is a novel mouse protein expressed in oocytes and early cleavage-stage embryos.</a> Biol Reprod. 69 (5), 1736-1742 (2003).</li>
<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+differentiation+factor-9+stimulates+progression+of+early+primary+but+not+primordial+rat+ovarian+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Growth and differentiation factor-9 stimulates progression of early primary but not primordial rat ovarian follicle development.</a> Biol Reprod. 67 (3), 1018-1024 (2002).</li>
<li>Nilsson, E. E., Kezele, P., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukemia+inhibitory+factor+%28LIF%29+promotes+the+primordial+to+primary+follicle+transition+in+rat+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Leukemia inhibitory factor (LIF) promotes the primordial to primary follicle transition in rat ovaries.</a> Mol Cell Endocrinol. 188 (1-2), 65-73 (2002).</li>
<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+morphogenetic+protein-4+acts+as+an+ovarian+follicle+survival+factor+and+promotes+primordial+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Bone morphogenetic protein-4 acts as an ovarian follicle survival factor and promotes primordial follicle development.</a> Biol Reprod. 69 (4), 1265-1272 (2003).</li>
<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kit+ligand+and+basic+fibroblast+growth+factor+interactions+in+the+induction+of+ovarian+primordial+to+primary+follicle+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition.</a> Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditional+reporter+mouse+lines+at+ROSA26+locus+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li>
<li>Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+oocyte-specific+expression+of+Cre+recombinase+activity+in+GDF-9-iCre%2C+Zp3cre%2C+and+Msx2Cre+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice.</a> Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).</li>
<li>Payer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stella-GFP+transgenic+mice%3A+a+novel+tool+to+study+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development.</a> Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).</li>
<li>Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive%2C+non-invasive+visualization+of+primordial+germ+cell+development+in+mice+by+the+Prdm1-mVenus+and+Dppa3-ECFP+double+transgenic+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter.</a> Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In deze studie ontwikkelden we twee nieuwe methoden voor het bestuderen van de ontwikkeling van de follikel in de eierstokken van de muis. De eerste methode houdt cultuur van gesneden ovariële volwassen muizen weefsels gevolgd door analyse van de ontwikkeling van de follikel en de tweede impliceert het gebruik van time-lapse imaging om te visualiseren van de vroege ontwikkeling van de follikel tijdens de gonadotrofinen-onafhankelijke-fase. Eerder, wij de huidige eierstok weefselkweek methode gebruikt ter beoordeling van ...

Vrouwelijke muis eierstokken verscheidene duizend follikels1bevatten, en periodieke ovulatie rijpt ongeveer tien eicellen op elke cyclus van estrus. Follikels zijn ingedeeld in verschillende ontwikkelingsstadia: primordial, primaire, secundaire, follikelgroei, en Graafian de follikels, afhankelijk van de vorm van de granulosa cellulaire laag rond elke oöcyt. Meeste primordiale follikels zijn slapende, en sommige van hen zijn geactiveerd en uitgroeien tot primaire follikels bij elke estrus cyclus2. Na de secundaire folliculaire fase, wordt ontwikkeling van de follikel voornamelijk geregeld door gonadotrofinen, folliculaire stimulerende hormoon (FSH) en het luteïniserend hormoon (LH). Echter, primordial en primaire follikel ontwikkeling is onafhankelijk van choriongonadotrofine, en de regulerende mechanismen die deze fasen regelen blijven slecht inderstood3,4,5. Naast de groeifactoren en hormonen, wordt de primordiale en primaire follikel geregeld door de interacties tussen follikels6,7. Dus we analyses van de follikel dynamics uitgevoerd in muis eierstok weefsels en onderzocht de bijbehorende regulerende mechanismen met behulp van ovariële weefselcultures8,9,10.
Hierin, introduceren we twee methoden in webobjectmodel ovariële weefselkweek. De eerste wordt gebruikt voor het analyseren van de follikel ontwikkeling door meting van de folliculaire gebieden, en de tweede wordt gebruikt voor het bestuderen van het reguleringsmechanisme tijdens de vroege ontwikkeling van de follikel van primordial naar secundaire follikel fase met transgene muizen. Voor de analyse van de ontwikkeling van de follikel, we voornamelijk gebruikt eierstokken van 4 - weken oude vrouwelijke muizen omdat zij toestaan voor eenvoudige visualisatie van follikels. Om periodieke ovulatie en model in vivo de ontwikkeling van de follikel, wij gereproduceerd LH-piek en waargenomen ovulatie, follikel atresie en secretie van oestradiol weefselkweek omstandigheden. Beelden van de gekweekte eierstokken werden gevangen genomen en de ontwikkelingsprocessen follikel werden geanalyseerd door tracering veranderingen in de folliculaire gebied. In heldere veld microscopie analyses was het onderscheid tussen primordiale en vroege primaire follikels echter onduidelijk. Zo ontwikkelden we een methode voor het detecteren van kleine follikels en onderscheid maken tussen de primordiale, primair, en secundair follikel in gekweekte ovariële weefsels met behulp van Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 en de R26-H2B-mCherry transgene muizen eierstokken op dag 0 en 4 na geboorte11. Oog1 uitdrukking is aantoonbaar in eicellen na inwerkingtreding meiose, en geleidelijk aan toeneemt met de ontwikkeling van de follikel, waardoor observatie van de overgang van primordial naar primaire follikels met behulp time-lapse beelden van gekweekte eierstok weefsel11 ,12. Hoewel de morfologische methodes zijn gebruikt om de studie van de factoren die activeren van sluimerende primordiale follikels13,14,15,16, is ontwikkeling van de fysiologische follikel in de eierstokken moeilijk te observeren, en de gevolgen van verschillende factoren blijven genfunctieonderzoek. De huidige cultuur-methoden werden ontworpen om aan te pakken van deze schaarste in real-time analyses van doel factoren.
In de huidige studie, we bijgehouden folliculaire ontwikkelen met behulp van een time-lapse beeldvorming methode en het proces van ontwikkeling van de follikel gekenmerkt. Onze nieuwe methoden bieden een ongekende hulpmiddel voor het onderzoeken van de Fysiologie van de eierstokken.

<table><tbody><tr><td>Follicle stimulerend hormoon uit menselijke hypofyse</td><td>SIGMA</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>Luteïniserend hormoon uit paardenhypofyse</td><td>SIGMA</td><td>L9773</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine oplossing</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>MEM a, GlutaMax, geen nucleotiden</td><td>Thermo Fisher</td><td>32561037</td><td></td></tr><tr><td>Glasbodemschaal</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>35mm schaal, No. 0 dekglas, 10mm glasdiameter</td></tr><tr><td>Millicell celkweekinsert</td><td>Merck Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>Diameter: 315 mm, poriegrootte: 0,4 mm, materiaal: hydrofiel PTTE</td></tr><tr><td>3,5 cm celkweekschalen</td><td>greiner bio-one</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>50 ml / centrifugeerbuis met drievoudig afsluitdop</td><td>IWAKI</td><td>2345-050</td><td></td></tr><tr><td>Laagprofiel wegwerpmessen 819</td><td>Leica</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Confocale microscoop</td></tr><tr><td>CellVoyager, CV1000</td><td>Yokogawa Electric Corporation</td><td></td><td>Time-lapse beeldvorming</td></tr><tr><td>BZ-X700</td><td>KEYENCE</td><td></td><td>Time-lapse beeldvorming</td></tr></tbody></table>

ovariële weefselkweek te visualiseren verschijnselen in muis eierstok

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Zoogdieren vrouwtjes eisprong periodiek een bijna constante aantal eicellen tijdens elke cyclus van estrus. Om dergelijke regelmaat en periodiciteit, verordening treedt op op het niveau van de hypothalamische-hypofyse-gonadale as en op de ontwikkeling van de follikels in de eierstokken. Ondanks actieve studies zijn follikel ontwikkelingsmechanismen niet duidelijk, vanwege de verschillende stappen van de activering van de slapende primordiale follikel tot ovulatie, en de complexiteit van de verordening dat verschilt in elk folliculaire fase. Voor het onderzoek naar de mechanismen van ontwikkeling van de follikel en de dynamiek van de follikels gedurende de gehele estrus cyclus, we een muis ovariële weefselkweek model ontwikkeld dat kan worden gebruikt voor het observeren van de follikel ontwikkelen met behulp van een microscoop. Systematische follikel ontwikkeling, periodieke ovulatie en follikel atresie kunnen alles worden gereproduceerd in de gekweekte ovarium-model en de kweekomstandigheden experimenteel kunnen worden gedifferentieerd. We laten hier zien het nut van deze methode in de studie van de regelgevende mechanismen van ontwikkeling van de follikel en andere ovariële verschijnselen.

Figuur 1 toont het protocol voor wijzigingen in de media tijdens ovariële weefselkweek. Na dit programma 4-week-oude ICR muizen eierstokken werden gekweekt en beeld intervallen van 24 uur met behulp van de confocal microscopie (Figuur 2). Tijdens de cultuur van de eierstok weefsels voor 3 weken, meest follikelgroei en secundaire follikels zijn gedegenereerd door follikel atresie en sommige waren algemeen (Fig...

Ovariële weefselcultures kan worden gebruikt als modellen van follikel ontwikkeling, ovulatie en follikel atresie en regulerende mechanismen van dynamische ovariële processen aan te geven.

Ovariële weefselkweek te visualiseren verschijnselen in muis eierstok

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het onderzoeksgebied van de eierstokken over follikelontwikkeling, follikelatresie en operatie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat we de ovariële fenomenen onder gecontroleerde kweekcondities kunnen reproduceren voor observatie in real time. Om de eierstokken van een vier weken oude Institute of Cancer Research muis voor te bereiden op kweek:Gebruik schaar en pincet om het omliggende weefsel van de eierstokken onder een stereomicroscoop te trimmen, en plaats de schoongemaakte eierstokken in een schaal met vers kweekmedium.Wanneer alle eierstokken zijn getrimd, breng dan de individuele eierstokken over op een stuk filterpapier bevochtigd met PBS van 37 graden Celsius, en gebruik een microtoomblad om elke eierstok in vier stukken te snijden. Breng de plakjes over in een 3,5 centimeter schotel met kweekmedium van 37 graden Celsius, en gebruik een micropipet om een druppel kweekmedium van ongeveer 0,5 micrometer toe te voegen op een celkweekinsert per sectie van ovarisch weefsel. In een tweede 3,5 centimeter glazen bodem celkweekschaal met één millimeter medium:Gebruik pincet om één weefselmonster in elke druppel over te brengen en plaats de plaat in een celkweekincubator.Vervang het supernatant in de schaal elke twee dagen door vers kweekmedium van 37 graden Celsius en behandel de eierstokken elke vierde dag gedurende 12 uur met 100 millieenheden per milliliter van FSH en LH. Begin met het afbeelden van de gekweekte eierstokken elke 24 uur na één dag kweek om voldoende follikelgroei tussen de beeldsessies mogelijk te maken;beelden vastleggen met intervallen van 30 minuten met behulp van een time-lapse beeldvormingssysteem onder de juiste experimentele omstandigheden. Om de ontwikkeling van ovariële follikels te analyseren:Open de beelden in ImageJ en open het analysemenu om schaal instellen te selecteren.Voer de zijlengtes van de vastgelegde beelden en de overeenkomstige aantallen pixels in de bekende afstand en afstand in pixels velden in, respectievelijk. Gebruik vervolgens het free-hand gereedschap om de follikels te omlijnen en klik op meten. Tijdens een drie weken durende kweekperiode van ovariële weefselsnijdingen, zijn de meeste antrale en secundaire follikels gedegenereerd door follikelatresie, en sommige zijn geovuleerd.Sommige follikels ontwikkelen zich in groepen tijdens elke LH-piekcyclus. Hoewel de timing van de ovulatie en het aantal geovuleerde eicellen verschilt tussen muizeneierstokken, vindt ovulatie van gekweekte eierstokken overwegend binnen 48 uur na elke LH-piek plaats. Merk op dat niet alle geovuleerde eicellen de eerste polaire lichamen vrijgeven na de ovulatie.Primordial en primaire follikels zijn tegelijkertijd aanwezig in postnatale dag vier muizeneierstokken. Terwijl alleen primordiale follikels aanwezig zijn in postnatale dag nul eierstokken. Echter, primaire follikels worden detecteerbaar in gekweekte postnatale dag nul eierstokken na 30 tot 40 uur van kweek zoals aangetoond.Primordial en primaire follikels kunnen ook worden onderscheiden in de gekweekte eierstokken geïsoleerd uit mCherry transgene dieren door de mCherry positieve kernen van granulosacellen;waardoor het volgen van de follikelstadia in de ovarische weefselsnedekweek mogelijk is. Ik hoop dat deze techniek de weg vrijmaakt voor onderzoekers op het gebied van reproductieve technologie om nieuwe technieken voor vruchtbaarheidsbehandeling te verkennen.

ovarian-tissue-culture-to-visualize-phenomena-in-mouse-ovary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Ontwikkelingsbiologie

Cultuur van normale cellen in hun drie-dimensionale context is een alternatieve methode voor vroege gebeurtenissen die nodig is voor cellulaire transformatie en tumorvorming te bestuderen. Deze methode wordt gebruikt om de normale eierstokken en oviductal cellen groeien naar vroege gebeurtenissen bij eierstokkanker vorming te bestuderen.

Alginaat Hydrogelen voor Three-Dimensional orgelcultuur van de eierstokken en eileiders

Dit protocol beschrijft de primaire cultuur / co-cultuur van de muis eierstokweefsel, met behulp van de eierstokken van pasgeboren muizen en individuele ovariële follikels van prepuberale muizen. De kweektechnieken ondersteunen In een sterk fysiologische wijze, waardoor onderzoek naar het effect van extrinsieke middelen op de eierstok en interacties tussen ovariële follikels.

Cultuur en co-cultuur van de Muis eierstokken en ovariële follikels

Hier presenteren we een protocol om te kwantificeren follikels in gekweekte eierstokken van jonge Muizen zonder seriële segmenteren. Met behulp van hele orgel immunofluorescentie en weefsel wissen, is fysieke segmenteren vervangen door optische segmenteren. Deze methode voor de bereiding van de monsters en visualisatie handhaaft integriteit van orgel en vergemakkelijkt geautomatiseerde kwantificering van specifieke cellen.

Hele Mount immunofluorescentie en follikel kwantificering van gekweekte muis eierstokken

In vitro cultuur van runder ovarium cortex en het effect van nutritionele trap-stap dieet op ovariële micro-omgeving wordt gepresenteerd. Ovariële cortexstukken werden gedurende zeven dagen gekweekt en steroïden, cytokines en follikelstadia werden geëvalueerd. De Stair-Step dieetbehandeling had een verhoogde steroidogenese, wat resulteerde in follikelprogressie in cultuur.

Bovine Ovarian Cortex Weefselkweek

Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het in beeld brengen van hele eierstokken voor kwantitatieve en kwalitatieve analyses met behulp van whole-mount immunostaining, multifotonenmicroscopie en 3D-visualisatie en -analyse. Dit protocol biedt een hoge doorvoer, betrouwbare en herhaalbare verwerking die van toepassing is op toxicologie, klinische diagnostiek en genomische testen van de ovariële functie.

Whole Ovary Immunofluorescentie, Clearing en Multiphoton Microscopie voor kwantitatieve 3D-analyse van de zich ontwikkelende ovariële reserve bij muizen

We beschrijven methoden om somatische cellen van muis-ovariumcellen te isoleren uit een stroma-verrijkte fractie van de eierstok en om somatische organoïden van muis-ovarium te genereren met een steigervrije benadering.

Onderzoek naar de ovariummicroomgeving: Methoden voor isolatie, 2D-kweek en organoïde kweek van somatische cellen van muis eierstokcellen

Hier presenteren we een protocol dat een hulpmiddel biedt om regulerende mechanismen van specifieke genen tijdens de ontwikkeling van de hippocampus te onderzoeken. Het gebruik van ex utero elektroporatie en organotypische plakcultuur maakt de op- en neerregulatie van de expressie van genen van belang in enkele cellen mogelijk en volgt hun lot tijdens de ontwikkeling.

Ex Utero Electroporatie en Organotypische Slice Cultuur van de muis hippocampus Tissue

Het doel van dit protocol is een verliesgevende beschrijven en gain-of functiemethode dat geldt voor neogenin identificeren als een stadium-specifieke receptor die tot trophectoderm en binnenste celmassa differentiatie van pre-implantatie muizenembryo's is.

Verlies- en Gain-of-function Aanpak Early Cell Fate Determinanten Onderzoek in Pre-implantatie muizenembryo&#39;s

Dit werk demonstreert een nieuwe aanpak om het proliferatie-, differentiatie- en vaartuigvormende potentieel van vasculaire endotheliale stamcellen (VESC's) te beoordelen door middel van transpiratie van de dikke dikvliesvoeding, gevolgd door een full-mount weefselbereiding voor microscopische observatie. Ook wordt een lineage-tracingsstrategie om het gedrag van VESC's in vivo te onderzoeken, ook voorgesteld.

Een nieuwe Mammary Fat Pad Transplantation Technique om de Vessel Generation van Vasculaire Endotheliale Stamcellen te visualiseren

Hier presenteren we een protocol voor live imaging van muis secundaire paletfusie met behulp van confocale microscopie. Dit protocol kan worden gebruikt in combinatie met een verscheidenheid aan fluorescerende reporter muis lijnen, en met pathway inhibitors voor mechanistisch inzicht. Dit protocol kan aangepast worden voor livebeelden in andere ontwikkelingssystemen.

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

Leer ovariële weefselkweek om follikelontwikkeling en atresie te bestuderen in muizen. Deze methode maakt real-time observatie van eierstokprocessen onder gecontroleerde omstandigheden mogelijk.

Ovariële weefselkweek te visualiseren verschijnselen in muis eierstok

Meer video's verkennen