Efficiënte reiniging en LC-MS/MS-based Assay ontwikkeling voor tien-elf translocatie-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in epigenetica en TET2 bemiddelde 5-Methylcytosine demethylatie veld een dergelijke analyse van de activiteit van normale en klinische TET2 mutaties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat native TET2 in één stap kan worden gezuiverd en dat de activiteit ervan kan worden geanalyseerd in termen van vorming van alle drie de producten. Verschillende afgestudeerde studenten zullen de procedure demonstreren.

De eiwitzuivering wordt uitgevoerd door Chayan Bhattacharya, de TET2-test van Aninda Sundary Dey en de LC-MS/MS-analyse door Navid Ayon. Voeg voor bacteriële transformatie één microliter recombinant pDEST 14-doelexpressievector toe die niet-getagged menselijke TET2 dioxygenase bevat aan 100 microliter chemisch bevoegde E.coli BL21 DE3-cellen in een buis van 1,7 milliliter. Na incubatie op ijs gedurende ten minste 15 minuten, warmte schok het mengsel op 42 graden Celsius gedurende 30 seconden in een waterbad.

Onmiddellijk na hitteshock, plaats de cellen terug op ijs voor een minimum van twee minuten. Voeg hierna 250 microliters superoptimale bouillon met katabole onderdrukking toe aan cellen. Broed de bacteriële cellen gedurende een uur bij 37 graden Celsius in een shaker.

Na incubatie, spin de cellen door centrifugeren de buis op 9,000 keer de zwaartekracht voor een minuut. Gooi 70% van de supernatant door pipetteren, en los de pellet in de resterende media. Verdeel de celsuspensie op een Lirua bouillonplaat met 100 microgram per milliliter ampicilline.

Broed de plaat 16 uur uit bij 37 graden Celsius. Selecteer een geïsoleerde kolonie, en inenten in 10 milliliter LB ampicilline media. Incubeer de buis op 37 graden Celsius in een shaker 's nachts.

Gebruik hierna 100 microliter bacteriële cultuur om 100 milliliter LB ampicillinemedia als primaire cultuur in te enten. Incubeer de buis op 37 graden Celsius in een shaker 's nachts. De volgende dag, inenting 15 kolven, elk met 600 milliliter LB ampicilline media met zes milliliter primaire cultuur per fles.

Incubeer de kolven bij 37 graden Celsius op een shaker bij 180 RPM. Om de dichtheid van de bacteriële cultuur te controleren, meet de optische dichtheid op 600 nanometer, of OD600, met behulp van een spectrofotometer. Nadat de cultuur een dichtheid van 0,8 bij OD600 heeft bereikt, induceert u de expressie van TET2-eiwit met 300 microliters van één molaire IPTG in elke kolf en kweekt u de cultuur nog eens 16 uur bij 17 graden Celsius.

Na incubatie, breng de bacteriële cultuur naar centrifuge flessen. Centrifugeren de bacteriële cultuur die het TET2-enzym uitdrukt bij 5, 250 keer zwaartekracht gedurende 45 minuten. Gebruik de bacteriële pellet voor TET2 zuivering.

Werken op ijs of op vier graden Celsius, opnieuw opschorten de bacteriële pellet in 100 milliliter van 50-millimolar MES buffer, pH zes. Neem dan vijf milliliter van de cel suspensie, en breng het naar 45 milliliter met de buffer. Soniceer de vering gedurende vijf keer 30 seconden op power 20, met koelintervallen van 60 seconden.

Draai het lysaat 45 minuten lang op 5, 250 keer zwaartekracht. Verzamel het supernatant met het oplosbare TET2-enzym en geef het door 0,45 micronfilters voordat u het op een FPLC-systeem laadt. Verpak 30 milliliter van een sterke kationuitwisselingsreren in een FPLC-kolom.

Equilibrate de kolom met 10 bed volumes van wasbuffer bij de constante stroomsnelheid van 0,3 milliliter per minuut met behulp van een FPLC-systeem. Laad het verduidelijkte lysaat op de vooraf geëquilibreerde kolom en was met ongeveer 10 bedvolumes wasbuffer totdat de doorstroom duidelijk wordt. Elute TET2 met een nul tot 10% helling van de wasbuffer naar de elutiebuffer in 15 bedvolumes, gevolgd door een hold op 10%elutiebuffer voor twee bedvolumes.

Verzamel 100 microliter monsters van cellysate voor en na kolom laden, samen met alle elution breuken, en analyseren op 10% oplossen SDS-PAGE gel. Verpool de fracties met TET2-eiwit en vries het eiwit in. Los het enzym vervolgens op in 10 milliliter water en bewaar het bij min 80 graden Celsius.

Voer alle demethylatiereacties uit in drievoud met drie microgram substraat. Voeg 100 microgram gezuiverd TET2-enzym toe aan 50 microliter totale reactiebuffer. Na een uur incubatie op 37 graden, blus de TET2 gekatalyseerde oxidatiereacties met vijf microliters van 500-millimolar EDTA.

Om monsters voor te bereiden op analyse, scheidt u het DNA van het TET2-reactiemengsel door eerst 100 microliter Oligo-bindingsbuffer toe te voegen aan 55 microliters van gebluste reactie. Voeg hierna 400 microliter van 100% ethanol toe aan het mengsel. Geef dit mengsel door een Oligo bindingskolom.

Na het wassen van de gebonden DNA met 750 microliters van wasbuffer, elute het DNA in 20 microliter water. Vererf het geïsoleerde DNA met twee eenheden DNase I en 60 eenheden S1 nuclease bij 37 graden Celsius gedurende 12 uur om individuele nucleoside monofosfaten te produceren. Na de spijsvertering, voeg twee eenheden van kalf darm-alkalische fosfor fosfatase aan de monsters.

Incubeer voor een toevoeging 12 uur bij 37 graden Celsius om de terminale fosfaatgroepen uit de nucleoside monophosfaten te verwijderen en de nucleosides te verkrijgen. Bereid een 100-micromolar stock oplossing van alle gemodificeerde cytosine nucleosiden, en de normale DNA-basen in HPLC-grade water voor de ontwikkeling van de LC-MS / MS methode. Optimaliseer de nucleoside-afhankelijke MS/MS-parameters door voorraadoplossingen één voor één in de massaspectrometer in te brengen met een stroomsnelheid van 10 microliters per minuut in de verbeterde MS-scanmodus.

Verschillende parameters kunnen worden geoptimaliseerd met behulp van de geautomatiseerde kwantitatieve optimalisatie functie van de software voor elke DNA-kern. Optimaliseer op dit punt de resterende parameters voor elke DNA-kern met behulp van de handmatige kwantitatieve optimalisatiefunctie van de software in de analysemodus van de stroominjectie. Optimaliseer nu bronafhankelijke MS/MS-parameters door 10 microliter voorraadoplossing te injecteren met behulp van een verloop met 25%oplosmiddel B met een stroomsnelheid van 0,3 milliliter per minuut.

Om alle acht DNA-kernen te scheiden, voert u vloeibare chromatografie uit zoals beschreven in het tekstprotocol op een C18-kolom. Tot slot detecteren en kwantificeren van alle nucleosiden met behulp van de LC-MS / MS methode in standaard curven. Aangezien het katalytische domein van TET2 een relatief hoog isoelectisch punt heeft in vergelijking met de meeste inheemse E.coli-eiwitten, werd een efficiënt zuiveringsproces ontwikkeld dat gebruik maakt van een kationuitwisselingschromatografie.

Deze zuivering leverde meer dan 90% zuiver TET2 enzym in een enkele stap. Om verschillende deoxycytidinederivaten en de vier natuurlijke DNA-basen na de TET2-enzymatische reactie te scheiden en te kwantificeren, werd een gevoelige LC-MS/MS-gebaseerde test geoptimaliseerd. Standaardkrommen werden getekend met behulp van seriële verdunningen van een mengsel dat alle nucleosiden bevat.

De resultaten van de vloeibare chromatografie MS/MS methode worden hier getoond. De methode maakt scheiding en kwantificering van de vier normale DNA-basen mogelijk, evenals de vier gemodificeerde cytosinebases. In deze experimentele procedure beschrijven we het klonen van niet-getagged menselijk TET2 dioxynase-katalytisch domein met behulp van sitespecifieke recombinatietechniek en een voldoende expressie in een doelvector in E.Coli.

We hebben het niet-gezuiverde TET2-enzym efficiënt gezuiverd met behulp van kationuitwisselingchromatografie om meer dan 90% zuiverheid te leveren in één stap. Verder hebben we een nieuwe vloeibare chromatografiemethode ontwikkeld om de vier normale DNA-basen en de vier gemodificeerde cytosinebasissen te scheiden. Om de acht nucleosides van TET2 gekatalyseerde reacties te kwantificeren, hebben we onze verbeterde vloeibare chromatografiemethode gekoppeld aan tandemmassaspectrometrie.

De gevoelige LC-MS/MS-test werd vervolgens gebruikt om de activiteit van recombinant untagged menselijk TET2-enzym te bepalen. De hier beschreven aanpak zal de waardering van wild-type en mutant TET2 dioxygenase sterk verbeteren.