Name: Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Leer een verfijnde gist 2-hybrid methode voor batchverwerking om eiwitinteracties te vergelijken met deep sequencing. Deze aanpak identificeert differentiële interactiomen en verbetert het onderzoek naar complexe moleculaire netwerken.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken het personeel binnen het Instituut voor menselijke genetica voor NGS bibliotheek voorbereiding en sequencing. Wij danken Einat Snir voor haar expertise bij de voorbereiding van genomic bibliotheek fragmenten van de Y2H plasmide bibliotheek gemaakt hier. Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 en door NSF onderzoek projectsubsidie: 1517110.

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid%2C+a+powerful+tool+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li>
<li>Vidal, M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+two-hybrid+assay%3A+still+finding+connections+after+25+years%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The yeast two-hybrid assay: still finding connections after 25 years.</a> Nature Methods. 11 (12), 1203-1206 (2014).</li>
<li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li>
<li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li>
<li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li>
<li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).</li>
<li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrY2H-seq%3A+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li>
<li>Estojak, J., Brent, R., Golemis, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+of+two-hybrid+affinity+data+with+in+vitro+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Correlation of two-hybrid affinity data with in vitro measurements.</a> Molecular and Cellular Biology. 15 (10), 5820-5829 (1995).</li>
<li>Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+yeast+two-hybrid+systems+using+the+interactions+of+bacterial+motility+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins.</a> Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).</li>
<li>James, P., Halladay, J., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+libraries+and+a+host+strain+designed+for+highly+efficient+two-hybrid+selection+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast.</a> Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).</li>
<li>Barbas, C. F. 3rd, Burton, D. R., Scott, J. K., Silverman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+DNA+and+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Quantitation of DNA and RNA.</a> CSH Protoc. 2007, pdb ip47(2007).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22485921">SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (4), (2006).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
<li>Alegria-Schaffer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Western+blotting+using+chemiluminescent+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Western blotting using chemiluminescent substrates.</a> Methods in Enzymology. 541, 251-259 (2014).</li>
<li>Plank, J. Practical application of Phenol/Chloroform extraction. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/">http://bitesizebio.com/3651/practical-application-of-phenolchloroform-extraction/</a> (2018).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. (62), (2012).</li>
<li>Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p21+Cdk-interacting+protein+Cip1+is+a+potent+inhibitor+of+G1+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases.</a> Cell. 75 (4), 805-816 (1993).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

Hier bieden we een gids voor het uitvoeren van de Y2H tests in batch met behulp van geoptimaliseerde methoden. Er zijn een paar kritische stappen in de procedure om ervoor te zorgen dat de bevolking van gist die zou worden geplaatst onder selectie representatief voor de startende bibliotheek is en dat genoeg van de startende gist bevolking wordt gebruikt voor het ondergaan van de selectie te beperken variabiliteit . Nog belangrijker is, is deze benchmarks zijn relatief gemakkelijk te bereiken naast de aanpassing van de m...

Een volledig inzicht in biologische processen van de cel is afhankelijk van het vinden van de Eiwit-interactienetwerken die ten grondslag liggen aan hun moleculaire mechanismen. Een benadering te identificeren eiwitinteractie is de gist 2-hybrid assay (Y2H), die werkt door het monteren van een goed functionerende chimeer transcriptiefactor zodra twee domeinen van de proteïne van belang aan elkaar1 binden. Een typische Y2H scherm wordt uitgevoerd door het creëren van een bevolking van gist dat huizen van beide een bibliotheek van plasmiden, interacterende eiwitten, gesmolten tot een transcriptionele activator codering (bv., 'prooi' fusieproteïne) en een bepaalde 'lokaas' plasmide bestaat uit het eiwit gesmolten tot een DNA-bindende-domein (bijvoorbeeld, de Gal4 DNA-bindend domein dat zich aan de Gal4-upstream activerend volgorde bindt) van belang. Een van de belangrijkste voordelen van de Y2H-aanpak is dat het is relatief eenvoudig en goedkoop uit te voeren in een typische laboratorium voor moleculaire biologische routinewerk2 uitgerust. Echter als traditioneel uitgevoerd, monsters een gebruiker afzonderlijke kolonies die zich bij de selectie voor een positieve interactie met de Y2H voordoen. Dit beperkt ernstig het aantal bibliotheek 'prooi' klonen die kunnen worden onderzocht. Dit probleem wordt nog verergerd wanneer de overvloed aan een bepaalde interactie prooi zeer hoog ten opzichte van de anderen is, het afnemen van de kans op interactie van lage overvloed prooi plasmiden opsporen.
Een oplossing voor het gebruik van het Y2H-beginsel in de uitgebreide dekking van de Proteoom is het gebruik van een matrix-indeling aanpak waarin een array met daarin bekende individuele prooi plasmiden digitaal kan worden ondervraagd. Een dergelijke benadering vereist echter een infrastructuur die niet gemakkelijk toegankelijk te laten of kosteneffectieve aan individuele onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het definiëren van de interactome van een klein aantal proteïnen of domeinen3. Bovendien zou zeer complexe prooi bibliotheken die meerdere fragmenten van interacterende eiwitten kunnen coderen de grootte van deze matrix arrays uitbreiden naar onpraktisch maten. Een alternatief is het uitvoeren van testen met complexe bibliotheken in batches en beoordelen van de aanwezigheid van interagerende klonen met massale parallelle high-throughput sequencing4. Dit kan worden toegepast om de test op de aanwezigheid van plasmiden met prooi, die zich voordoen in meerdere kolonies met behulp van een typische Y2H opgemaakt aanpak in welke gist cellen huisvesting een interactie paar fusion eiwitten zijn toegestaan om te groeien op een plaat5,6. Dit algemene idee kan worden geaccentueerd ter vergroting van de query van beide meerdere aas en prooi onderdelen op de dezelfde tijd7,8.
Toch veel onderzoeken vereisen dat een gemakkelijker nog meer gericht inspanning op slechts een paar eiwit 'lokaas' en meer kunnen profiteren door een uitputtende en semi-kwantitatieve-query van een enkele complexe prooi-bibliotheek. Wij hebben ontwikkeld en gevalideerd van een aanpak voor het uitvoeren van grootschalige eiwit interactie studies gebruik te maken van een Y2H principe in batch formaat4. Deze maakt gebruik van het tempo van de expansie van een specifieke prooi plasmide als een proxy voor de relatieve sterkte van Y2H interactie9. Diepe sequentiebepaling van alle plasmiden binnen een populatie onderworpen aan normale groei of selectieve groei omstandigheden produceert een volledige kaart van klonen dat de opbrengst van de sterke en zwakke Y2H interacties. Het repertoire van interactors kan worden verkregen en rechtstreeks met elkaar vergeleken in meerdere aas plasmiden. De resulterende workflow genoemd DEEPN (dynamische verrijking voor evaluatie van de netwerken van de eiwitten) kan dus worden gebruikt om te identificeren van differentiële interactomes uit de dezelfde prooi bibliotheken te identificeren van eiwitten, waardoor vergelijking tussen één eiwit vs. andere.
Hier tonen we DEEPN en verbeteringen in de laboratoriumtechnieken die vergemakkelijken het gebruik ervan, die worden beschreven in Figuur 1. Belangrijke verbeteringen zijn onder andere:
Generatie van prooi gist bevolking. Een van de belangrijkste vereisten van DEEPN is het genereren van populaties van gist met verschillende aas plasmiden die de dezelfde verdeling van de plasmide prooi bibliotheken hebben. Gelijkwaardige basislijn populaties van de prooi plasmide bibliotheek zijn essentieel voor hetgeen een exacte vergelijking tussen de interactomes van verschillende lokaas. Dit gebeurt best bij een plasmide bibliotheek al is gehuisvest in een haploïde gist bevolking en een bepaalde aas plasmide betreden die bevolking wordt bereikt door de paring voor de productie van een diploïde. Wij bieden hier een duidelijke handleiding in hoe te maken van dergelijke populaties commerciële bibliotheken gehuisvest in haploïde gist gebruiken. Hoewel we vonden de methoden die het genereren van een groot aantal ze, was de paring totaalrendement van deze commerciële bibliotheek-bevattende giststammen laag. Dus we hebben gebouwd een nieuwe spanning die kan huis prooi bibliotheken die veel meer ze per paring reactie oplevert.
New set van aas plasmiden. Veel huidige plasmiden die uitdrukking geven aan 'lokaas' fusion eiwitten bestaat van de proteïne van belang en een DNA-bindende domein zijn 2µ gebaseerde, waardoor ze hun exemplaaraantal versterken. Deze exemplaaraantal kan heel variabel in de bevolking en leiden tot variabiliteit in het Y2H transcriptionele antwoord. Dit kan op zijn beurt de mogelijkheid om te meten de sterkte van een bepaald eiwit interactie op basis van de reactie van de groei van cellen onder selectie scheeftrekken. Dit kan gedeeltelijk adres met behulp van een laag kopie plasmide, waarvan sommige eerder zoals de verkrijgbare pDEST3210 beschreven zijn. We hebben een nieuwe aas plasmide (pTEF-GBD) die produceert Gal4-DNA-bindende domein fusion eiwitten binnen een TRP1 laag kopie centromeer gebaseerde plasmide uitvoering van het Kanr-resistentie gen waarmee ook klonen van aas fragmenten, zowel stroomopwaarts gebouwd en stroomafwaarts van het domein van Gal4 DNA-bindende.
Nieuwe High-Density Y2H fragment library. We gebouwd een nieuwe plasmide naar huis Y2H prooi bibliotheken en gebruikt het om te bouwen van een uiterst complexe Y2H bibliotheek gemaakt van willekeurig sheared fragmenten van genomic DNA van Saccharomyces cerevisiae. Sequentieanalyse toonde aan dat deze bibliotheek had meer dan 1 miljoen verschillende elementen, veel complexer dan hierboven beschreven gist genomische Y2H plasmide bibliotheken11. Met deze nieuwe bibliotheek waren we kunnen laten zien dat het DEEPN werkstroom robuust genoeg is voor complexe bibliotheken met vele verschillende plasmiden op een wijze die betrouwbaar en reproduceerbaar is.

<table><tbody><tr><td>Illumina HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td></td><td>deep sequencing platform</td></tr><tr><td>Monoclonal anti-HA antibodies</td><td>Biolegend</td><td>901514</td><td>Primary Antibody to detect expression of HA in pGal4AD constructs</td></tr><tr><td>Polyclonal anti-myc antibodies</td><td>QED Biosciences Inc</td><td>18826</td><td>Primary Antibody to detect expression of MYC in pTEF-GBD constructs</td></tr><tr><td>NarI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0191S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3236S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol 3350, powder</td><td>J.T. Baker</td><td>U2211-08</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Trevigen, Inc sold by Fisher Scientific</td><td>50-948-286</td><td>carrier DNA for yeast transformation section 3.2.1.</td></tr><tr><td>Kanamycin Monosulfate</td><td>Research Products International</td><td>K22000</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td>used for making DNA agarose gels</td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Research Products International</td><td>S23025</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Research Products International</td><td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Research Products International</td><td>S23080</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Acetate Dihydrate</td><td>MP Biomedicals</td><td>155256</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>ThermoFisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sodium Salt</td><td>Research Products International</td><td>E57020</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Extract Powder</td><td>Research Products International</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base (ammonium sulfate) w/o amino acids</td><td>Research Products International</td><td>Y20040</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0789</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu-His+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS1169</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu-Met</td><td>Formedium</td><td>DCS0549</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Met</td><td>Bio 101, Inc</td><td>4520-922</td><td></td></tr><tr><td>L-Methionine</td><td>Formedium</td><td>DOC0168</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Research Products International</td><td>A11500</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>used for making media plates in section 1</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Research Products International</td><td>P20240</td><td></td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4 Triazole</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoehanol (BME)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>USBiological</td><td>Z1004</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>Phenol:Chloroform:IAA</td><td>Ambion</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238074</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Research Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Research Products International</td><td>L22010</td><td></td></tr><tr><td>glycerol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gibco</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>bromophenol blue</td><td>Amresco</td><td>449</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Cloning Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td>Rapid assembly method for cloning of plasmids in section 2</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td>Used for amplification of products for Gibson Assembly in Section 2.3 as well assample preparation for DEEPN deep sequencing in section 6.2.1</td></tr><tr><td>Ethidium Bromide</td><td>Amresco</td><td>0492-5G</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Used for purification of pcr products in section 6.2.3</td></tr><tr><td>Qiaquick DNA Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Used for purification of digested pTEF-GBD in section 2.1</td></tr><tr><td>KAPA Hyper Prep kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK8500</td><td>preparation kit for deep sequencing</td></tr><tr><td>Codon optimization</td><td>http://www.jcat.de</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Codon optimization</td><td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gBlocks</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td></tr><tr><td>Strings</td><td>Thermofisher</td><td></td><td>DNA fragments used for cloning in Section 2.2</td></tr><tr><td>GenCatch Plasmid DNA mini-prep Kit</td><td>EPOCH Life Sciences</td><td></td><td>Used to prepare quantities of DNA in Section 2.3</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>high performance ultra-sonicator in section 7</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5&rsquo;- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3&rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5&rsquo;-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3&rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>used for pcr amplification and sequencing 5' insert pTEF-GBD during plasmid construction</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5&rsquo;-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3&rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5&rsquo;-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3&rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>used for pcr amplification and sequencing 3' insert pTEF-GBD during plasmid construction</td></tr><tr><td>oligonucleotide 5&rsquo;-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3&rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5&rsquo;-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3&rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer used for insert amplification of pGAL4AD</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5&rsquo;-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3&rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer used for insert amplification of pGADT7</td></tr><tr><td>oligonucelotide 5&rsquo;- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3&rsquo;</td><td>Integrated DNA Technologies or Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer used for insert amplification of pGADT7</td></tr><tr><td>P

een gist 2-hybrid scherm in batch om te vergelijken eiwitinteractie

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Screening voor eiwit-eiwitinteractie met behulp van de gist 2-hybrid test is al lang een effectief instrument, maar het gebruik ervan grotendeels beperkt gebleven tot de ontdekking van hoge-affiniteit interactors die in de bibliotheek van interagerende kandidaten zijn hoogverrijkt. In een traditionele indeling, kan de gist 2-hybrid assay opleveren teveel kolonies om te analyseren wanneer uitgevoerd bij lage striktheid waar lage affiniteit interactors kunnen worden gevonden. Bovendien, zonder een uitgebreide en volledige ondervraging van dezelfde bibliotheek tegen verschillende aas plasmiden, een vergelijkende analyse niet worden bereikt. Hoewel sommige van deze problemen kunnen worden opgelost met behulp van gekleed prooi Bibliotheken, kunnen de kosten en de infrastructuur die nodig is om dergelijke schermen onbetaalbaar. Als alternatief hebben we aangepast de gist 2-hybrid bepaling om tegelijkertijd tientallen van voorbijgaande aard bloot te leggen en statische eiwitinteractie binnen één scherm met behulp van een strategie genoemd DEEPN (dynamische verrijking voor evaluatie van de netwerken van de proteïne), die omvat high-throughput DNA sequencing en berekening de ontwikkeling van een populatie van plasmiden, die coderen van interagerende partners te volgen. Hier beschrijven we aangepaste reagentia en protocollen waarmee een DEEPN scherm op eenvoudige en lonende wijze worden uitgevoerd.

De Y2H bepaling is wijd verbeid gebruikt voor het vinden van eiwit: eiwitinteractie en diverse aanpassingen en systemen zijn ontwikkeld. Voor het grootste deel, zijn dezelfde overwegingen die helpen zorgen voor succes met deze vorige benaderingen belangrijk voor DEEPN. Enkele van de belangrijke ijkpunten zijn: zorgen voor expressie van DNA-bindende domein fusie-eiwitten, zorgen voor een lage achtergrond van vals zijn + groei in de ze met het aas van belang met een lege prooi plasmide, een...

Batch-verwerking van gist 2-hybrid schermen zorgt voor directe vergelijking van de profielen van de interactie van meerdere aas eiwitten met een zeer complexe verzameling prooi fusion eiwitten. We beschrijven hier, verfijnde methoden, nieuwe reagentia en het implementeren van het gebruik ervan voor dergelijke schermen.

Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Deze methode maakt gebruik van het principe van het gista 2-hybride systeem in beide populaties om eiwit-eiwit interacties te identificeren die antwoord geven op belangrijke vragen over een verscheidenheid aan moleculaire en cellulaire processen. Deze techniek maakt gebruik van diep sequencing om de interacties van het ene eiwit tegen het andere te zien. Omdat deze aanpak is gericht op parallelle vergelijkingen, kan het sets van eiwitten identificeren die met het ene eiwit interageren in vergelijking met een ander of verschillende bevestigingen van hetzelfde eiwit of tijdens het typen van een ziekteverwekkende mutante versie, om differentiële interactomen te onthullen.Een nieuwe gista 2-hybride aasplasmide pTEF-GBD werd geconstrueerd voor deze procedure zoals beschreven in het tekstprotocol. Dit plasmide produceert Gal4 DNA binding domein fusie-eiwitten binnen een TRP1 centromeer gebaseerde laagkopie plasmide dat het kanamycine resistentiegen draagt en dat ook het klonen van aasfragmenten zowel stroomafwaarts als stroomopwaarts van het Gal4 DNA binding domein mogelijk maakt. Dit aasplasmide werd gebruikt om MATa gisten te transformeren, en de expressie van de Gal4 aasfusie-eiwitten werd geverifieerd door immunoblotting met anti-MIC antilichamen.Bovendien werd een nieuwe gista 2-hybride bibliotheek in de gestroomlijnde prooiplasmide vector PGAL4 AD gecreëerd. Genomisch DNA werd gefragmenteerd door schudden, grootte geselecteerd, gemodificeerd met adapters en in PGAL4-AD geïnserteerd om de saxairtab gista 2-hybride bibliotheek te creëren. Om de procedure voor het creëren van gista populaties met aas- en prooibibliotheken te beginnen, inoculeert u drie milliliter culturen van elk van de MATa gista transformanten die de verschillende trip een bevattende aasplasmiden en CSM minus trip medium dragen.Voeg twee afzonderlijke culturen toe, die alleen het vectorplasmide bevatten, om als procedurele controles te dienen. Incubeer de culturen bij 30 graden Celsius en 200 tpm gedurende zes uur. Verdun vervolgens elke cultuur in een 25 milliliter cultuur in een steriele Erlenmeyer kolf en incubeer overnacht.Ontdooi een bevroren flesje van MAT alfa cellen die de lu2-bevattende prooibibliotheek bevatten op kamertemperatuur. Gebruik het volledige ontdooide flesje cellen om 125 milliliter CSM minus lu minus met medium in een steriele Erlenmeyer kolf te inoculeren. Laat de cultuur groeien bij 30 graden Celsius en 200 tpm overnacht.De volgende dag, na te hebben bevestigd dat de OD600 van de overnachtelijke MAT a transformantculturen tussen 1,0 en 1,5 varieert, brengt u de culturen over in 50 milliliter conische buisjes en centrifugeert u 21 OD 600 equivalenten van elke cultuur bij 4.696 keer g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Suspendeert u elk pellet van MAT a cellen in 10 milliliter sterieel water, brengt u de suspensie over in een nieuw 50 milliliter conisch buisje en centrifugeert u bij 4.696 keer g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gebruik een pipet om het supernatant voorzichtig te verwijderen, zonder de pelletteerde cellen te verstoren, en suspendeert u het pellet in vier milliliter gebufferd YPDA-medium bij pH 3,7.Voor elke 10 gewenste paringsreacties, pellet 39 OD 600 equivalenten van de mat alfa stam die de bibliotheekplasmiden draagt in een 50 milliliter conisch buisje. Suspendeert u de mat alfa cellen in 10 milliliter sterieel water en herpellet in een nieuw 50 milliliter conisch buisje bij 4.696 keer g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten. Gebruik een pipet om het supernatant voorzichtig te verwijderen, zonder de pelletteerde cellen te verstoren, en suspendeert u het pellet in 10 milliliter gebufferd YPDA-medium bij pH 3,7.Om elke paringsreactie op te zetten, voegt u het volgende toe aan een nieuw 50 milliliter conisch buisje:Een milliliter van MAT-A getransformeerde cellen, een milliliter van MAT-alpha bibliotheek bevattende cellen en een milliliter van gebufferd YPDA bij pH 3,7. Incubeer bij 30 graden Celsius met zachte, orbitale agitatie gedurende 90 minuten. Na 90 minuten centrifugeert u de cellen bij 4.696 keer g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.Verwijder het supernatant en suspendeert u het pellet in twee milliliter een op een gebufferd YPDA-YPD. Plateer alle twee milliliter cellen op een 100 milliliter YPD-plaat en incubeer bij 30 graden Celsius gedurende ongeveer 20 uur. Om de cellen te oogsten, pipetteert u twee tot drie milliliter CSM minus lu minus trip medium op elke YPD-plaat en gebruikt u een celschraper om de cellen los te maken.Pipetteert u de losgemaakte cellen in een 50 milliliter conisch buisje. Spoelt u de plaat vier tot vijf keer met twee tot drie milliliter CSM minus lu minus trip medium door met een 1.000 microliter pipet het medium op te pipetten en voorzichtig uit te spuiten over het YPD-plaatoppervlak. Centrifugeert u de cellen bij 4.696 keer g bij kamertemperatuur gedurende vijf minuten.Gooit u het supernatant van elke conische buis weg en suspendeert u de cellen in 40 milliliter CSM minus lu minus trip medium door op en neer te pipetten. Om het aantal gevormde diploïde cellen te schatten, verdunt u vier microliter van de diploïde mengsel in respectievelijk 200 microliter en 2.000 microliter CSM minus lu minus trip medium. Plateert u 200 microliter van elke verdunning op een CSM minus lu minus trip plaat om een een op 10.000 en een op 100.000 volledige verdunning van de voorraad diploïde cellen die zijn geoogst, te vertegenwoordigen.Incubeer de platen bij 30 graden Celsius gedurende 36 tot 40 uur. Gebruik onmiddellijk de resterende 40 milliliter celresuspensie om 500 milliliter CSM minus lu minus trip medium in een liter Erlenmeyer kolf te inoculeren. Meet de OD 600 van elke cultuur.Incubeer deze kolven bij 30 graden Celsius, met schudbeweging bij 180 tpm, totdat ze verzadiging bereiken, wat doorgaans 36 tot 40 uur duurt. Controleer de celgroei bij 24 uur en

a-yeast-2-hybrid-screen-in-batch-to-compare-protein-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

MYTHE kan de gevoelige detectie van voorbijgaande aard en stabiele interacties tussen eiwitten die worden uitgedrukt in het model organisme Saccharomyces cerevisiae. Het is met succes toegepast op exogene en gist integrale membraaneiwitten bestuderen om hun interagerende partners in een high throughput manier te identificeren.

Split-Ubiquitine membraanfilters op Yeast Two-Hybrid (mythe) Systeem: een krachtig hulpmiddel voor het identificeren van eiwit-eiwit interacties

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

This video demonstrates the yeast two-hybrid assay to detect specific protein self-interactions. In this assay, the protein of interest is tagged to two domains of a transcription factor that encodes the β-galactosidase enzyme. When the two proteins interact, this causes transcription and translation to form the enzyme, which is then detected using a biochemical assay.

Yeast Two-Hybrid Assay to Determine Protein Self-Association in Yeast Cells

In this video, we demonstrate the modified yeast one-hybrid assay, which detects multiple proteins interacting with target DNA. The transformed yeast cells contain the target DNA sequence upstream of the reporter gene. Additionally, they express transcription factor proteins. When the proteins form complexes and bind to the target DNA, the reporter gene is expressed and can be detected enzymatically.

Modified Yeast-One Hybrid Assay to Detect Heteromeric Protein Complex-DNA Interactions

Dit artikel richt zich op de identificatie van hoog-vertrouwen interactie datasets tussen gastheer en pathogeen-eiwitten met behulp van een combinatie van twee orthogonale methoden: gist twee-hybride, gevolgd door een high-throughput interactie test bij zoogdiercellen genaamd HT-GPCA.

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

Met behulp van eiwit microarrays met bijna het hele S. cerevisiae proteoom wordt gesondeerd voor snelle onpartijdige ondervraging van duizenden proteïne-proteïne interacties in parallel. Deze werkwijze kan worden gebruikt voor eiwit-kleine molecule, posttranslationele modificatie, en andere assays high-throughput.

Probing hoge dichtheid functioneel eiwit Microarrays om eiwit-eiwit interacties Detect

Eiwitten interageren met elkaar en deze interacties bepalen voor een groot deel hun functies. Eiwitinteractiepartners kunnen op grote schaal in vivo worden geïdentificeerd met behulp van een gistfitnesstest op basis van de dihydrofolaatreducase-eiwitfragmentcomplementatietest (DHFR-PCA).

Genoom-brede Eiwit-eiwit Interactie Screening door Eiwit-fragment Complementatie Assay (PCA) in levende cellen

Bacteriële effector eiwitten zijn belangrijk voor het vaststellen succesvolle infecties. Dit protocol beschrijft de experimentele identificatie van proteïne bindingspartners van een bacteriële effector eiwit in zijn natuurlijke plantaardige gastheer. Het identificeren van deze effector interacties via gist-twee-hybride-schermen is uitgegroeid tot een belangrijk instrument in het ontrafelen van de moleculaire pathogeniteit strategieën.

Het ontrafelen van de functie van een bacteriële Effector uit een niet-landbouw Plant Pathogeen Met behulp van een gist two-hybrid screen

De gemodificeerde gist-een-hybride analyse die hier wordt beschreven is een uitbreiding van de klassieke gist-hybride (Y1H) -assay om de heteromeer eiwitcomplex-DNA-interactie te onderzoeken en valideren in een heterologe systeem voor elke functionele genomica-studie.

Een gemodificeerd Yeast-One Hybrid System voor Heteromere Proteïne Complex-DNA Interactie Studies

Diepe sequentiebepaling van gist bevolking geselecteerd voor positieve gist 2-hybrid interacties mogelijk levert een schat aan informatie over interacterende eiwitten van de partner. Hier beschrijven we de werking van specifieke bioinformatica tools en bijgewerkte software voor het analyseren van de reeks gegevens uit dergelijke schermen op maat.

Informatic analyse van sequencedata van Batch gist 2-Hybrid schermen

De interacties van biomoleculen, zoals eiwit-eiwitinteracties, vormen de moleculaire basis van biologische functies. Als interactie-nulle/gestoorde mutanten die specifiek de relevante interactie missen, kunnen worden geïsoleerd, zullen ze enorm helpen om de functie(s) van deze interactie te begrijpen. Dit artikel presenteert een efficiënte manier om interactie-null/verminderde mutanten te isoleren.

Isoleren van interactie-null/aangetaste mutanten met behulp van de gist-twee-hybride test

Leer een verfijnde gist 2-hybrid methode voor batchverwerking om eiwitinteracties te vergelijken met deep sequencing. Deze aanpak identificeert differentiële interactiomen en verbetert het onderzoek naar complexe moleculaire netwerken.

Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie

Meer video's verkennen