Name: Informatic analyse van sequencedata van Batch gist 2-Hybrid schermen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: Leer bio-informatica-analyse van diepsequencingdata uit gist 2-hybrid schermen met MAPster-software. Deze gebruiksvriendelijke methode maakt eiwitinteractie-onderzoek toegankelijk voor onderzoekers zonder uitgebreide bio-informatica-expertise.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health: NIH R21 EB021870-01A1 en door NSF onderzoek projectsubsidie: 1517110.

1. Fastq toewijzingsbestanden
Opmerking: DEEPN software, alsook vele bioinformatics-programma's gebruiken DNA-gegevens van de volgorde waarin elke sequentie lezen is toegewezen voor haar positie in verwijzing DNA. Een verscheidenheid van programma's de toewijzing kan worden gebruikt voor dit met inbegrip van de MAPster interface hier die gebruikmaakt van het HISTAT2-programma voor de productie van .sam bestanden die worden gebruikt in opeenvolgende stappen.
<ol><li>De reeks gegevens toewijzen aan de juiste versie van het genoom. Voor de bibliotheken van de Y2H van muis oorsprong, gebruiken de UCSC mm10 genoom; voor degenen met behulp van menselijke genen, gebruik de UCSC hg38 referentie genoom, voor Saccharomyces cerevisiae genen, gebruik van het genoom van de verwijzing UCSC SacCer3.</li>
	<li>
Installeren van MAPster.
	<ol>
<li>MAPster software downloaden en installeren. De software kan worden gevonden via een webbrowser op het volgende: https://github.com/emptyewer/MAPster/releases. HISAT2 draait op Unix gebaseerde systemen, zoals een Apple Macintosh. Hierdoor zal het MAPster-programma alleen uitgevoerd op compatibele systemen zoals Apple Macintosh en linux. Opmerking: Systeemvereisten voor Apple Mac zijn: OSX 10.10 +, > 4 Gb RAM, > 500 Gb beschikbare schijfruimte en de toegang tot het internet voor het downloaden van referentie genomen. Gebruikers wellicht te raadplegen met een institutionele persoon als hun onderneming beveiligingsprotocollen beperken beheerdersrechten en -machtigingen heeft.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voer vereiste bestanden en parameters via het tabblad "Main" (Figuur 1). Selecteer de juiste "Pairwise" knop om bestanden zoals paren of ongepaarde met FASTQ als de standaardbestandsindeling.
	<ol>
<li>Schakel de optie van de "Pairwise" op "Uit" om te draaien in één Lees formaat voor DEEPN analyse.</li>
		<li>Bestanden laden naar MAPster gewoon door slepen en neerzetten in het juiste venster.</li>
		<li>Selecteer een verwijzing bron van de DNA/genoom die correspondeert met de bron van de Y2H prooi bibliotheek inserts. Geïndexeerde genomen van verscheidene modelorganismen staan in de "Genoom" vak en kunnen automatisch worden gedownload van de Johns Hopkins University Center for Computational Biology. Referentie genomen worden lokaal opgeslagen voor later gebruik.</li>
		<li>Geeft het aantal computerprocessen worden gewijd aan het programma van de toewijzing onder het vak "Threads" sinds HISAT2 ondersteunt multi-threading. MAPster zoekt de computer en het maximale aantal processors beschikbaar als een standaard suggereren.</li>
		<li>Geef een output bestandsnaam. De naam van dit bestand zal gebruikt worden tijdens het DEEPN-proces dus een korte maar beschrijvende naam, zonder spatie of speciale tekens is aanbevolen. Geef een map voor de uitvoer van de toegewezen bestanden met behulp van de knop "Open Output Directory".</li>
		<li>Zodra de juiste bestanden en parameters hebt geselecteerd, wordt het werk van de toewijzing aan de wachtrij met behulp van de knop "Add to Queue" toevoegen. De bestandsnamen in het belangrijkste venster kunnen worden verwijderd en vervangen door bestanden die betrekking hebben op een nieuwe steekproef en ze kunnen worden toegevoegd aan de wachtrij na het verstrekken van een overeenkomstige output bestandsnaam.</li>
		<li>Klik op de "Uitvoeren wachtrij" knop zodra alle taken in de taakwachtrij zijn ingevoerd. Opmerking: Zodra een toewijzing baan in de wachtrij is geplaatst, selecteren die baan zorgt ervoor dat de parameterinstellingen moet worden weergegeven in het venster "Baan Parameters" en de verklaring van de bevellijn met alle argumenten worden weergegeven in het venster "Baan Command". De uitvoeropties omvatten sturen of naar houden leest die niet uitlijnen en het aantal primaire afstemmingen toegestaan voor elke lezen op te geven. De standaard output file van MAPster is in SAM formaat (bijvoorbeeld een bestand '.sam'). Het bevat alle de leesbewerkingen van de volgorde van de fastq bestanden opgegeven voor dat monster met inbegrip van de instellingen die waren (toegewezen) en waren niet (unmapped) succesvol toegewezen aan het opgegeven geome.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Bioinformatic verwerking met behulp van DEEPN Software
Opmerking: DEEPN software is momenteel samengesteld voor gebruik met prooi bibliotheken met muis cDNA sequenties, menselijke cDNA sequenties of S. cerevisiae genomic opeenvolgingen van DNA. DEEPN accepteert de standaard .sam-bestandsindeling en een bestand van de SAM (.sam) die zowel toegewezen en ontkoppeld leest of afzonderlijke bestanden bevat voor elk van de niet-toegewezen en toegewezen leest kan aanvaarden.
<ol><li>DEEPN software downloaden en installeren. De software kan worden gevonden via een webbrowser op het volgende: https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases. Selecteer welke versie overeenkomt met de computing platform en downloaden. Open het gedownloade installatie pakket om te installeren. Opmerking: Versies van DEEPN zijn beschikbaar voor PC, Mac en Linux sysrems. Mac en PC systemen moeten > 500 Gb harde schijfruimte en > 4 Gb RAM.</li>
	<li>
De DEEPN-software niet openen. Selecteer de bijbehorende informatie van de bibliotheek van de prooi van het bovenste selectievak van het belangrijkste venster (Figuur 2). Selecteer een map waar de verwerkte bestanden kunnen gaan door te klikken op de knop "werkmap" en navigeren naar de map/directory. Een kunt een nieuwe map/directory maken indien nodig. Zodra een "werk Folder" is geselecteerd, zal DEEPN de drie submappen getiteld unmapped_sam_files, mapped_sam_files en sam_files maken.
	<ol>
<li>Als met behulp van .sam bestanden met zowel toegewezen en ontkoppeld leest zoals degenen die met standaardinstellingen van het programma MAPster, plaats ze in de map 'sam_files'. Anders plaats .sam bestanden dienovereenkomstig in de unmapped_sam_files en de mapped_sam_files.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwerking starten door te klikken op de knop "Gene graaf + Junction maken". Opmerking: Verwerking zal beginnen met de Gene graaf-module die toewijzing posities gebruiken zal om te tellen hoeveel leest correspondeert met elk gen. Junction Make zal vervolgens uittreksel junction sequenties (de sequenties gesmolten direct stroomafwaarts van het domein van de Gal4-activering) van de leest en identificeren met behulp van het algoritme Blast. Dit zal leiden tot een volledige set mappen die zijn afgebeeld in Figuur 3. Verwerkingstijd is afhankelijk van de grootte en het aantal bestanden met reeksen gegevens en de verwerkingssnelheid van de computer gebruikt. Typische tijden variëren van 12-30 h voor een experimentele dataset van ~ 250 miljoen leest. De Gene graaf-procedure en de procedure Junction_Make kunnen individueel gestart worden door te klikken op de knop "Gene Count" of de "Junction maken".</li>
	<li>
Download en installeer Stat_Maker (https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases). Dit is een statistische analyse-pakket ontwikkeld voor DEEPN datasets die momenteel alleen op Unix Mac-systemen werkt.
	<ol>
<li>Open Stat_Maker en klik op de knop 'Controleren of de installatie' (Figuur 4). Als voor de eerste keer uitvoert, Stat_Maker automatisch geïnstalleerd R, JAGS en Bioconductor door te trekken van deze bronnen van het internet. Zodra R, JAGS en Bioconductor worden gedetecteerd, zal de Stat_Maker actief geworden en verdere gebruikersinvoer toestaan.</li>
		<li>Klik op de knop 'Kies map' om te navigeren naar de map die DEEPN verwerkt. Stat_Maker automatisch vinden en lijst van de bestanden voor statistische analyse in het venster.</li>
		<li>Slepen en neerzetten van de juiste bestanden uit het bestand lijstvenster boven in het bestand ramen hieronder voor elke vector en aas dataset en voor elke groei-omstandigheden: niet-geselecteerde (zijn + media) en (zijn - media) hebt geselecteerd. Bovenal vereist Stat_Maker dubbele datasets voor lege vector alleen, twee monsters van niet-geselecteerde populaties en twee monsters van geselecteerd. Dit geeft een schatting van de variabiliteit in de experiment.</li>
		<li>Klik op de "Uitvoeren" knop. Afhankelijk van de snelheid van de computer vindt de berekening tussen 5-15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bekijk resultaten van de output van de Stat_Maker, die in een nieuwe submap in de map van de belangrijkste werk met het label "Stat_Maker resultaten" zijn ingedeeld. Opmerking: De resultaten zijn gevonden in een CSV (comma separated values) bestand dat gemeen spreadsheetprogramma's kan worden geopend. Stat_Maker zal rang gene hits die dreigen te worden voor het differentieel verrijkt selectie met het aas van belang bij het over het lege pTEF-GBD (Figuur 5). Ook tabelvorm is het percentage van luidt voor elke dataset waar de gene invoegen gevonden stroomopwaarts, stroomafwaarts, of binnen de open leesraam en of het gen ook binnen het juiste translationeel leesraam wordt gevonden. Vaak zal DEEPN robuust Y2H interacties van een aas met gedeelten van een bepaalde cDNA die zijn uit het juiste leesraam van het overeenkomstige eiwit of aan een gedeelte van de cDNA dat stroomafwaarts van de overeenkomstige open-leesraam vangen. Scannen van de gecombineerde output van Stat_Maker stroomlijnt detectie en eliminatie van deze irrelevant hits.</li>
	<li>
Als u wilt bekijken van de gegevens over elke potentiële kandidaat, de DEEPN-software niet openen, selecteert u de bijbehorende informatie van de bibliotheek van de prooi waarna naar de juiste map met behulp van de "werk Folder".
	<ol>
<li>Klik op de knop "Query Blast". Dit laadt een nieuw venster (Figuur 6). Typ in het bovenste tekstvak, GenBank NM nummer te selecteren van de kandidaat-gen van belang of de naam van het gen. Deze gen namen komen overeen met de namen in het uitvoerbestand StatMaker. Type enter of return, die initieert ophalen van het gen van belang.</li>
		<li>Selecteer welke datasets gebruikt zal worden voor de analyse met behulp van de "Selecteer Dataset" menu's. Meestal deze omvatten alleen de Vector en aas monsters gekweekt onder niet-selectieve omstandigheden en het monster van de aas geteeld onder omstandigheden van de selectie. Aanvankelijk de datasets duurt een paar ogenblikken te laden, daaropvolgende query van de dezelfde datasets met verschillende genen zal gaan echter snel. Blast_Query verschijnt de fusion punten langs de opeenvolging van belang en hoe overvloedig elk punt van de fusie is. Dit kan zowel in een tabel via het tabblad "Resultaten" en een grafisch formaat via het tabblad "Plot" worden weergegeven. Deze resultaten kunnen worden geëxporteerd naar een CSV-bestand door te klikken op de "Save.csv" knop in de rechterbovenhoek.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. verificatie van de kandidaten aangeduid met DEEPN
Opmerking: Het doel van DEEPN en Stat_Maker is om kandidaat-genen die een positieve interactie van de Y2H geven te identificeren. Controleren van dergelijke Y2H interactie kan worden gedaan met behulp van een traditionele binaire Y2H-formaat met behulp van het aas plasmide van belang gecombineerd met de lege Gal4-activering domein 'prooi' plasmide evenals gecombineerd met de prooi plasmide die het gen/cDNA fragment van belang. Het is niet haalbaar om te isoleren van de werkelijke plasmide van belang in het mengsel van DNA geïsoleerd van de gist bevolking onderworpen aan Y2H selectie. Echter kan een computationeel reconstrueren wat het gen/cDNA fragment is dat produceert de Y2H interactie, ontwerpen van inleidingen voor de 5' en 3' einden van dat fragment, en versterken van dat fragment uit het DNA afgezonderd van de gist bevolking. In deze sectie wordt beschreven hoe het 5' en 3' einde van het fragment van de prooi kandidaat te vinden.
<ol><li>Open de DEEPN software en kies de parameters "Select Parameter" en de werkmap "Selecteer werken" overeenkomt met het project. Start de module van de Blast_Query door te klikken op de knop "Query Blast".</li>
	<li>
Typ de naam van het gen van belang of de GenBank "NM" nummer in het bovenste tekstvak. Selecteer in het pull-downmenu de dataset die correspondeert met de geselecteerde gist bevolking voor het aas van belang om op te halen van de inhoudsopgave junction posities onder het tabblad 'Resultaten'. Standaard Blast_Query zal het bestellen van de verschillende standpunten die volgens hun overvloed in de dataset, gekwantificeerd door de ppm van het totale aantal knooppunten die zijn gevonden in de database.
	<ol>
<li>Vind de overvloedigste standpunt dat is "In ORF" en "In Frame". De waarde voor de positie komt overeen met de positie van de nucleotide van het gen met de NCBI referentie opeenvolging ('NM' nummer) gevonden in het bovenste tekstvak. Deze volgorde kan worden opgehaald uit GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/) of gekopieerd uit het onderste tekstvak in het Blast_Query-venster. Opmerking: Een voorbeeld kan gevonden worden in Figuur 6, middelste deelvenster. In de dataset center, de 'resultaten' weergeven als de overvloedigste kruising: 'Positie': 867; '#Junctions': 20033.821; 'Query Start', 1; CDS: In ORF; en 'Frame': In Frame. Nucleotide 867 van de GenBank NCBI referentie reeks NM_019648 is het begin van het fragment van de prooi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Als de Query Start 1 is, ontwerpen van het einde 5' van de primer op te nemen van de nucleotide overeenkomt met het positienummer en uitbreiden van 25 nucleotiden stroomafwaarts vanuit die positie (Figuur 7). Query Start is meer dan 1, geeft aan dat er extra nucleotiden tussen het domein van de activering Gal4 en de opeenvolging van de prooi van belang zijn en dat de primer met verder stroomafwaarts volgens de Query Start waarde beginnen.</li>
	<li>Klik op de knop "Read diepte" onder "Gegevens analyseren" vanuit het venster DEEPN. Zodra het lezen diepte-venster geopend is, de NCBI referentie sequentie (NM) nummer of gene naam typen in het bovenste tekstvak. Gebruik het pull-down menu om te selecteren van de relevante dataset waarin de verrijkte gen van belang. Gebruik de tabel aan de linkerkant en de afbeeldingen worden weergegeven op het recht om te bepalen hoeveel leest werden gevonden in de gegevens die overeenkomen met het gen van belang (Figuur 7B).</li>
	<li>Ontwerp een einde primer 3', die de volgorde van het fragment van de gene berekend door lezen diepte zal vangen. Indien de overvloed van luidt overschrijdt de ORF en stop codon, ontwerp van de primer, zodat hierin de stop codon en de regio slechts stroomopwaarts van de stop codon. Als de reeksen voor het gen het niet tot voorbij de stop codon uitstrekt doen, gebruikt u de tabel van de resultaten te vinden van de meest afgelegen regio 3' die kan worden gedetecteerd en gebruikt deze positie als de verst 3' positie voor de primer. Opmerking: Het lezen diepte programma scant in intervallen sequenties die overeenkomen met de opgegeven gen/cDNA van belang vinden. Dit helpt voorspellen waar het 5' en 3' eind van de overvloedigste fragment van de prooi is voor dat gen in het monster. Fluctuaties in de Lees diepte langs de lengte van de reeks zijn normaal, zoals te zien is in Figuur 7. Als de Lees diepte duidelijk voorbij de stop codon is, geeft het aan dat de prooi fragment verder reikt dan de stop codon en de 3'-primer kan dus gewoon komen overeen met de streek rond de stop codon.</li>
	<li>
Het uitvoeren van een PCR-reactie van 50 µL per gen. Elke reactie bevat 25 pmol elke voorwaartse en omgekeerde primer die overeenkomen met de plasmide prooi-bibliotheek (zie tabel van materialen). Reacties bevatten ook 25 µL van High-fidelity 2 x PCR Master Mix, 5 µg DNA-monster en water tot 50 µL.
	<ol>
<li>Reacties versterken voor 25 cycli met extensie tijden van 3 min bij 72 ° C, onthardende temperatuur van 55 ° C gedurende 30 s denaturering bij 98 ° C gedurende 10 s. Precede fietsen door een 30 s denaturatie bij 98 ° C en volgen met een incubatieperiode van 5 min bij 72 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Fields, S., Song, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+genetic+system+to+detect+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A novel genetic system to detect protein-protein interactions.</a> Nature. 340 (6230), 245-246 (1989).</li>
<li>Rajagopala, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+Protein-Protein+Interactome+Networks+Using+Yeast+Two-Hybrid+Screens%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Mapping the Protein-Protein Interactome Networks Using Yeast Two-Hybrid Screens.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 883, 187-214 (2015).</li>
<li>Weimann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Y2H-seq+approach+defines+the+human+protein+methyltransferase+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A Y2H-seq approach defines the human protein methyltransferase interactome.</a> Nature Methods. 10 (4), 339-342 (2013).</li>
<li>Yachie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pooled-matrix+protein+interaction+screens+using+Barcode+Fusion+Genetics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Pooled-matrix protein interaction screens using Barcode Fusion Genetics.</a> Molecular Systems Biology. 12 (4), 863(2016).</li>
<li>Trigg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CrY2H-seq%3A+a+massively+multiplexed+assay+for+deep-coverage+interactome+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CrY2H-seq: a massively multiplexed assay for deep-coverage interactome mapping.</a> Nature Methods. , (2017).</li>
<li>Pashkova, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEEPN+as+an+Approach+for+Batch+Processing+of+Yeast+2-Hybrid+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">DEEPN as an Approach for Batch Processing of Yeast 2-Hybrid Interactions.</a> Cell Reports. 17 (1), 303-315 (2016).</li>
<li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HISAT%3A+a+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li>
<li>Reinert, K., Langmead, B., Weese, D., Evers, D. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25939052">Alignment of Next-Generation Sequencing Reads.</a> Annual Review of Genomics and Human Genetics. 16, 133-151 (2015).</li>
<li>Pertea, M., Kim, D., Pertea, G. M., Leek, J. T., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript-level+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+HISAT%2C+StringTie+and+Ballgown%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transcript-level expression analysis of RNA-seq experiments with HISAT, StringTie and Ballgown.</a> Nature Protocols. 11 (9), 1650-1667 (2016).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26813401">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17, 13(2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen

De hier beschreven softwaresuite maakt het mogelijk om volledig verwerken en analyseren van hoge-doorvoer DNA sequencing gegevens uit een DEEPN experiment. Het eerste programma gebruikt is MAPster, die neemt de DNA volgorde leest in standaard fastq bestanden en kaarten van hun positie op een referentie DNA voor downstream processing door een hele reeks van informatica-programma's met inbegrip van de DEEPN software. Het nut van de MAPster-interface en haar vermogen om meerdere taken, combineren de input-bestanden van de C...

Een benadering te ontdekken eiwitinteractie is de gist 2-hybrid (Y2H) test, welke exploits ontworpen gistcellen die groeien alleen wanneer een proteïne van belang aan een fragment van een interactie partner1 bindt. Detectie van meerdere Y2H interacties kan nu worden gedaan met de hulp van massale parallelle high-throughput sequencing. Verschillende formaten zijn beschreven van2,3,4,5 waaronder een die we ontwikkeld waar populaties worden geteeld in batch onder voorwaarden die selecteert voor gist plasmiden die produceren met een positieve Y2H interactie6. De werkstroom we ontwikkeld, genoemd DEEPN (dynamische verrijking voor evaluatie van de netwerken van de proteïne), differentiële interactomes uit de dezelfde prooi bibliotheken te identificeren van de eiwitten die in combinatie met een eiwit (of domein) vsidentificeert. een ander eiwit of een conformationally onderscheiden mutant domein. Een van de belangrijke stappen in deze werkstroom is goede verwerking en analyse van de gegevens van DNA sequencing. Sommige informatie kan worden opgedaan door te gewoon tellen het aantal leest voor elk gen zowel vóór als na de selectie van Y2H interacties op een wijze analoog aan een RNA-seq-experiment. Echter kan veel meer gedetailleerde informatie worden geëxtraheerd uit deze datasets met inbegrip van informatie over het subdomein van een bepaald eiwit dat is geschikt voor het produceren van een Y2H-interactie. Voorts overwegende dat de aanpak van de DEEPN waardevol is, kunnen analyseren van vele monster wordt gerepliceerd omslachtige en dure. Dit probleem is verlicht met behulp van een statistisch model dat werd ontwikkeld speciaal voor DEEPN datasets waar het aantal replicatieonderzoeken is beperkt6. Om verwerking en analyse van DNA sequencing datasets betrouwbare, volledige, robuuste en toegankelijk voor onderzoekers zonder bioinformatics deskundigheid, ontwikkelden we een suite van software programma's die betrekking hebben op alle stappen van analyse.
Deze suite van stand-alone software programma's die worden uitgevoerd op desktop computers omvat MAPster, DEEPN en Stat_Maker. MAPster is een grafische gebruikersinterface waarmee dat elk fastq-bestand in de wachtrij voor toewijzing aan het genoom met behulp van de HISAT2 programma7, produceren een standaard .sam bestand voor gebruik in downstream toepassingen. DEEPN heeft verschillende modules. Het wordt toegewezen en telt leest overeenkomt met een bepaald gen vergelijkbaar met een RNA-seq type kwantificering met behulp van de module 'Gene Count'. Ook extracten van de reeksen overeenkomt met de kruising tussen de Gal4 transcriptionele domein en de volgorde van de prooi en gesorteerd van de positie van deze kruispunten toe hun inspectie door vergelijkende tabellen en grafieken (met behulp van de module 'Junction_Make') De module 'Blast_Query' laat gemakkelijk inspectie, kwantificatie en vergelijking van de kruising Gal4 junction sequenties. Stat_Maker evalueert de leest per gene verrijking gegevens statistisch gezien als een manier van het prioriteren van waarschijnlijk Y2H hits. Hier beschrijven we hoe deze software programma's te gebruiken en volledig analyseren de gegevens uit een DEEPN Y2H experimenteren opeenvolging van DNA. Versies van DEEPN worden uitgevoerd op PC, Mac en Linux systemen. Andere programma's, zoals het programma voor toewijzing MAPster en de DEEPN statistieken module Stat_Maker afhankelijk van subroutines die worden uitgevoerd onder Unix en zijn alleen beschikbaar op Mac en linux systemen.

<table><tbody><tr><td>Mapster</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/MAPster/releases</td></tr><tr><td>DEEPN software</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td></tr><tr><td>Statmaker</td><td></td><td></td><td>https://github.com/emptyewer/DEEPN/releases</td></tr><tr><td>Minimum computersysteem</td><td>Apple</td><td></td><td>Mac Intel Core i5 of beter</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>4 Gb RAM of beter</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>500 Gb schijfruimte of beter</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>OS 10.10 of hoger</td></tr><tr><td></td><td>Dell</td><td></td><td>Intel i5-7400 of beter</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>4 Gb RAM of beter</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>500 Gb schijfruimte of beter</td></tr><tr><td></td><td>-</td><td></td><td>Windows 7 of hoger</td></tr></tbody></table>

informatic analyse van sequencedata van batch gist 2-hybrid schermen

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

De gist 2-hybrid bepaling om tegelijkertijd tientallen voorbijgaande en statische eiwitinteractie binnen één scherm met behulp van hoge-doorvoer korte-Lees DNA rangschikkend bloot te leggen, hebben we aangepast. De resulterende reeks datasets kunt bijhouden welke genen in een populatie die tijdens de selectie voor positieve gist 2-hybrid interacties zijn verrijkt, maar ook geven gedetailleerde informatie over de relevante subdomeinen van eiwitten voldoende voor interactie. Hier beschrijven we een volledige suite van zelfstandige softwareprogramma's waarmee niet-deskundigen om alle de bioinformatica en statistische stappen om te verwerken en analyseren van bestanden met fastq van DNA reeksen van een batch gist 2-hybrid test uitvoeren. De stappen van de verwerking vallende van deze software omvatten: 1) mapping en tellen volgorde leest overeenkomt met elke kandidaat-proteïne gecodeerd binnen een gist 2-hybrid prooi bibliotheek; 2) een statistische analyseprogramma dat resulteert in de profielen van de verrijking; en 3) hulpmiddelen de translationeel frame en positie binnen de codering regio van elke verrijkt plasmide die de interacterende eiwitten van belang codeert te onderzoeken.

Fastq gegevens in kaart te brengen: de eerste stap In vrijwel alle NGS toepassingen met inbegrip van de eerste uitvoer is een bestand van korte opeenvolging luidt dat moet worden toegewezen door aanpassing aan de genomic DEEPN, verwijzing transcriptomic, of andere DNA8. Onlangs werd de HISAT2 aanpassing programma ontwikkeld dat maakt gebruik van state-of-the-art indexing algoritmen te drastisch verhogen de toewijzing snelheid7<...

Diepe sequentiebepaling van gist bevolking geselecteerd voor positieve gist 2-hybrid interacties mogelijk levert een schat aan informatie over interacterende eiwitten van de partner. Hier beschrijven we de werking van specifieke bioinformatica tools en bijgewerkte software voor het analyseren van de reeks gegevens uit dergelijke schermen op maat.

Informatic analyse van sequencedata van Batch gist 2-Hybrid schermen

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de aard van eiwit-interactomen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat alle bioinformatica-verwerking wordt uitgevoerd via een gebruiksvriendelijke interface. Deze software maakt gebruik van een gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface die moleculaire biologen, celbiologen en biochemici die niet veel expertise hebben in bioinformatica, kunnen gebruiken om hun analyse gemakkelijk te voltooien.Over het algemeen worstelen individuen die nieuw zijn in het verwerken van sequentiegegevens omdat de computerprogramma's verwarrend en omslachtig zijn. We dachten dat het gemakkelijker maken van de informatica de hele techniek veel toegankelijker en nuttiger zou maken. De eerste stap in deze procedure is het downloaden en installeren van het MAPster-softwareprogramma zoals beschreven in het tekstprotocol.Voer vervolgens de vereiste bestanden en parameters in via het hoofdtabblad. Selecteer de juiste Pairwise-knop om de bestanden voor DEEPN-analyse in te voeren. Zet de Pairwise-optie uit om in enkele leesmodus te draaien.Laad bestanden in MAPster door ze te slepen en neer te zetten in het juiste venster. Selecteer uit de geïndexeerde genomen die in het Genome-vak staan vermeld, een referentie-DNA-genoombron die overeenkomt met de bron van de Y2H-prooi-bibliotheek-inserts. Aangezien HISAT2 multi-threading ondersteunt, geef onder het Threads-vak het aantal computerprocessen op dat aan het mappingprogramma moet worden gewijd.Specificeer een naam voor het uitvoerbestand, een korte maar beschrijvende naam zonder spaties of speciale tekens, aangezien deze bestandsnaam gedurende het hele DEEPN-proces zal worden gebruikt. Gebruik de Open Output Directory-knop om een map op te geven om de toegewezen bestanden uit te voeren. Zodra de juiste bestanden en parameters zijn geselecteerd, gebruik de Toevoegen aan wachtrij-knop om de mappingtaak toe te voegen aan de taakwachtrij.Zodra alle taken in de taakwachtrij zijn ingevoerd, klikt u op de Uitvoeren wachtrij-knop. Begin deze analyse door de DEEPN-software te openen. Selecteer vanuit het hoofdvenster de bijbehorende prooibibliotheekinformatie uit het bovenste selectievak.Selecteer een map waar de verwerkte bestanden naartoe kunnen door op de Werkmap-knop te klikken en naar de mapdirectory te navigeren. Zodra een werkmap is geselecteerd, zal DEEPN drie submappen met de aangegeven namen maken. Zorg voor een succesvolle analyse dat u de juiste SAM-bestanden in de juiste mappen plaatst en weet welke bestanden gemapped en ongemappede lezingen hebben.Als u SAM-bestanden gebruikt die zowel gemappede als ongemappede lezingen bevatten, zoals die geproduceerd met de standaardinstellingen van het MAPster-programma, plaatst u deze in de sam_files-map. Start het verwerken door op de Gene Count plus Junction Make-knop te klikken. De verwerkingstijd hangt af van de grootte en het aantal sequentiegegevensbestanden en de verwerkingssnelheid van de gebruikte computer.Zodra DEEPN de gegevens heeft verwerkt, wordt een volledige set mappen gemaakt. De volgende stap is het uitvoeren van analyse in Stat Maker. Open Stat_Maker en klik op de Verifeer Installatie-knop.Als u voor de eerste keer uitvoert, zal Stat_Maker automatisch R, JAGS en Bioconductor installeren door deze bronnen van internet te halen. Zodra R, JAGS en Bioconductor zijn gedetecteerd, wordt Stat_Maker actief en staat het verdere gebruikersinvoer toe. Klik op de Kies Map-knop om naar de werkmap te navigeren die DEEPN heeft verwerkt.Stat_Maker zal automatisch de bestanden voor statistische analyse in het venster vinden en weergeven. Sleep en plaats de juiste bestanden vanuit het bovenstaande venster met bestandslijsten naar de onderste vensters voor elke vector- en prooi-dataset en voor elke groeitoestand, niet-geselecteerd en geselecteerd. Belangrijk is dat Stat_Maker dubbele datasets vereist voor lege vector alleen, twee monsters van niet-geselecteerde populaties en twee monsters van geselecteerd.Dit geeft een schatting van de variabiliteit binnen het experiment. Klik op de Uitvoeren-knop. Afhankelijk van de snelheid van de computer duurt de berekening tussen de vijf en 15 minuten.De resultaten van de Stat_Maker-uitvoer worden geplaatst in een nieuwe submap binnen de hoofdwerkmap gelabeld als Stat_Maker Resultaten. Bekijk de resultaten. Om de gegevens voor elke potentiële kandidaat te bekijken, opent u de DEEPN-software, selecteert u de bijbehorende prooibibliotheekinformatie en selecteert u vervolgens de juiste werkmap met behulp van de werkmap.Klik op de Blast Query-knop om een nieuw venster te laden. Typ in het bovenste tekstvak de naam van het gen of GenBank NM-nummer om het gen van belang te selecteren. De gennaam komt overeen met de naam die in het Stat Maker-uitvoerbestand staat vermeld.Typ Enter of Return, wat het ophalen van het gen van belang initieert. Selecteer welke datasets voor de analyse zullen worden gebruikt met behulp van de Selecteer Dataset-menu's. Meestal omvatten deze alleen de vector en prooimonsters gekweekt onder niet-selectieve omstandigheden en het prooimonster gekweekt onder selectievoorwaarden.Het laden van de gegevens en de gennaam kan aanvankelijk enige tijd duren met het Blast Query-programma, maar zodra de dataset is geladen, gaat het veel sneller. Blast_Query zal de fusiepunten langs de sequentie van belang weergeven en hoe abundant elk fusiepunt is. Dit kan zowel in een tabelformaat worden weergegeven met behulp van het Resultaten-tabblad als in een grafische indeling met behulp van het Plot-tabblad.Om deze resultaten naar een csv-bestand te exporteren, klikt u op de Opslaan csv-knop in de bovenste rechterhoek. Klik in het DEEPN-venster op de Leesdiepte-knop onder Analyseer Gegevens. Zodra het Leesdiepte-venster geopend is, typt u het NM-nummer in het bovenste tekstvak.Gebruik het pull-down menu om de relevante dataset te selecteren die het verrijkte gen van belang bevat. Gebruik de tabel aan de linkerkant en de grafische weergave aan de rechterkant om te bepalen hoeveel lezingen er in de gegevens zijn gevonden die overeenkomen met het gen van belang. Het Stat Maker-programma produceert een Excel-weergavebaar bestand dat de relevante informatie samenvat die

informatic-analysis-of-sequence-data-from-batch-yeast-2-hybrid-screens

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Microarray analyse voor Saccharomyces cerevisiae</em

We hebben uitgebreide, onpartijdige genoom-brede schermen van gen-drugs-en gen-omgeving interacties te begrijpen. Methoden voor het screenen van deze mutant collecties worden gepresenteerd.

Concurrerende Genomische Schermen van streepjescode Gist Bibliotheken

Dit artikel richt zich op de identificatie van hoog-vertrouwen interactie datasets tussen gastheer en pathogeen-eiwitten met behulp van een combinatie van twee orthogonale methoden: gist twee-hybride, gevolgd door een high-throughput interactie test bij zoogdiercellen genaamd HT-GPCA.

Een vergelijkende benadering van het Landschap van gastheer-pathogeen eiwit-eiwit interacties karakteriseren

Dit protocol beschrijft een high-throughput methodologie om functioneel scherm op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae.

High-throughput Screening op basis van eiwitten erfdeel in S. cerevisiae

Hier presenteren we een protocol met behulp van RNA-seq mRNA niveaus volgen na verloop van tijd tijdens de hypoxische reactie van S. cerevisiae cellen. Deze methode kan worden aangepast aan het analyseren van genexpressie tijdens elke cellulaire reactie.

Het meten van de mRNA niveaus na verloop van tijd tijdens de gist S. cerevisiae hypoxische reactie

Beschrijven we een techniek voor het combineren van stroom cytometry en hoge doorvoer sequencing te identificeren laat replicerende regio's van het genoom.

G2-seq: Een High Throughput Sequencing gebaseerde techniek voor het identificeren van laat repliceren regio's van het genoom

Batch-verwerking van gist 2-hybrid schermen zorgt voor directe vergelijking van de profielen van de interactie van meerdere aas eiwitten met een zeer complexe verzameling prooi fusion eiwitten. We beschrijven hier, verfijnde methoden, nieuwe reagentia en het implementeren van het gebruik ervan voor dergelijke schermen.

Een gist 2-Hybrid scherm in Batch om te vergelijken eiwitinteractie

Wij presenteren een eenvoudige suppressor scherm protocol in kernsplijting gist. Deze methode is efficiënt, mutageen-vrije en selectieve voor mutaties die vaak bij een enkele genomic locus voorkomen.  Het protocol is geschikt voor het isoleren van suppressors die verlichten van gebreken van de groei in vloeibare cultuur die worden veroorzaakt door een mutatie of een drug.

Een Deep-sequencing-bijgewoonde, spontane Suppressor scherm in de kernsplijting gist Schizosaccharomyces pombe

Een knelpunt in de 'design-build-test' cyclus van microbiële engineering is de snelheid waarmee we functionele schermen van stammen kunnen uitvoeren. We beschrijven een high-throughput methode voor stam screening toegepast op honderden tot duizenden gistcellen per experiment dat droplet-gebaseerde RNA sequencing gebruikt.

Hoge doorvoer Gist Stam Federtyping met Droplet-Based RNA Sequencing

Verrijking en sequentiebepaling van proteïne-geassocieerd nieuwvormings-DNA (eSPAN) is ontwikkeld om de relatieve abundantie van een chromatine-geassocieerd eiwit op twee replicerende DNA-strengen te detecteren, waardoor moleculaire inzichten in chromatine-replicatie en de gekoppelde processen worden onthuld. Dit protocol beschrijft eSPAN-procedures in gist- en muis embryonale stamcellen (ES).

Strandspecifieke analyse van eiwitten bij replicatie van DNA-strengen door verrijking en sequentiebepaling van eiwit-geassocieerd naissant DNA-methode

Leer bio-informatica-analyse van diepsequencingdata uit gist 2-hybrid schermen met MAPster-software. Deze gebruiksvriendelijke methode maakt eiwitinteractie-onderzoek toegankelijk voor onderzoekers zonder uitgebreide bio-informatica-expertise.

Informatic analyse van sequencedata van Batch gist 2-Hybrid schermen

Meer video's verkennen