Decellularization en Recellularization methodologie voor menselijke Saphenous aderen
27 juli 2018
Hier beschrijven we een protocol voor de decellularization van de saphenous ader met behulp van detergenten en recellularization door perfusie van het perifere bloed en het endotheel medium.
Deze methode legt een gedetailleerde procedure uit voor weefselengineering van de safeneveine. We demonstreren ook de voorbereiding van decellularisatie-opstellingen en een bioreactor voor recellularisatie met behulp van eenvoudige apparatuur. Het grote voordeel van deze techniek is dat een eenvoudige bloedmonster vereist is voor recellularisatie, waardoor pijnlijke beenmergverzameling en tijdrovende celcultuurprocedures worden geëlimineerd.
Voor Triton-X 100 perfusie en wassen, bereid decellularisatie-opstelling een voor. Plak alle drie de stukken van buis A op een tweeliterkamer. Plak één buis op de muur waar de rand de bodem van de kamer raakt voor de inlaat van het detergent. Plak de andere twee buizen op de tegenoverliggende muur met een afstand van vijf tot 10 centimeter ertussen, afhankelijk van de lengte van de ader.
Ten minste vijf centimeter van deze buizen moeten ook op de bodem van de kamer worden vastgeplakt. Verbind de inlaatbuis van het detergent met buis B met behulp van de mannelijke en vrouwelijke lure-connectors. Verbind vervolgens buis B met buis F, en buis F met buis C. Verbind buis C met de aderinlaat.
Plaats nu buis F in de cassette van de peristaltische pomp. Neem een andere buis C en verbind de ene kant met de uitlaat van de ader. Plaats de andere kant in een glazen pot uitgerust met een bodemslanguitlaat en gepositioneerd 45 centimeter boven de kamer, en plak deze vast om het te beveiligen.
Dit dient als de uitlaat van het detergent. Duw vervolgens het ene uiteinde van buis G in de slanguitlaat van de glazen pot en plaats het andere uiteinde in de aderkamer. Bereid vervolgens decellularisatie-opstelling twee voor TnBP-perfusie zoals beschreven in de tekstprotocol.
Bereid ook decellularisatie-opstelling drie voor DNA-perfusie zoals beschreven in de tekst, en plaats deze op 37 graden Celsius. Om de recellularisatiebioreactor voor te bereiden, steek buis H in één poort van een vierpoorts dop om als uitlaat van de ader te dienen. In de tweede poort, steek buis I in om als media-inlaat te dienen.
En in de derde poort, steek buis J in voor de inlaat van de ader. Plaats vervolgens het andere uiteinde van buis H in de vierde poort om als media-uitlaat te dienen. Verbind de verlaagde connectoren met de binnenste uiteinden van buizen H en J. Buig het andere uiteinde van buis J in een U-vorm en bind het met een hechting vast.
Plaats nu een 60 milliliterbuis met een platte bodem in een 250 milliliterglas. Verbind vervolgens het ene uiteinde van buis K met de inlaat van de ader en verbind het andere uiteinde met buis E. Verbind buis E met een tweede buis K en vervolgens met de media-inlaat. Plaats vervolgens de voorbereide dop-opstelling in de buis die aanwezig is in de fles.
Steriliseer ten slotte de bioreactor door autoclavage. Voer twee vries-ontdood cycli uit op een menselijke safeneveine zoals beschreven in het tekstprotocol voordat u een biopsie van twee millimeter lengte met schaar snijdt. Fixeer de biopsie gedurende 24 tot 48 uur bij kamertemperatuur in formaldehyde.
Bind elk uiteinde van de ader met een hechting aan de haken van een mannelijke en vrouwelijke lure-connector. Verbind de ader met decellularisatie-opstelling een en vul de kamer met één liter oplossing twee. Perfuseer nu gedurende 15 minuten bij 35 milliliter per minuut en maak de inhoud van de opstelling leeg.
Voeg vervolgens één liter oplossing vier toe en perfuseer gedurende vier uur bij 35 milliliter per minuut. Maak de inhoud leeg, voeg 500 milliliter oplossing twee toe, perfuseer gedurende vijf minuten en maak opnieuw de inhoud leeg. Ontkoppel de ader van perfusie-opstelling een en verbind het met perfusie-opstelling twee.
Voeg vervolgens één liter oplossing vijf toe, zet de roerder aan en perfuseer gedurende vier uur bij 35 milliliter per minuut. Ontkoppel de ader van perfusie-opstelling twee en was de buitenkant van de ader twee keer met 20 milliliter ultrapuur water. Gebruik vervolgens een spuit om de binnenkant van de ader twee keer met 20 milliliter ultrapuur water gedurende vijf tot 10 minuten te wassen.
Na perfusie met perfusie-opstelling drie zoals beschreven in het tekstprotocol, verbind de ader met perfusie-opstelling een. Vul één liter oplossing twee en perfuseer een nacht lang bij 35 milliliter per minuut. Herhaal het perfusieproces vier keer voor volledige verwijdering van nucleair materiaal.
Na de perfusie, maak de opstelling leeg, vul één liter oplossing twee en perfuseer gedurende 24 uur bij 35 milliliter per minuut. Na 24 uur, maak de opstelling opnieuw leeg en vul deze met één liter ultrapuur water. Perfuseer nog eens 24 uur bij 35 milliliter per minuut.
Herhaal tenslotte de perfusie onder dezelfde omstandigheden maar met oplossing zeven. Na verificatie van decellularisatie zoals beschreven in het tekstprotocol, steriliseer de ader door het in een 50 milliliterbuis te plaatsen die 50 milliliter oplossing acht bevat. Roer gedurende één uur bij 37 graden Celsius met 80 rotaties per minuut in een shaker.
Werk in een laminaire stromingskast om de steriliteit te behouden, gebruik nu steriele pincetten om de steriele ader over te brengen naar een nieuwe 50 milliliterbuis met 50 milliliter steriele oplossing zeven, bevattende 500 microliter anti-anti. Roer de ader zoals eerder gedurende 12 uur, waarbij oplossing zeven minstens twee keer wordt ververst. Gebruik steriele pincetten om de ader over te brengen naar een nieuwe 50 milliliterbuis, voeg 50 milliliter endotheelmedium toe en roer gedurende 11 uur.
Verbind nu de ader door het met steriele hechting en pincetten aan de inlaat en uitlaat van de bioreactor te binden en de dop-opstelling aan de 250 milliliterfles vast te zetten. Vul de bioreactor met hetzelfde endotheelmedium. Voeg heparine toe bij 50 eenheden per milliliter en perfuseer gedurende één
Overzicht
Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor de decellularisatie van de vena saphena met behulp van detergentia en de daaropvolgende recellularisatie via perfusie met perifeer bloed en endotheelmedium. De methode vereenvoudigt het proces door gebruik te maken van een eenvoudige bloedafname, waardoor invasievere procedures worden vermeden.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk vakgebied
- Weefseltechnologie
- Regeneratieve Geneeskunde
- Vasculaire Biologie
Achtergrond
- Decellularisatie is essentieel voor het creëren van scaffolds in tissue engineering.
- Traditionele methoden vereisen vaak complexe celkweektechnieken.
- Het gebruik van bloedmonsters voor recellularisatie kan het ongemak voor de patiënt verminderen.
- Endotheelmedium speelt een belangrijke rol bij de regeneratie van vasculair weefsel.
Doel van de studie
- Het ontwikkelen van een eenvoudig protocol voor de decellularisatie van de vena saphena.
- Het faciliteren van recellularisatie met behulp van gemakkelijk verkrijgbare bloedmonsters.
- Het verbeteren van de efficiëntie van technieken voor weefselengineering.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van decellularisatie-opstellingen met Triton-X 100 en andere oplossingen.
- Gebruik van een bioreactor voor het recellularisatieproces.
- Perfusietechnieken om een grondige decellularisatie en daaropvolgende celzaaiing te waarborgen.
- Monitoring van glucosespiegels om de levensvatbaarheid van het recellulariseerde weefsel te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol decellulariseert de vena saphena succesvol.
- Recellularisatie met bloed en endotheelmedium is bereikt.
- Glucosemonitoring wees op metabole activiteit in het recellulariseerde weefsel.
- De methode bleek efficiënt en minder invasief in vergelijking met traditionele technieken.
Conclusies
- Dit protocol biedt een levensvatbaar alternatief voor vasculaire weefselengineering.
- Het gebruik van bloedmonsters vereenvoudigt het recellularisatieproces.
- De methode heeft potentiële toepassingen in de regeneratieve geneeskunde.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de industrie
Decellularisatie en recellularisatie van menselijke venae saphenae maken de generatie van patiëntspecifieke vasculaire grafts mogelijk, waardoor de afhankelijkheid van allogene of synthetische conduits die risico's op immunosuppressie en een slechte doorlaatbaarheid met zich meebrengen, wordt verminderd. Deze aanpak ondersteunt het voorspellende vertrouwen in de graftfunctionaliteit door gebruik te maken van autoloog perifeer bloed, waardoor de risico's in translationele trajecten binnen de vasculaire tissue engineering worden beperkt. De methode biedt een schaalbaar platform voor preklinische evaluatie van gepersonaliseerde grafts, wat in lijn is met de bedrijfsdoelstellingen van risicogebalanceerde vooruitgang in pijplijnen voor regeneratieve geneeskunde.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het mogelijk om de biocompatibiliteit en thrombogeniciteit van vasculaire grafts te onderzoeken met behulp van autologe cellen afgeleid uit bloed.
- Operationele waarde: Vermindert de noodzaak voor invasieve celwinning, waardoor het testen van hypothesen in vasculaire regeneratiemodellen wordt vereenvoudigd.
Screening & assayontwikkeling
- Wetenschappelijke waarde: Produceert gestandaardiseerde, gedecellulariseerde scaffolds met een kwantificeerbare retentie van de extracellulaire matrix voor een consistente zaefficiëntie.
- Operationele waarde: Ondersteunt reproduceerbare, op perfusie gebaseerde recellularisatie-assays met behulp van eenvoudige bloedmonsters, wat high-throughput levensvatbaarheidsscreening mogelijk maakt.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Wetenschappelijke waarde: Demonstreert luminale endotheelisatie en metabole activiteit via glucosemonitoring, wat bijdraagt aan de functionele beoordeling van het transplantaat.
- Operationele waarde: Faciliteert preconitionering en rijping in bioreactoren, waardoor de gereedheid voor implantatiestudies wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Maakt risico-gecorrigeerde prioritisering van transplantaatkandidaten mogelijk door meetbare resultaten van recellularisatie.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode is geïntegreerd in het ontdekkingscontinuüm, van targetvalidatie via lead-identificatie tot preklinische evaluatie, en biedt een herbruikbaar platform voor de ontwikkeling van vasculaire grafts.
- Discovery Biology: Ondersteunt hypothesetests over cel-scaffold-interacties en de integriteit van de extracellulaire matrix met behulp van gedecellulariseerde menselijke aders.
- Screening: Maakt gestandaardiseerde recellularisatie-assays mogelijk met perfusie-gedefinieerde schuifspanning en nutriëntentoevoer voor reproduceerbare endotheliale bedekking.
- Analytics: Glucosemonitoring en histologische kleuring leveren kwantitatieve resultaten voor metabole activiteit en cellulaire aanhechting, waardoor vergelijking van condities mogelijk wordt.
- Translational Research: Verbindt scaffold-optimalisatie in de ontdekkingsfase met preklinische validatie via autologe celzaai en functionele rijping.
- Enterprise Reuse: Vestigt een platformcapaciteit voor het genereren van patiëntspecifieke vasculaire grafts voor meerdere adertypes, waardoor de afhankelijkheid van aangepaste celkweek wordt verminderd.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellende vertrouwen in de graftfunctionaliteit door endotheelialisatie en metabole activiteit in recellulariseerde aderen aan te tonen.
- Operationele waarde: Standaardiseert workflows voor decellularisatie en perfusie, waardoor de reproduceerbaarheid tussen runs en laboratoria wordt verbeterd.
- Strategische waarde: Vermindert het biologische risico in de late fase van ontwikkeling door autologe grafttesten mogelijk te maken voorafgaand aan klinisch gebruik.
- Impact op portfolio: Ondersteunt risicogebaseerde beslissingen over verdere ontwikkeling via kwantificeerbare recellularisatiemetrieken en indicatoren voor graft-doorgankelijkheid.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in tissue engineering, perfusiesystemen en steriele celkweek.
- Afhankelijk van bioreactorinfrastructuur, peristaltische pompen en gecontroleerde incubatieomgevingen.
- Standaardisatie van perfusieparameters, oplossingsformuleringen en glucosemonitoringsprotocollen is noodzakelijk.
- Aanpassing aan andere vene-typen kan optimalisatie van de decellularisatiecycli en recellularisatiecondities vereisen.
- Praktische beperkingen omvatten de doorlooptijd van 20 dagen voor de volledige verwerking en de noodzaak van aseptisch onderhoud gedurende het gehele proces.
