Decellularization en Recellularization methodologie voor menselijke Saphenous aderen
July 27th, 2018
Hier beschrijven we een protocol voor de decellularization van de saphenous ader met behulp van detergenten en recellularization door perfusie van het perifere bloed en het endotheel medium.
Deze methode legt een gedetailleerde procedure uit voor weefselengineering van de safeneveine. We demonstreren ook de voorbereiding van decellularisatie-opstellingen en een bioreactor voor recellularisatie met behulp van eenvoudige apparatuur. Het grote voordeel van deze techniek is dat een eenvoudige bloedmonster vereist is voor recellularisatie, waardoor pijnlijke beenmergverzameling en tijdrovende celcultuurprocedures worden geëlimineerd.
Voor Triton-X 100 perfusie en wassen, bereid decellularisatie-opstelling een voor. Plak alle drie de stukken van buis A op een tweeliterkamer. Plak één buis op de muur waar de rand de bodem van de kamer raakt voor de inlaat van het detergent. Plak de andere twee buizen op de tegenoverliggende muur met een afstand van vijf tot 10 centimeter ertussen, afhankelijk van de lengte van de ader.
Ten minste vijf centimeter van deze buizen moeten ook op de bodem van de kamer worden vastgeplakt. Verbind de inlaatbuis van het detergent met buis B met behulp van de mannelijke en vrouwelijke lure-connectors. Verbind vervolgens buis B met buis F, en buis F met buis C. Verbind buis C met de aderinlaat.
Plaats nu buis F in de cassette van de peristaltische pomp. Neem een andere buis C en verbind de ene kant met de uitlaat van de ader. Plaats de andere kant in een glazen pot uitgerust met een bodemslanguitlaat en gepositioneerd 45 centimeter boven de kamer, en plak deze vast om het te beveiligen.
Dit dient als de uitlaat van het detergent. Duw vervolgens het ene uiteinde van buis G in de slanguitlaat van de glazen pot en plaats het andere uiteinde in de aderkamer. Bereid vervolgens decellularisatie-opstelling twee voor TnBP-perfusie zoals beschreven in de tekstprotocol.
Bereid ook decellularisatie-opstelling drie voor DNA-perfusie zoals beschreven in de tekst, en plaats deze op 37 graden Celsius. Om de recellularisatiebioreactor voor te bereiden, steek buis H in één poort van een vierpoorts dop om als uitlaat van de ader te dienen. In de tweede poort, steek buis I in om als media-inlaat te dienen.
En in de derde poort, steek buis J in voor de inlaat van de ader. Plaats vervolgens het andere uiteinde van buis H in de vierde poort om als media-uitlaat te dienen. Verbind de verlaagde connectoren met de binnenste uiteinden van buizen H en J. Buig het andere uiteinde van buis J in een U-vorm en bind het met een hechting vast.
Plaats nu een 60 milliliterbuis met een platte bodem in een 250 milliliterglas. Verbind vervolgens het ene uiteinde van buis K met de inlaat van de ader en verbind het andere uiteinde met buis E. Verbind buis E met een tweede buis K en vervolgens met de media-inlaat. Plaats vervolgens de voorbereide dop-opstelling in de buis die aanwezig is in de fles.
Steriliseer ten slotte de bioreactor door autoclavage. Voer twee vries-ontdood cycli uit op een menselijke safeneveine zoals beschreven in het tekstprotocol voordat u een biopsie van twee millimeter lengte met schaar snijdt. Fixeer de biopsie gedurende 24 tot 48 uur bij kamertemperatuur in formaldehyde.
Bind elk uiteinde van de ader met een hechting aan de haken van een mannelijke en vrouwelijke lure-connector. Verbind de ader met decellularisatie-opstelling een en vul de kamer met één liter oplossing twee. Perfuseer nu gedurende 15 minuten bij 35 milliliter per minuut en maak de inhoud van de opstelling leeg.
Voeg vervolgens één liter oplossing vier toe en perfuseer gedurende vier uur bij 35 milliliter per minuut. Maak de inhoud leeg, voeg 500 milliliter oplossing twee toe, perfuseer gedurende vijf minuten en maak opnieuw de inhoud leeg. Ontkoppel de ader van perfusie-opstelling een en verbind het met perfusie-opstelling twee.
Voeg vervolgens één liter oplossing vijf toe, zet de roerder aan en perfuseer gedurende vier uur bij 35 milliliter per minuut. Ontkoppel de ader van perfusie-opstelling twee en was de buitenkant van de ader twee keer met 20 milliliter ultrapuur water. Gebruik vervolgens een spuit om de binnenkant van de ader twee keer met 20 milliliter ultrapuur water gedurende vijf tot 10 minuten te wassen.
Na perfusie met perfusie-opstelling drie zoals beschreven in het tekstprotocol, verbind de ader met perfusie-opstelling een. Vul één liter oplossing twee en perfuseer een nacht lang bij 35 milliliter per minuut. Herhaal het perfusieproces vier keer voor volledige verwijdering van nucleair materiaal.
Na de perfusie, maak de opstelling leeg, vul één liter oplossing twee en perfuseer gedurende 24 uur bij 35 milliliter per minuut. Na 24 uur, maak de opstelling opnieuw leeg en vul deze met één liter ultrapuur water. Perfuseer nog eens 24 uur bij 35 milliliter per minuut.
Herhaal tenslotte de perfusie onder dezelfde omstandigheden maar met oplossing zeven. Na verificatie van decellularisatie zoals beschreven in het tekstprotocol, steriliseer de ader door het in een 50 milliliterbuis te plaatsen die 50 milliliter oplossing acht bevat. Roer gedurende één uur bij 37 graden Celsius met 80 rotaties per minuut in een shaker.
Werk in een laminaire stromingskast om de steriliteit te behouden, gebruik nu steriele pincetten om de steriele ader over te brengen naar een nieuwe 50 milliliterbuis met 50 milliliter steriele oplossing zeven, bevattende 500 microliter anti-anti. Roer de ader zoals eerder gedurende 12 uur, waarbij oplossing zeven minstens twee keer wordt ververst. Gebruik steriele pincetten om de ader over te brengen naar een nieuwe 50 milliliterbuis, voeg 50 milliliter endotheelmedium toe en roer gedurende 11 uur.
Verbind nu de ader door het met steriele hechting en pincetten aan de inlaat en uitlaat van de bioreactor te binden en de dop-opstelling aan de 250 milliliterfles vast te zetten. Vul de bioreactor met hetzelfde endotheelmedium. Voeg heparine toe bij 50 eenheden per milliliter en perfuseer gedurende één
Overzicht
Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor de decellularisatie van de vena saphena met behulp van detergenten en de daaropvolgende recellularisatie door middel van perfusie met perifeer bloed en endotheelmedium. De methode vereenvoudigt het proces door gebruik te maken van een eenvoudige bloedmonster, waardoor meer invasieve procedures worden vermeden.
Belangrijke studiecomponenten
Gebieden van wetenschap
- Weefsel engineering
- Regeneratieve geneeskunde
- Vasculaire biologie
Achtergrond
- Decellularisatie is cruciaal voor het creëren van scaffolds in weefsel engineering.
- Traditionele methoden vereisen vaak complexe celcultuurtechnieken.
- Het gebruik van bloedmonsters voor recellularisatie kan het ongemak van de patiënt verminderen.
- Endotheelmedia spelen een belangrijke rol bij de regeneratie van vasculair weefsel.
Doel van het onderzoek
- Om een eenvoudig protocol te ontwikkelen voor de decellularisatie van de vena saphena.
- Om recellularisatie te vergemakkelijken met behulp van gemakkelijk verkrijgbare bloedmonsters.
- Om de efficiëntie van weefsel engineeringtechnieken te verbeteren.
Gebruikte methoden
- Voorbereiding van decellularisatie-opstellingen met behulp van Triton-X 100 en andere oplossingen.
- Gebruik van een bioreactor voor het recellularisatieproces.
- Perfusietechnieken om een grondige decellularisatie en daaropvolgende celzaaien te garanderen.
- Bewaking van glucoseniveaus om de levensvatbaarheid van het gerecellulariseerde weefsel te beoordelen.
Belangrijkste resultaten
- Het protocol decellulariseert met succes de vena saphena.
- Recellularisatie met bloed en endotheelmedia werd bereikt.
- Glucosebewaking gaf metabole activiteit in het gerecellulariseerde weefsel aan.
- De methode bleek efficiënt en minder invasief te zijn in vergelijking met traditionele technieken.
Conclusies
- Dit protocol biedt een levensvatbaar alternatief voor vasculaire weefsel engineering.
- Het gebruik van bloedmonsters vereenvoudigt het recellularisatieproces.
- De methode heeft potentiële toepassingen in de regeneratieve geneeskunde.
Veelgestelde vragen
Executive Industry Relevance
Decellularization and recellularization of human saphenous veins enable the generation of patient-specific vascular grafts, reducing reliance on allogeneic or synthetic conduits that carry risks of immunosuppression and poor patency. This approach supports predictive confidence in graft functionality by using autologous peripheral blood, thereby de-risking translational pathways in vascular tissue engineering. The method provides a scalable platform for preclinical evaluation of personalized grafts, aligning with enterprise goals of risk-adjusted advancement in regenerative medicine pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of vascular graft biocompatibility and thrombogenicity using autologous blood-derived cells.
- Operational Value: Reduces need for invasive cell sourcing, simplifying hypothesis testing in vascular regeneration models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces standardized, decellularized scaffolds with quantifiable extracellular matrix retention for consistent seeding efficiency.
- Operational Value: Supports reproducible perfusion-based recellularization assays using simple blood samples, enabling high-throughput viability screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates luminal endothelialization and metabolic activity via glucose monitoring, supporting functional graft assessment.
- Operational Value: Facilitates preconditioning and maturation in bioreactors, improving readiness for implantation studies.
- Strategic Value: Enables risk-adjusted prioritization of graft candidates through measurable recellularization outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, providing a reusable platform for vascular graft development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on cell-scaffold interactions and extracellular matrix integrity using decellularized human veins.
- Screening: Enables standardized recellularization assays with perfusion-defined shear stress and nutrient delivery for reproducible endothelial coverage.
- Analytics: Glucose monitoring and histological staining provide quantitative readouts for metabolic activity and cellular attachment, enabling condition comparison.
- Translational Research: Connects discovery-phase scaffold optimization to preclinical validation through autologous cell seeding and functional maturation.
- Enterprise Reuse: Establishes a platform capability for generating patient-specific vascular grafts across multiple vein types, reducing dependency on custom cell culture.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence in graft functionality by demonstrating endothelialization and metabolic activity in recellularized veins.
- Operational Value: Standardizes decellularization and perfusion workflows, improving reproducibility across runs and laboratories.
- Strategic Value: Reduces biological risk in late-stage development by enabling autologous graft testing prior to clinical use.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement decisions through quantifiable recellularization metrics and graft patency indicators.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue engineering, perfusion systems, and sterile cell handling.
- Dependent on bioreactor infrastructure, peristaltic pumps, and controlled incubation environments.
- Necessitates standardization of perfusion parameters, solution formulations, and glucose monitoring protocols.
- Adaptation to other vein types may require optimization of decellularization cycles and recellularization conditions.
- Practical limitations include the 20-day timeline for full processing and the need for aseptic maintenance throughout.
