Name: Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Leer de isolatie en adipogene inductie van CD34+CD31+ endotheliale cellen uit menselijk vetweefsel. Deze methode maakt onderzoek naar obesitas en adipocytendifferentiatie mogelijk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs willen erkennen Becky Marquez, de klinische coördinator op de Sentara Bariatric Center, voor haar hulp bij het proces van patiënt screening en toestemming. Dit onderzoek werd gesteund door R15HL114062 aan Anca D. Dobrian.

De institutionele Commissie bestuur ter beoordeling aan Oost-Virginia Medical School goedgekeurd het onderzoek en het verzamelen van monsters van menselijke adipeus weefsel gebruikt in de studie. Geïnformeerde schriftelijke toestemming was verkregen van de patiënten.
1. bereiding van Buffers, Media en instrumenten
<ol><li>Bereiden van een oplossing van Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 mM natriumchloride, kaliumchloride van 5 mM, 1 mM magnesium-sulfaat, 0,4 mM kalium fosfaat dibasische, 5.5 mM glucose, 1 mM adenosine, 0,01% antibioticum/antimycotic mix (50 µg/mL penicilline, 50 µg/mL streptomycine, 30 µg/mL gentamicine, 15 ng/mL Amfotericine) en 10 mM HEPES (pH = 7.4). Deze oplossing is telkens voor het weefsel verzamelen en spijsvertering vers bereid.</li>
	<li>Bereid een verse collagenase-oplossing: 1 mg/mL collagenase, type 1, in KRBSS; 3 mL/g vet maken Vooraf warm de collagenase oplossing bij 37 ° C in een waterbad voorafgaand aan de vertering van het weefsel.</li>
	<li>Voorbereiden van een CD34 isolatie van de cel Buffer: 2% foetale runderserum (FBS) en 1 mM EDTA in steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
	<li>Het bereiden van Adipogenesis Media: DMEM/F12, 5% FBS, 50 µg/mL penicilline/streptomycine, 1,25 µL/mL van menselijke insuline (5 µg/mL of 144 mU/mL) en 0,36 µL/mL van 2,8 mM Rosiglitazon (1 µM).</li>
	<li>Bereid een stamoplossing 0,3% olie Red O (ORO) (gewicht/volume) door ontbinding van 0,3 g Oro in 100 mL isopropanol.</li>
</ol>2. obesitas stromale vasculaire breuk isolatie
Opmerking: De studie omvatte een transversale cohort van morbide obesitas type 2-diabetes (T2D) en niet-diabetische onderwerpen, leeftijd 18-65 jaar, een bariatrische operatie ondergaan op de Sentara Metabolic en Weight Loss Surgery Center (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Uitsluitingscriteria opgenomen een auto-immune ziekte, met inbegrip van type 1 diabetes mellitus, aandoeningen waarvoor chronische immunosuppressieve therapie, anti-inflammatoire geneesmiddelen, thiazolinendiones, actieve tabaksgebruik, chronische of acute infecties of een geschiedenis van maligniteit behandeld binnen de afgelopen 12 maanden. T2D werd gedefinieerd als een plasma glucosegehalte van 126 mg/dL of hoger, een glucose van 200 mg/dL of groter nadat een 2 h glucosetolerantie test, of het gebruik van antidiabetica medicijnen.
<ol><li>Menselijke omental (OM) en onderhuidse (SC) adipeus weefsel (AT) ophalen door proefpersonen een bariatrische operatie ondergaan.</li>
	<li>Houd de OM en SC AT in aparte flesjes met Henks gebufferde zoutoplossing met 50 µg/mL penicilline/streptomycine bij kamertemperatuur onmiddellijk na extractie van het weefsel.</li>
	<li>Zorgvuldig reinigen en verwijderen van fibrotische en dichtgeschroeid secties van het weefsel met 70% ethanol afgestreken schaar en pincet, wanneer het monster in het lab na de extractie weefsel arriveert.</li>
	<li>Weeg het vetweefsel en partitioneren van it in 5 g (of minder) aliquots voor de vertering van collagenase.</li>
	<li>Fijn blad voor 5 g van het AT in 5 mL van de oplossing van een collagenase in een flesje Scintillatie bij kamertemperatuur, met behulp van twee paar van schaar.</li>
	<li>Voeg een extra 10 mL van collagenase oplossing aan het gehakt weefsel voor 15 mL totaal.</li>
	<li>Verteren de monsters gedurende 1 uur, bij 37 ° C, in een waterbad met continue schudden.</li>
	<li>Snijd het puntje uit een 20 mL spuit om een botte uiteinde.</li>
	<li>Knip een 9 x 9 cm vierkant van een 250 µm mesh en duw het halverwege in een conische tube van 50 mL, met het botte uiteinde spuit.</li>
	<li>Giet de monsters in de spuit van 20 mL botte uiteinde en filter via de 250 µm nylon gaas in de conische buis van 50 mL te scheiden van adipocytes en stromale vasculaire cellen van onverteerd weefsel. Opmerking: Gebruik niet meer dan 5 g AT per conische tube van 50 mL, zoals de Maas raken als gevolg van overtollig fibrotische onverteerd materiaal verstopt zal.</li>
	<li>De Scintillatie flacon met 10 mL van KRBBS wassen en giet het door het filter voor het verzamelen van de resterende cellen.</li>
	<li>Incubeer de gefilterde monsters gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Opmerking: Deze stap is belangrijk met het oog op de adipocytes te zweven op de top van de buis en een aantal vasculaire stromale cellen te vestigen op de onderkant van de buis.</li>
	<li>Gebruik maken van een 20 mL spuit en een 20 G x 6 in pipetting naald te verwijderen van de laag stromale vasculaire breuk en overbrengen naar een schone 50 mL conische buis.</li>
	<li>Voeg 10 mL van de KRBBS en laat van de monsters te zitten op de Bank voor 5 min, bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Herhaal stap 2.12-2.14 tweemaal. Opmerking: Deze stappen zullen ervoor zorgen dat er geen besmetting van de stromale vasculaire cellen met de zwevende adipocytes.</li>
	<li>Houd de stromale vasculaire breuken van beide depots op ijs voor verdere verwerking, zoals beschreven in de onderstaande stappen. Opmerking: Laat de cellen niet op het ijs voor meer dan 1 h, zoals dit een effect op de levensvatbaarheid van de cellen hebben kan. De adipocytes kunnen flash-bevroren in vloeibare stikstof voor langdurige opslag of vers gebruikt voor experimenten.</li>
</ol>3. isolatie van vetweefsel endotheliale cellen
<ol><li>Draai de stromale vasculaire breuken (SVF) bij 500 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder de monsters uit de centrifuge en zorgvuldig giet af het supernatant; Houd de pellet met de FØROYA-cellen.</li>
	<li>Resuspendeer de cel-pellets voorzichtig in 5 mL PBS. Opmerking: Als er meer dan 5 g van een AT-depot werd verwerkt tot meerdere aliquots (zie stap 2.4), zwembad de cel pellets samen.</li>
	<li>Draaien van de monsters bij 500 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 1 mL PBS cellen tellen. Opmerking: Hier, een automatische cel teller werd gebruikt voor het tellen van de cel. De levensvatbaarheid van de cellen werd verkregen door menging van 12 µL celsuspensie met 12 µL van een oplossing van acridine oranje/propidium jodide (AO/HD-PI) (Zie Tabel van materialen). Het gemiddeld aantal cellen per gram AT voor elke depot is: (a) OM Depot: 1.69 x 105 ± 4,51 x 10-4; (b) SC-Depot: 1,24 x 105 ± 6.45 x 10-4. De levensvatbaarheid van de cellen van beide depots was > 90%.</li>
	<li>Pellet van de monsters bij 500 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C. Opmerking: Een CD34 protocol voor de selectie van de immunomagnetic (Zie Tabel van materialen) werd aangepast voor stappen 3.7-3.15.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 100 µL CD34 isolatie buffer. Opmerking: De cel totaal graven vereisen de volgende resuspensie volumes: (a) < 2 x 107 cellen: resuspendeer de pellet in 100 µL; (b) 2 x 108–5 x 108 cellen: resuspendeer de pellet in 1 mL. In stappen 3.9 – 3.16, het volume van de gebruikte reagentia werden verlaagd voor < 2 x 107 cellen.</li>
	<li>Voeg 10 µL van CD34 cocktail en Incubeer het monster gedurende 15 minuten, bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Voeg 5 µL van magnetische kralen en Incubeer het monster gedurende 10 minuten, bij kamertemperatuur.</li>
	<li>2,5 mL CD34 isolatie buffer toevoegen aan elk monster en plaats de monsters in de magneet, voor 5 min, bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Omkeren van de magneet voor 5 s tot giet af de isolatie-buffer.</li>
	<li>Verwijder de monsters uit de magneet en herhaal stap 3,10 en 3.11 4 x.</li>
	<li>Verwijderen van de buis van de magneet en voeg 2 mL CD34 isolatie buffer.</li>
	<li>Pellet de cellen bij 500 x g gedurende 5 min, bij 4 ° C.</li>
	<li>Resuspendeer de cel pellets in 1 mL CD34 isolatie buffer en de cellen tellen. Nota: Hier, het gemiddeld aantal cellen per gram AT is: (a) OM Depot: 4,75 x 104 ± 3.36 x 10-4; (b) SC-Depot: 1,06 x 104 ± 9,53 x 10-3. Een CD31 plastic immunobead protocol werd aangepast voor stappen 3.16 – 3,34 (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Pellet cellen bij 500 x g gedurende 5 min en resuspendeer de pellet in 250 µL van Buffer B en 250 µL van was buffer.</li>
	<li>Grondig resuspendeer de kralen CD31 door vortexing de buis.</li>
	<li>Voeg 20 µL van CD31 kralen. Opmerking: Als gevolg van de cel totaal telt > 1 x 106, het volume was verlaagd volgens de fabrikant input.</li>
	<li>Incubeer het monster met rockende gedurende 30 minuten, bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Een zeef hechten aan een steriele 50 mL conische buis. Opmerking: De grotere opening van de zeef moeten op de top.</li>
	<li>Voorafgaand aan de scheiding van de cel, voeg 1 mL was buffer naar de zeef equilibreer. Breng het mengsel die zijn verkregen onder stap 3.16 naar de zeef.</li>
	<li>Het wassen van de zeef met 5 mL was buffer in een cirkelvormige beweging voor een totaal volume van 20 mL. De verbindingslijn koppelt aan een steriele 50 mL conische buis en sluit de luer-lock.</li>
	<li>Bevestigt de zeef op de connector. Voeg 1 mL was buffer langs de muur van de zeef. Voeg vervolgens 1 mL van geactiveerde buffer D langs de muur van de zeef. Swirl van het monster zachtjes en laat het 10 min, bij kamertemperatuur inwerken.</li>
	<li>Voeg 1 mL was buffer. De cellen van de kralen door pipetteren op en neer 10 x scheiden. Opmerking: Vermijd het genereren van luchtbellen.</li>
	<li>Open de luer-lock en laat de vrijstaande cellen te stromen in de conische buis van 50 mL. Wassen van de zeef 10 x met 1 mL was buffer telkens.</li>
	<li>Negeren van de connector en zeef en centrifugeren van de monsters bij 300 x g gedurende 10 minuten, bij 4 ° C. Resuspendeer de pellet cel in 2 mL zuiver volledige BAVA-2 Media voor cultuur. Opmerking: Het gemiddeld aantal cellen per gram AT op dit punt is: (a) OM Depot: 5.92 x 103 ± 4.27 x 10-3; (b) SC-Depot: 4.12 x 103 ± 2.1 x 10-3. De levensvatbaarheid van cellen van beide depots was meer dan 90%.</li>
</ol>4. de inductie van Adipogenesis in geïsoleerde endotheliale cellen
<ol><li>Het groeien van de cellen in 6-Wells-platen Weefselkweek behandeld met volledige BAVA-2 media in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Vervang de media elke 3-4 dagen totdat de cellen samenvloeiing van 80-90%. Opmerking: De verdubbeling van de bevolking is tussen 2-3 dagen.</li>
	<li>Vouw de cellen door hen op 100 mm petrischalen plating en Splits de cellen 1:3 keer. In dit stadium zijn de cellen op passage 2.</li>
	<li>Graaf de cellen met behulp van een automatische cel counter (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Zaad ongeveer 100 – 200.000 cellen 6-Wells-platen zorgen voor dubbele putten voor elke depot en de cultuur die hen voltooien in BAVA-2 media voor 2 dagen.</li>
	<li>Gecombineerd uit alle media groei en 2 mL DMEM/F12 met 5% te vervangen FBS en 50 µg/mL penicilline/streptomycine voor het besturingselement cellen en 2 mL Adipogenesis media (zie stap 1.4) voor de behandeling cellen te vervangen.</li>
	<li>Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO2 incubator voor 13 dagen, ter vervanging van de respectieve media elke 3 tot 4 dagen. Opmerking: Cellen zal beginnen te accumuleren lipiden na 4 dagen behandeling.</li>
	<li>ORO en Nile rode kleuring volgens gepubliceerde methoden15-17verrichten.</li>
	<li>U kunt cellen voor een RNA extractie isoleren, verwijder het medium van de 6-well inductie platen en wassen met 1 mL steriele PBS.</li>
	<li>Voeg 350 µL van een guanidium kaliumthiocyanaat-fenol-chloroformoplossing (Zie Tabel van materialen) elk goed en na het bebroeden bij kamertemperatuur gedurende 5-10 minuten.</li>
	<li>De cellen uit de plaat met behulp van een cel schraper Schraap en de cellen overbrengen in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. Opmerking: De monsters kunnen worden opgeslagen in de vriezer-80 ° C voor RNA extractie en verdere verwerking op een later tijdstip.</li>
	<li>Uittreksel van mRNA uit de monsters met behulp van een aangepast RNA extractie protocol (Zie Tabel van materialen).</li>
	<li>Uitvoeren van een real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR) te beoordelen van de genexpressie met behulp van de volgende sondes: adiponectin, UCP-1 en CIDEA (Zie Tabel van materialen). Opmerking: Hier, RT-PCR procedures werden uitgevoerd met behulp van de volgende standaard protocol: denaturatie (95 ° C; 15 s), gloeien en uitbreiding (60 ° C; 1 min) voor 40 cycli. De monsters die genen met CT -waarden uitgedrukt > 35 werden beschouwd als niet detecteerbaar.</li>
</ol>

<ol><li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+fat+progenitor+cells+reside+in+the+adipose+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature.</a> Science. 322 (5901), 583-586 (2008).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+adipogenic+niche+for+adipose+tissue+remodeling+and+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration.</a> Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).</li>
<li>Min, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+%27brite%2Fbeige%27+adipocytes+develop+from+capillary+networks%2C+and+their+implantation+improves+metabolic+homeostasis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice.</a> Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).</li>
<li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li>
<li>Tran, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vascular+endothelium+of+the+adipose+tissue+gives+rise+to+both+white+and+brown+fat+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li>
<li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li>
<li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+bipotential+adipocyte+progenitors+recruited+by+beta3-adrenoceptor+activation+and+high-fat+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).</li>
<li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li>
<li>Villaret, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+endothelial+cells+from+obese+human+subjects%3A+differences+among+depots+in+angiogenic%2C+metabolic%2C+and+inflammatory+gene+expression+and+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence.</a> Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).</li>
<li>Miranville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+postnatal+neovascularization+by+human+adipose+tissue-derived+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells.</a> Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).</li>
<li>Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preadipocytes+in+the+human+subcutaneous+adipose+tissue+display+distinct+features+from+the+adult+mesenchymal+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).</li>
<li>Moller, D. E., Flier, J. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1881419">Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications.</a> The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li>
<li>Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+relationships+in+cultured+3T3-L1+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).</li>
<li>Satish, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+human+adipose-derived+stem+cells+during+in+vitro+differentiation+to+an+adipocyte+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Medical+Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage.</a> BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).</li>
<li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+vascular+endothelial+cells+in+culture.+Growth+and+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis.</a> The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).</li>
<li>Burridge, K. A., Friedman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment+and+vascular+bed+origin+influence+differences+in+endothelial+transcriptional+profiles+of+coronary+and+iliac+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).</li>
<li>Paruchuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pulmonary+valve+progenitor+cells+exhibit+endothelial%2Fmesenchymal+plasticity+in+response+to+vascular+endothelial+growth+factor-A+and+transforming+growth+factor-beta2%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2.</a> Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).</li>
<li>Hewett, P. W., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+microvessel+endothelial+cells%3A+isolation%2C+culture+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization.</a> In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).</li>
<li>Hewett, P. W., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lung+microvessel+endothelial+cells%3A+isolation%2C+culture%2C+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization.</a> Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).</li>
<li>Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+microvessel+endothelial+cells+from+human+mammary+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Development+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue.</a> In Vitro Cellular & Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).</li>
<li>Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+expansion+of+tumor-specific+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53072(2015).</li>
<li>Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+residing+progenitors+%28adipocyte+lineage+progenitors+and+adipose+derived+stem+cells+%28ADSC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Molecular+Biology+Reports%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC).</a> Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).</li>
<li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+endothelial+progenitor+cells+from+adipose+tissue+as+potential+angiogenic+cell+sources+for+bladder+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis.</a> PLoS One. 10 (2), e0117644(2015).</li>
<li>Curat, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+blood+monocytes+to+adipose+tissue-resident+macrophages%3A+induction+of+diapedesis+by+human+mature+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes.</a> Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).</li>
<li>Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concise+review%3A+evidence+for+CD34+as+a+common+marker+for+diverse+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors.</a> Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).</li>
<li>Traktuev, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+population+of+multipotent+CD34-positive+adipose+stromal+cells+share+pericyte+and+mesenchymal+surface+markers%2C+reside+in+a+periendothelial+location%2C+and+stabilize+endothelial+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks.</a> Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).</li>
<li>Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+of+adipose+tissues%3A+a+niche+of+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).</li>
<li>Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelial+cells+in+inflamed+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue.</a> Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).</li>
<li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+specific+cell-surface+markers+of+adipose-derived+stem+cells+from+subcutaneous+and+visceral+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li>
<li>Ong, W. K., Sugii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose-derived+stem+cells%3A+fatty+potentials+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).</li>
<li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+two+human+preadipocyte+subtypes+with+distinct+capacities+for+replication%2C+adipogenesis%2C+and+apoptosis+varies+among+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinoloy+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots.</a> American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).</li>
<li>van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinedione-induced+lipid+droplet+formation+during+osteogenic+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation.</a> Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De focus van dit document is bedoeld als een methode voor de isolatie, de uitbreiding en de adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van viscerale en onderhuidse magazijnen van menselijke adipeus weefsel.
Methoden zijn gemeld voor de isolatie van endotheliale cellen van de verschillende vasculaire bedden van knaagdieren of mensen waarbij voornamelijk technieken met behulp van CD31 antilichamen fluorescently label of gekoppeld aan magnetische kralen18<su...

Recente gegevens blijkt dat zowel bij muizen en bij de mens, een subset van cellen die woonachtig zijn in het vetweefsel therapieën kan worden gedifferentieerd in ofwel wit of beige/bruin adipocytes1,2,3. Het fenotype van dergelijke cellen is een onderwerp van controverse, met bewijs ter ondersteuning van endotheliale cellen, vlotte spier/pericyte of een spectrum van intermediaire fenotypen4,,5,,6,7. De werkingssfeer van de ontwikkeling van deze methode was voor het testen van het adipogenic potentieel van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van verschillende vet depots van zwaarlijvige mensen geïsoleerd. Andere studies in de literatuur zijn gericht op het potentieel van de totale stromale vasculaire fractie of van de bekende adipocyte progenitoren2,8,9adipogenic. Aangezien momenteel bestaande technologieën specifiek adipeus weefsel endotheliale cellen voor drug delivery10 richten kunnen, het begrip van het potentieel van dergelijke cellen ondergaan adipogenic-inductie naar wit of beige adipocytes is belangrijk voor toekomst gerichte therapieën.
Verschillende groepen gemeld de combinatie van CD31 en CD34-markeringen als surrogaten endotheliale cellen van menselijke adipeus weefsel11,12,13te isoleren. Doorgaans is de isolatie wordt uitgevoerd met behulp van twee opeenvolgende stappen en een positieve selectie met behulp van magnetische kralen. In dit verslag werd immunoseparation gebruikt CD34 + magnetische kralen gecombineerd met CD31 Kunststof kralen gebruikt. We vonden deze techniek superieur aan de sequentiële magnetische immunoseparation met betrekking tot het behoud van de typische geplaveide endothelial morfologie. Ook konden we genereren genoeg cellen die nodig zijn voor de uitbreiding en adipogenic inductie vanaf zo weinig als 1-2 g vet. De biopsie van een kleine steekproef van onderhuids vet is genoeg om de vereiste hoeveelheid cellen voor downstream toepassingen te produceren. Dit aspect is potentieel belangrijk, vooral als deze methode zal worden gebruikt voor de screening voor een alertheid op adipogenic inductie in menselijke proefpersonen.
In tegenstelling tot andere systemen gemeld in de literatuur, deze methode maakt gebruik van slechts twee ingrediënten voor de inductie van de adipogenic van de CD34 + CD31 + cellen: een agonist PPARγ — Rosiglitazon — en menselijke insuline. Nog belangrijker is, valt de hoeveelheid insuline gebruikt binnen het bereik van de normale/hoge van de circulerende post-absorptive insuline in mensen14. De mate van alertheid op insuline van de cellen in vitro, gemeten door Akt fosforylatie, doet niet correleren met hun vermogen om te reageren op de inductie cocktail. Interessant, deze inductie cocktail en experimentele voorwaarden gebruiken, een mix van witte en beige/bruin cellen werden verkregen zoals bepaald door de grootte en het aantal intracellulaire lipide druppels en de uitdrukking van moleculaire merkers. Dit eenvoudige en kosteneffectieve inductie protocol samen met de kwantitatieve beoordeling van het fenotype van de responder cellen (witte vs. beige) zorgt voor een screening van agenten die het saldo van gedifferentieerde beige potentieel kan veranderen : wit adipocytes.
Deze methode biedt ook een translationeel aanpak voor het begrip van de onderliggende mechanismen van adipogenesis van vasculaire endotheliale voorlopercellen in menselijke adipeus weefsel. Met behulp van deze specifieke isolatie/differentiatie techniek, kunnen onderzoekers verschillende trajecten verantwoordelijk voor adipogenesis in een subset van vasculaire endotheliale cellen van verschillende vet depots in mager en zwaarlijvige mensen ondervragen.

<table><tbody><tr><td> Grote apparatuur </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Bioveiligheidskabinet </td><td> Nuaire </td><td> nu-425-400 </td><td></td></tr><tr><td> Celcultuur incubator </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 800 DH </td><td></td></tr><tr><td> Waterbad </td><td> Forma Scientific </td><td> 2568 </td><td> Reciproke schudder </td></tr><tr><td> RT-PCR Machine </td><td> BIO-RAD </td><td> CFX96-C1000 </td><td></td></tr><tr><td> Elektroforesebox </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini PROTEAN 3 Cell </td><td></td></tr><tr><td> Transblot Box </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini Trans-Blot Cell </td><td></td></tr><tr><td> Elektroforese voeding </td><td> BIO-RAD </td><td> PowerPac Basic </td><td></td></tr><tr><td> ELISA Reader </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax M5 </td><td></td></tr><tr><td> Blot Reader </td><td> LI-COR </td><td> Odyssey </td><td> Near Infrared </td></tr><tr><td> Gekoelde centrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5810 R </td><td></td></tr><tr><td> Centrifuge voor op tafel </td><td> Eppendorf </td><td> MiniSpin Plus </td><td></td></tr><tr><td> Fluorescente microscoop </td><td> Olympus </td><td> BX50 </td><td></td></tr><tr><td> Omgekeerde microscoop </td><td> Nikon </td><td> TMS </td><td></td></tr><tr><td> KRBSS-buffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Research Products International </td><td> H75030 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumbicarbonaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 792519 </td><td></td></tr><tr><td> Calciumchloridedihydraat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7902 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumfosfaat monobasisch </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Magnesiumsulfaat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumchloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 746398 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumfosfaat monobasisch monohydraat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> Kaliumchloride </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Glucose </td><td> Acros Organics </td><td> 410950010 </td><td></td></tr><tr><td> Adenosine </td><td> Acros Organics </td><td> 164040250 </td><td></td></tr><tr><td> Rundserumalbumine </td><td> GE Healthcare Bio-Sciences </td><td> SH30574.02 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillin/Streptomycin </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Weefsel vertering </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20 mL spuit </td><td> Global Medical </td><td> 67-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Nylon gaas, 250 &micro;m </td><td> Sefar </td><td> 03-250/50 </td><td></td></tr><tr><td> Pipetterspuitjes </td><td> Popper </td><td> 7934 </td><td></td></tr><tr><td> Fijne schaar </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Weefseltang </td><td> George Tiemann &amp; Co </td><td> 160-20 </td><td></td></tr><tr><td> Collageenase, Type I </td><td> Worthington Biochemical </td><td> LS004196 </td><td></td></tr><tr><td> Petrischalen, 100 mm </td><td> USA Scientific </td><td> 5666-4160 </td><td> TC behandeld </td></tr><tr><td> Eppendorfbuisjes, 1,5 mL </td><td> USA Scientific </td><td> 1615-5500 </td><td></td></tr><tr><td> Kegelbuisjes, 15 mL </td><td> Nest Scientific </td><td> 601052 </td><td></td></tr><tr><td> Kegelbuisjes, 50 mL </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td></td></tr><tr><td> Scintillatiebuisjes </td><td> Kimble</p

isolatie, uitbreiding en adipogenic inductie van cd34 + cd31 + endotheliale cellen van menselijke omental en onderhuids vetweefsel

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesitas gaat vergezeld van een uitgebreide verbouwing van vetweefsel voornamelijk via adipocyte hypertrofie. Extreme adipocyte groei resulteert in een slechte reactie op insuline, lokale hypoxie en ontsteking. Door het stimuleren van de differentiatie van functionele witte adipocytes van voorlopercellen, radicale hypertrofie van de adipocyte bevolking kan worden voorkomen en, bijgevolg, de metabole gezondheid van vetweefsel verbeterd kan worden samen met een vermindering van ontsteking. Ook, door het stimuleren van een differentiatie van beige/bruin adipocytes, de totale lichaam energie-uitgaven kan worden verhoogd, wat resulteert in gewichtsverlies. Deze aanpak kan voorkomen dat de ontwikkeling van obesitas co morbiditeit zoals type 2 diabetes en hart-en vaatziekten.
Deze paper beschrijft de isolatie, uitbreiding en differentiatie van wit en beige adipocytes uit een subset van menselijk vetweefsel endotheliale cellen die mede het uitdrukken van de markeringen van CD31 en CD34. De methode is relatief goedkoop en kan niet arbeidsintensief. Het vereist toegang tot menselijke adipeus weefsel en de subcutane depot is geschikt voor monsternemingen. Voor dit protocol, verse adipeus weefsel monsters van morbide obesitas onderwerpen [index van de lichaamsmassa (BMI) > 35] worden verzameld tijdens procedures voor Bariatrische chirurgie. Met behulp van een sequentiële immunoseparation uit de stromale vasculaire afvalfractie, worden voldoende cellen geproduceerd van zo weinig zoals 2 – 3 g vet. Deze cellen kunnen worden uitgebreid in cultuur gedurende 10-14 dagen, kunnen worden cryopreserved, en behouden hun eigenschappen van de adipogenic met passaging tot de passage 5 – 6. De cellen worden gedurende 14 dagen met een cocktail met behulp van een combinatie van menselijke insuline en de PPARγ agonist-rosiglitazone adipogenic behandeld.
Deze methode kan worden gebruikt voor het verkrijgen van bewijs van concept experimenten op moleculaire mechanismen die adipogenic reacties in obesitas endotheliale cellen rijden, of voor het screenen van de nieuwe drugs die de adipogenic verbeteren kunnen reactie geleid ofwel naar wit of beige/bruin adipocyte differentiatie. Met behulp van kleine onderhuidse biopsieën, kan deze methode worden gebruikt om het scherm uit non-responder onderwerpen voor klinische tests gericht op het stimuleren van beige/bruin en wit adipocytes voor de behandeling van obesitas en co-morbiditeit.

Ons protocol is bedoeld om een in vitro -aanpak om te bepalen van het adipogenic potentieel van CD34 + CD31 + vasculaire cellen uit verschillende magazijnen van menselijke adipeus weefsel. Een vereenvoudigd stroomdiagram wordt weergegeven in figuur 1A. De eerste stap met behulp van een positief aantal CD34 cellen uiten resulteert in > 95% CD34 + cellen in de bevolking van de vers geïsoleerde cellen (figuur 1A). Nog belan...

De differentiatie van wit en beige adipocytes uit vetweefsel vasculaire progenitoren beren mogelijkheden voor metabole verbetering in obesitas. We beschrijven protocollen voor een CD34 + CD31 + endothelial cel los van menselijk vet en voor een latere in vitro expansie en de differentiatie in wit en beige adipocytes. Verschillende downstream toepassingen worden besproken.

Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van obesitas, zoals het identificeren van de belangrijkste factoren en mechanismen die een robuuste adipogene respons tijdens remodellering van vetweefsel voorkomen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de isolatie van CD34+CD31+ endotheliale cellen uit menselijk vetweefsel mogelijk maakt, beginnend met kleine hoeveelheden weefsel. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we cellen in menselijk adipeus vaatweefsel wilden identificeren die reageren op adipogene stimulatie.Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de celisolatie stappen moeilijk te oefenen zijn vanwege de vaak beperkte toegang tot vers menselijk vetweefsel. Verzamel menselijk omentair en subcutaan vetweefsel van menselijke proefpersonen die een bariatrische operatie ondergaan. Bewaar onmiddellijk na weefselextractie het menselijke omentaire en subcutane vetweefsel in afzonderlijke flesjes met Hank's gebufferde zoutoplossing met 50 microgram per milliliter penicilline-streptomycine op kamertemperatuur.Zodra het monster in het laboratorium aankomt na de weefselextractie, reinig en verwijder voorzichtig fibrotische en gecauteriseerde secties van het weefsel door 70% ethanol-bevochtigde schaar en pincetten te gebruiken. Weeg het vetweefsel en verdeel het in vijf gram aliquoten voor de collageenase-digestie. Gebruik twee paar scharen om vijf gram vetweefsel fijn te snijden in vijf milliliter van een collageenase-oplossing in een scintillatieglas op kamertemperatuur.Voeg een extra 10 milliliter collageenase-oplossing toe aan het fijngesneden weefsel voor een totaal van 15 milliliter. Digest de monsters gedurende een uur bij 37 graden Celsius in een waterbad met continu schudden. Na de digestie, giet de monsters in de 20 milliliter stompe eindspuit.Filter het monster door 250 micron nylon gaas in de 50 milliliter conische buis om adipocyten en stroma vasculaire cellen te scheiden van onverteerd weefsel. Spoel de scintillatieglas uit met 10 milliliter KRBBS, en giet de spoeling door de filter om restcellen te verzamelen voordat de gefilterde monsters gedurende vijf minuten op kamertemperatuur worden geïncubeerd. Gebruik vervolgens een 20 milliliter spuit en een 20 gauge door zes inch pipetteernaald om de stroma vasculaire fractielaag te verwijderen en deze over te brengen naar een schone 50 milliliter conische buis.Voeg 10 milliliter KRBBS toe en laat de monsters vijf minuten op de werkbank staan bij kamertemperatuur. Houd de stroma vasculaire fracties van beide depots op ijs voor verdere verwerking. Draai de stroma vasculaire fracties gedurende vijf minuten bij 4 graden Celsius met 500 keer G.Verwijder de monsters uit de centrifuge en giet voorzichtig het supernatant af, waarbij het pellet met de stroma vasculaire fractiecellen wordt behouden. Re-suspendeer voorzichtig de celpellets in vijf milliliter PBS. Na het opnieuw centrifugeren van de monsters, verwijder het supernatant, re-suspendeer de cellen in één milliliter PBS en tel de cellen.Pellet de monsters voor de derde keer en re-suspendeer het pellet in 100 microliter CD34 isolatiebuffer. Voeg 10 microliter CD34 cocktail toe en incubeer het monster gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens vijf microliter magnetische korrels toe en incubeer het monster gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.Voeg vervolgens 2,5 milliliter CD34 isolatiebuffer toe aan elk monster en plaats de monsters gedurende vijf minuten op kamertemperatuur in de magneet. Draai de magneet vijf seconden om de isolatiebuffer af te gieten. Na het herhalen van dit proces vier keer, verwijder het buisje van de magneet en voeg twee milliliter CD34 isolatiebuffer toe.Na een andere centrifugatie, re-suspendeer de CD34+celpellets in één milliliter CD34 isolatiebuffer en tel de cellen. Pellet de cellen opnieuw en re-suspendeer het pellet in 250 microliter Buffer B en 250 microliter wasbuffer. Re-suspendeer vervolgens de CD31 korrels grondig door de buis te voortbewegen, voeg vervolgens 20 microliter CD31 korrels toe aan het re-gesuspendeerde celpellet en incubeer het monster met schudden gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.Voor de celscheiding, voeg een milliliter wasbuffer toe om de zeef te gelijkmaken. Breng vervolgens het voorbereide mengsel van re-gesuspendeerde cellen in CD31 korrels aan op de zeef. Was de zeef met vijf milliliter wasbuffer in een cirkelvormige beweging voor een totaal volume van 20 milliliter.Bevestig de connector aan een steriele 50 milliliter conische buis en sluit de leurvergrendeling. Nadat de zeef aan de connector is bevestigd, voeg een milliliter wasbuffer toe langs de wand van de zeef, voeg vervolgens een milliliter geactiveerde Buffer D toe langs de wand van de zeef. Draai het monster voorzichtig en incubeer het gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.Voeg vervolgens een milliliter wasbuffer toe en scheid de cellen van de korrels door 10 keer op en neer te pipetteren. Open de leurvergrendeling en laat de losgekoppelde cellen in de 50 milliliter conische buis stromen. Was de zeef 10 keer met één milliliter wasbuffer per keer.Gooi de connector en zeef weg en centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 300 keer G op 4 graden Celsius. Re-suspendeer ten slotte de celpellet in twee milliliter compleet EGM2 medium voor cultivatie. Laat de cellen groeien in zes-welplaten behandeld voor weefselcultuur met compleet EGM2 medium in een 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide incubator.Ververs het medium elke drie tot vier dagen totdat de cellen 80 tot 90% confluentie bereiken. Zaai vervolgens ongeveer 100 tot 200 duizend cellen in zes-welplaten, zorg voor dubbele putten voor elk depot, en cultiveer ze gedurende twee dagen in compleet EGM2 medium. Na twee dagen, zuig eventueel groeimedium af.Vervang het medium met twee milliliter DMEM/F-12 medium met 5% FBS en 50 microgram per milliliter penicilline-streptomycine voor de controlecellen. Voor de behandelde cellen, vervang het medium met twee milliliter a

isolation-expansion-adipogenic-induction-cd34-cd31-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a technique for isolating and culturing fluorescently labeled neural crest-derived adipose-derived stem cells (ADSCs) from murine periaortic arch adipose tissue. Following isolation, the NCADSCs are detected, sorted using fluorescence-activated cell sorting, and subsequently cultured on a plate, promoting cell proliferation.

Isolating Adipose-Derived Stem Cells from Murine Periaortic Adipose Tissue

De transcriptionele heterogeniteit binnen humane adipogeen-afgeleide stromale cellen kan op enkelcellig niveau worden gedefinieerd met behulp van celoppervlaktemarkers en osteogene genen. We beschrijven een protocol dat flowcytometrie gebruikt voor de isolatie van celsubpopulaties met verhoogd osteogeen potentieel, die kunnen worden gebruikt om craniofaciale skeletreconstructie te verbeteren.

Isolatie en Verrijking van Human Adipose-afgeleide stromale cellen voor Enhanced Osteogenesis

Hier worden een methode beschreven voor het isoleren van Adipocyte Progenitor Cell (APC) populaties uit Perivascular Adipose Tissue (PVAT) met behulp van Magnetisch-geactiveerde Cell Sorting (MCS). Deze methode zorgt voor een verhoogde isolatie van APC per gram vetweefsel in vergelijking met Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS).

Uitbreiding en Adipogenese Inductie van Adipocyt Progenitors van Perivasculaire Adipose Weefsel Geïsoleerd door Magnetische Geactiveerde Cell Sorting

Dit protocol beschrijft de technische benadering om adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties te isoleren uit intra-abdominale witte vetweefseldepots (WAT) van muizen door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering of immunomagnetische parelscheiding.

Isolatie van adipogene en fibro-inflammatoire stromale celsubpopulaties uit intra-abdominale vetdepots van muizen

We presenteren een eenvoudige methode om zeer levensvatbare adipose voorlopercellen te isoleren van epididymale vetkussens van muizen met behulp van fluorescentie geactiveerde celsortering.

Voorbereiding van adipose voorlopercellen van muis epididymale vetweefsels

Dit protocol biedt een efficiënte collagenase-verteringsmethode voor isolatie van levensvatbare adipocyten en stromale vasculaire fractie-SVF-cellen uit menselijk visceraal vet in één enkel proces, inclusief methodologie om hoogwaardig RNA uit adipocyten te verkrijgen en fenotypificatie van SVF-macrofagen door kleuring van meerdere membraangebonden markers voor analyse door middel van flowcytometrie.

Isolatie van levensvatbare vetcellen en stromale vasculaire fractie uit menselijk visceraal vetweefsel geschikt voor RNA-analyse en macrofaagfenotypering

Dit protocol beschrijft een methode voor de dissectie van vetdepots van muizen en de isolatie en vertering van de respectieve slagaders om de endotheelcelpopulatie te bevrijden en vervolgens te identificeren. Vers geïsoleerde cellen die worden gebruikt in downstream-toepassingen zullen het begrip van vasculaire celbiologie en de mechanismen van vasculaire disfunctie bevorderen.

Isolatie en identificatie van vasculaire endotheelcellen uit verschillende vetdepots voor downstreamtoepassingen

Dit protocol beschrijft een methodologie voor het isoleren en identificeren van van vetweefsel afgeleide mesenchymale stamcellen (MSC's) van Sprague Dawley-ratten.

Isolatie en identificatie van mesenchymale stamcellen afgeleid van vetweefsel van Sprague Dawley-ratten

Hier beschrijven we de isolatie, kweek en adipogene inductie van stromale vasculaire fractie-afgeleide preadipocyten uit periaorta-vetweefsel van muizen, waardoor de perivasculaire vetweefselfunctie en de relatie met vasculaire cellen kunnen worden bestudeerd.

Isolatie, kweek en adipogene inductie van van stromale vasculaire fractie afgeleide preadipocyten uit periiaorta-vetweefsel van muizen

Het vetweefsel is een uitstekende bron van mesenchymale stamcellen. Hier brengen we de stapsgewijze extractie, cultivatie en karakterisering van van vetweefsel afgeleide stamcellen (ADSC's) uit epididymaal vetweefsel van Zwitserse muizen.

Isolatie, in-vitro-expansie en karakterisering van mesenchymale stamcellen uit epididymaal vetweefsel van muizen

De grootte en kwetsbaarheid van rijpe vetcellen hebben de technieken en hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor hun studie en isolatie beperkt. Hier wordt een protocol beschreven voor de isolatie van rijpe muizenadipocyten, dat gemakkelijk kan worden aangepast voor verschillende vetdepots en muizendiëten.

Isolatie en kweek van primaire adipocyten van muizen van magere en zwaarlijvige muizen

Leer de isolatie en adipogene inductie van CD34+CD31+ endotheliale cellen uit menselijk vetweefsel. Deze methode maakt onderzoek naar obesitas en adipocytendifferentiatie mogelijk.

Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel (Video) | JoVE Journal

Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel

Meer video's verkennen