Isolatie, uitbreiding en Adipogenic inductie van CD34 + CD31 + endotheliale cellen van menselijke Omental en onderhuids vetweefsel

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van obesitas, zoals het identificeren van de belangrijkste factoren en mechanismen die een robuuste adipogene respons tijdens remodellering van vetweefsel voorkomen. Het grote voordeel van deze techniek is dat het de isolatie van CD34+CD31+ endotheliale cellen uit menselijk vetweefsel mogelijk maakt, beginnend met kleine hoeveelheden weefsel. We hadden voor het eerst het idee voor deze methode toen we cellen in menselijk adipeus vaatweefsel wilden identificeren die reageren op adipogene stimulatie.

Visuele demonstratie van deze methode is cruciaal, aangezien de celisolatie stappen moeilijk te oefenen zijn vanwege de vaak beperkte toegang tot vers menselijk vetweefsel. Verzamel menselijk omentair en subcutaan vetweefsel van menselijke proefpersonen die een bariatrische operatie ondergaan. Bewaar onmiddellijk na weefselextractie het menselijke omentaire en subcutane vetweefsel in afzonderlijke flesjes met Hank's gebufferde zoutoplossing met 50 microgram per milliliter penicilline-streptomycine op kamertemperatuur.

Zodra het monster in het laboratorium aankomt na de weefselextractie, reinig en verwijder voorzichtig fibrotische en gecauteriseerde secties van het weefsel door 70% ethanol-bevochtigde schaar en pincetten te gebruiken. Weeg het vetweefsel en verdeel het in vijf gram aliquoten voor de collageenase-digestie. Gebruik twee paar scharen om vijf gram vetweefsel fijn te snijden in vijf milliliter van een collageenase-oplossing in een scintillatieglas op kamertemperatuur.

Voeg een extra 10 milliliter collageenase-oplossing toe aan het fijngesneden weefsel voor een totaal van 15 milliliter. Digest de monsters gedurende een uur bij 37 graden Celsius in een waterbad met continu schudden. Na de digestie, giet de monsters in de 20 milliliter stompe eindspuit.

Filter het monster door 250 micron nylon gaas in de 50 milliliter conische buis om adipocyten en stroma vasculaire cellen te scheiden van onverteerd weefsel. Spoel de scintillatieglas uit met 10 milliliter KRBBS, en giet de spoeling door de filter om restcellen te verzamelen voordat de gefilterde monsters gedurende vijf minuten op kamertemperatuur worden geïncubeerd. Gebruik vervolgens een 20 milliliter spuit en een 20 gauge door zes inch pipetteernaald om de stroma vasculaire fractielaag te verwijderen en deze over te brengen naar een schone 50 milliliter conische buis.

Voeg 10 milliliter KRBBS toe en laat de monsters vijf minuten op de werkbank staan bij kamertemperatuur. Houd de stroma vasculaire fracties van beide depots op ijs voor verdere verwerking. Draai de stroma vasculaire fracties gedurende vijf minuten bij 4 graden Celsius met 500 keer G.

Verwijder de monsters uit de centrifuge en giet voorzichtig het supernatant af, waarbij het pellet met de stroma vasculaire fractiecellen wordt behouden. Re-suspendeer voorzichtig de celpellets in vijf milliliter PBS. Na het opnieuw centrifugeren van de monsters, verwijder het supernatant, re-suspendeer de cellen in één milliliter PBS en tel de cellen.

Pellet de monsters voor de derde keer en re-suspendeer het pellet in 100 microliter CD34 isolatiebuffer. Voeg 10 microliter CD34 cocktail toe en incubeer het monster gedurende 15 minuten op kamertemperatuur. Voeg vervolgens vijf microliter magnetische korrels toe en incubeer het monster gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.

Voeg vervolgens 2,5 milliliter CD34 isolatiebuffer toe aan elk monster en plaats de monsters gedurende vijf minuten op kamertemperatuur in de magneet. Draai de magneet vijf seconden om de isolatiebuffer af te gieten. Na het herhalen van dit proces vier keer, verwijder het buisje van de magneet en voeg twee milliliter CD34 isolatiebuffer toe.

Na een andere centrifugatie, re-suspendeer de CD34+celpellets in één milliliter CD34 isolatiebuffer en tel de cellen. Pellet de cellen opnieuw en re-suspendeer het pellet in 250 microliter Buffer B en 250 microliter wasbuffer. Re-suspendeer vervolgens de CD31 korrels grondig door de buis te voortbewegen, voeg vervolgens 20 microliter CD31 korrels toe aan het re-gesuspendeerde celpellet en incubeer het monster met schudden gedurende 30 minuten op kamertemperatuur.

Voor de celscheiding, voeg een milliliter wasbuffer toe om de zeef te gelijkmaken. Breng vervolgens het voorbereide mengsel van re-gesuspendeerde cellen in CD31 korrels aan op de zeef. Was de zeef met vijf milliliter wasbuffer in een cirkelvormige beweging voor een totaal volume van 20 milliliter.

Bevestig de connector aan een steriele 50 milliliter conische buis en sluit de leurvergrendeling. Nadat de zeef aan de connector is bevestigd, voeg een milliliter wasbuffer toe langs de wand van de zeef, voeg vervolgens een milliliter geactiveerde Buffer D toe langs de wand van de zeef. Draai het monster voorzichtig en incubeer het gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.

Voeg vervolgens een milliliter wasbuffer toe en scheid de cellen van de korrels door 10 keer op en neer te pipetteren. Open de leurvergrendeling en laat de losgekoppelde cellen in de 50 milliliter conische buis stromen. Was de zeef 10 keer met één milliliter wasbuffer per keer.

Gooi de connector en zeef weg en centrifugeer de monsters gedurende 10 minuten bij 300 keer G op 4 graden Celsius. Re-suspendeer ten slotte de celpellet in twee milliliter compleet EGM2 medium voor cultivatie. Laat de cellen groeien in zes-welplaten behandeld voor weefselcultuur met compleet EGM2 medium in een 37 graden Celsius, 5% koolstofdioxide incubator.

Ververs het medium elke drie tot vier dagen totdat de cellen 80 tot 90% confluentie bereiken. Zaai vervolgens ongeveer 100 tot 200 duizend cellen in zes-welplaten, zorg voor dubbele putten voor elk depot, en cultiveer ze gedurende twee dagen in compleet EGM2 medium. Na twee dagen, zuig eventueel groeimedium af.

Vervang het medium met twee milliliter DMEM/F-12 medium met 5% FBS en 50 microgram per milliliter penicilline-streptomycine voor de controlecellen. Voor de behandelde cellen, vervang het medium met twee milliliter a