Name: Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Leer kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in Caenorhabditis elegans. Deze methode met eiwitprecipitatie verbetert de nauwkeurigheid van metabolietkwantificering in dit modelorganisme.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd financieel ondersteund door een speciale subsidie van het onderzoek van de Daito Bunka universiteit naar Sumino Yanase.

1. gesynchroniseerde cultuur van C. elegans
<ol><li>Vóór het zaaien stam cultuur de Escherichia coli (E. coli) OP50 's nachts bij 37 ° C in 300 mL Luria Bertani (LB) Bouillon vloeibare voedingsbodem. Winkel de gekweekte OP50 bij-4 ° C.<ol>
<li>Maken van LB Bouillon opgietvloeistof, 10 g trypton, gistextract 5 g, 10 g NaCl en 1,5 mL 1 N NaOH gebruiken, en toevoegen aan 1 L met gedeïoniseerd water. Autoclaaf. Opmerking: OP50 en C. elegans stammen zijn beschikbaar vanaf de Caenorhabditis genetica Center (Universiteit van Minnesota, St. Paul, MN, USA).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nematode groei medium (NGM) agar, 3 g NaCl, 2,5 g pepton, 17 g agar, en gebruiken 975 mL gedeïoniseerd water. Autoclaaf. Cool tot 55 ° C, dan sterilely toevoegen, in orde, 1 mL van de 1 M MgSO4, 1 mL van de 1 M CaCl2, 1 mL 5 mg/mL cholesterol in EtOH, en 25 mL van de 1 M kalium fosfaat pH 6.0 in 90-mm petrischalen.<ol>
<li>Voor 1 M kalium fosfaat pH 6.0, gebruik 108.3 KH2PO4 g en 46.6 g. van K2HPO4en Voeg gedeïoniseerd water toe tot 1 L. Autoclave6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>1-2 mL van de gekweekte OP50 op de platen van de agar NGM verspreid. Incubeer de platen 's nachts bij kamertemperatuur voordat u eventuele nematoden toevoegt om een dun laagje OP50. Opmerking: De NGM agar platen die geënte OP50 kan bij kamertemperatuur worden opgeslagen voor 2-3 weken.</li>
	<li>Voeg ten minste 100 wormen op een NGM agar bord met OP50, en cultuur bij 20 ° C tot het volwassen stadium. Ten minste drie platen zijn vereist.</li>
	<li>Verzamelen eieren in utero, overdracht van gravid hermafrodieten aan de drie NGM agar platen elke met 5 mL S buffer in een conische buis 15 mL, en wassen van de wormen 3 keer met 15 mL S buffer met behulp van centrifugeren bij 300 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur.<ol>
<li>Om S buffer, 5,9 g NaCl en 50 mL 1 M kalium fosfaat pH 6.0 gebruiken, voegt u aan 1 L met gedeïoniseerd water. Autoclaaf6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Los van de wormen in een alkalische hypochlorietoplossing voor axenization en bulk ei isolatie (0,5 mL verse bleekmiddel of equivalent: 5-6% natriumhypochloriet, 0,1 mL van 10 M NaOH, ongeveer 4.5 mL S buffer)6, en de oplossing gedurende 10-15 minuten op staan kamertemperatuur onder omzwenken door omkeren. Opmerking: Binnen 15 min, volwassen wormen moeten ontbinden, waardoor een wazige oplossing van eieren bevrijd van hun karkassen (de bevrijde eieren moeten worden bevestigd met behulp van een stereoscopische Microscoop). In plaats van 0,1 mL van 10 N NaOH, kan 0.2 mL 5 N NaOH ook worden gebruikt.</li>
	<li>Na behandeling van hypochloriet, wassen van de ei-pellet 3 keer met 15 mL S buffer en resuspendeer in 5-6 mL S buffer. De vrijgegeven eieren tijdens een overnachting broedtijd bij 20 ° C in S buffer zonder E. coli voor een leeftijd-synchrone cultuur van L1 fase larven uitkomen.</li>
	<li>Om te bepalen van het geschatte aantal L1 fase larven, de wormen een stereoscopische Microscoop met 10 µL van S buffer na resuspending van de larven ten minste 3 keer tellen en het gemiddelde berekenen. Vervolgens overdracht van de larven van de fase L1 aan vijf NGM agar platen met OP50 (1500-3000 wormen per plaat met behulp van een petrischaal 90-mm) en cultuur bij 20 ° C, totdat ze zijn uitgegroeid tot de jonge volwassen stadium, wanneer de self-fertilization begint en een paar eieren worden gelegd (gewoonlijk na 3 d ays).</li>
</ol>2. extractie van cellulaire fractie van C. elegans
<ol><li>Het verzamelen van de jonge volwassen stadium (5-dagen oude dieren) uit de vijf NGM agar platen met S buffer (figuur 1A wormen).<ol>
<li>Schakel alleen levende wormen met behulp van de methode van sacharose6 voor flotatie op 30% (g/v) sacharose, meng de wormen geschorst in 3-4 mL S buffer met een gelijk volume van ijskoude 60% (m/v) sacharose in een conische buis 15 mL. Draai de buis bij 1.500 x g gedurende 15 s bij 4 ° C en verwijderen de drijvende wormen in een verse buis door ze te verplaatsen uit de wand van de buis met een pipet van Pasteur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wassen van de wormen 3 keer met S buffer door centrifugeren bij 1.500 x g gedurende 30 s bij 4 ° C. Check de natte hoeveelheid gewassen wormen na centrifugeren gebruik een 1.000 µL micropipet tip (figuur 1B).</li>
	<li>Voeg de gewassen wormen op een gelijk volume van ijskoude 10% (m/v)-Trichloorazijnzuur (TCA; eindconcentratie van 5%) voor eiwit neerslag (Figuur 1 c). In plaats van TCA, kan perchloorzuur (PCA) of metaphosphoric-zuur worden gebruikt.</li>
	<li>Meng de wormen met de neerslaande 40 slagen van een stamper met een Teflon homogenizer (Potter-Elvehjem weefsel grinder) met rotatie van maximaal 1300 toeren per minuut op ijs.</li>
	<li>Het homogenaat overboeken naar een verse 1.5-mL microtube met een pipet van Pasteur, en bewerk ultrasone trillingen ten met behulp van een ultrasoon homogenizer gedurende 3 minuten (3 keer voor 1 min) met een taakcyclus van 20% op ijs.</li>
	<li>Verduidelijking van het homogenaat door centrifugeren bij 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Neutraliseren het supernatant met 4 M KOH (0,25 volume 10% TCA) voor 20 min op ijs en centrifuge op 8.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Het supernatant (als een test sample) kan worden achtergelaten bij-80 ° C tot en met de volgende tests.</li>
</ol>3. lactaat Assay met behulp van een colorimetrische Assay Kit
<ol><li>Het meten van de concentratie van lactaat in de monsters met behulp van een colorimetrische assay kit (Tabel van materialen). Duplex onderzoek voor de analysemonsters te verrichten. 5 of 10 µL van de proefstukken benadert toevoegen aan een 96-wells-plaat en het volume naar 50 µL per putje met de lactaat Assay Buffer die bij de kit geleverd.</li>
	<li>Voor de standaard curve van lactaat, Verdun 100 mM L (+)-lactaat standaard tot 1 mM met lactaat Assay Buffer. Toevoegen van 0, 2, 4, 6, 8 en 10 µL van de 1 mM L (+)-lactaat standaard, die bij de kit wordt geleverd in een reeks van putten.</li>
	<li>Voeg 50 µL van reactie Mix (met 46:2:2 van lactaat Assay Buffer, lactaat enzym Mix en lactaat Probe in DMSO, watervrij; alle gebruikte reagentia zijn voorzien van de kit) of de achtergrond controle Mix (met 48:2 van lactaat Assay Buffer en lactaat Probe) in elk putje en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30-60 minuten, terwijl de monsters worden beschermd tegen licht.</li>
	<li>Meet de extinctie van elk putje bij 570 nm met behulp van een microplate-lezer en aftrekken van de extinctie van de achtergrond controle Mix van de extinctie van de Mix.</li>
	<li>De lactaat standaard curve uitzetten. Bereken de lactaat concentratie van de analysemonsters uit de lactaat standaard curve.</li>
</ol>4. pyruvaat Assay met behulp van een colorimetrische Assay Kit
<ol><li>Het meten van de concentratie van pyruvaat in het supernatant (proefmonsters) met behulp van een colorimetrische assay kit (Tabel van materialen). Duplex onderzoek voor de analysemonsters te verrichten. Voeg 10 µL van de proefstukken benadert en 90 µL van werken reagens (met 94:1 van enzym Mix en kleurstof reagens, die zijn voorzien van de kit) in een 96-wells-plaat en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten terwijl de monsters worden beschermd tegen licht.</li>
	<li>Meet de extinctie van elk putje bij 570 nm microplate lezer gebruikt.</li>
	<li>De standaard curve van pyruvaat uitzetten. Bereken de pyruvaat concentraties van de analysemonsters uit de standaard curve van pyruvaat.</li>
</ol>5. eiwitten Assay voor normalisatie met eiwitgehalte
<ol><li>Het meten van de eiwitconcentratie in het supernatant (proefmonsters) met behulp van een colorimetrische assay kit (Tabel van materialen). Echter, deze stap is niet beperkt tot een assay kit, en andere benaderingen kunnen worden gebruikt voor het meten van de eiwitconcentratie.</li>
	<li>Normaliseren van de waarden van lactaat en pyruvaat concentraties tussen de proefstukken benadert met behulp van elke eiwitconcentratie totaal. Opmerking: Eiwitconcentratie van de analysemonsters voldoende zelfs na eiwit neerslag wordt gedetecteerd en wordt gebruikt voor de normalisatie stap onder monsters.</li>
</ol>

<ol><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li>
<li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/312/5780/1650.full">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li>
<li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+p53%2FCEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. The C. elegans. Research Community. The cuticle. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPage%2C+AP+%22WormBook%22">WormBook</a>. , (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+the+worm%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/caenorhibditus-elegans-modern-biological-analysis-of-an-organism/epstein/978-0-12-564149-4">Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press, Inc. 3-29 (1995).</li>
<li>Senoo-Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defect+in+the+cytochrome+b+large+subunit+in+complex+II+causes+both+superoxide+anion+overproduction+and+abnormal+energy+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).</li>
<li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li>
<li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate%3A+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li>
<li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Bij gebruik van deze colorimetrische bepaling kits, is de meest kritische stap in monster extractie te detecteren van cellulaire lactaat en pyruvaat nauwkeurig in C. elegans het proces van eiwit neerslag tijdens homogenisering (Figuur 1). Het is niet strikt noodzakelijk is om het gebruik van een Teflon-homogenizer, als andere homogeniseerders (bijv., Dounce en tapered weefsel slijpmachines, of kraal molens) zijn ook geschikt voor de kleinschalige winning van wormen. We did ...

Lactaat en pyruvaat concentraties worden algemeen beschouwd als tussenproducten van de energie-stofwisseling en zijn gerelateerd aan de Staten van de glycolyse, tricarboxylic acid (TCA) cyclus en elektronentransport keten in de cellen van aerobe organismen. Een reeks reacties in de glycolyse oxideren glucose om pyruvaat, die ligt op een kruispunt van metabole en kan worden geconverteerd naar koolhydraten via gluconeogenese, vetzuren en energiemetabolisme door acetyl-CoA en het aminozuur alanine. De TCA cyclus gebeurt onder de aanwezigheid van voldoende opgeloste zuurstof en is essentieel voor de omzetting van glucose naar energie. Vooral de wijziging van de secundaire metabolisme is een interessant fenomeen waarin glycolyse voornamelijk voor de energieproductie gebruikt wordt en aërobe mitochondriale ademhaling, waarbij de TCA cyclus en het elektronentransport keten, werden in zoogdieren kanker cellen1,2. We toonden onlangs dat de niveaus van lactaat en de daaruit voortvloeiende lactaat/pyruvaat (L/P)-ratio tijdens veroudering in de model-organisme Caenorhabditis elegans (C. elegans daalde). We vonden ook dat de zoogdieren tumor suppressor p53 ortholog CEP-1 in C. elegans een belangrijke rol in de leeftijd-gerelateerde veranderingen van energiemetabolisme door de activering van de transcriptionele doelstellingen3 heeft.
In biologische testen, zoals het meten van lactaat en pyruvaat concentraties in cellen, zijn de gevoeligheid, de nauwkeurigheid, de steekproefgrootte, en de incubatietijd van colorimetrische/fluorimetrische assay kits verbeterd drastisch. Als gevolg van technologische innovaties zijn we nu in staat om te analyseren verschillende metabolieten en intermediaire metabolieten zonder de grootschalige cultuur van C. elegans, dat is moeilijk gezien de kleine omvang. In het algemeen, is de gevoeligheid van een colorimetrische bepaling een orde van grootte kleiner dan die van een fluorimetrische assay; de colorimetrische benadering is echter meer geschikt in de instelling van gemeenschappelijke laboratoria. Bovendien, een techniek van de extractie met homogenisering en eiwit neerslag is van cruciaal belang voor de kwantitatieve bepaling van de concentratie van lactaat en pyruvaat in C. elegans cellen omdat deze nematode is ingesloten in een exoskelet genaamd de cuticle, in tegenstelling tot zoogdieren gekweekte cel lijnen4,5. Hier beschrijven we een protocol voor het analyseren van lactaat en pyruvaat concentraties werken met commerciële colorimetrische bepaling kits inclusief tips voor monster extractie van C. elegans.

<table><tbody><tr><td>Lactate Colorimetric/Fluorimetric Assay kit&nbsp;</td><td>BioVision</td><td>#K607-100</td><td>colorimetrisch/fluorometrisch 100 assays; Bewaren bij -20oC</td></tr><tr><td>EnzyChrom Pyruvaat Assay Kit</td><td>BioAssay Systems</td><td>#EPYR-100</td><td>colorimetrisch/ fluorometrisch 100 assays; Bewaren bij -20oC</td></tr><tr><td>BCA Eiwit Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23225</td><td>colorimetrische test; bewaar bij &nbsp;kamertemperatuur</td></tr><tr><td>Trichloroazijnzuur</td><td>Wako Pure Chemical</td><td>#207-04955</td><td>bewaren bij kamertemperatuur</td></tr><tr><td>Teflon homogenisator&nbsp;</td><td>Iwaki/Pyrex</td><td>#358034 (Wheaton)</td><td>In plaats van Iwaki/Pyrex, verkrijgbaar bij Wheaton</td></tr></tbody></table>

kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de nematode caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Lactaat en pyruvaat zijn belangrijke tussenproducten van intracellulaire energie metabolische routes. Toezicht op de lactaat/pyruvaat ratio in cellen helpt om te bepalen of er een onbalans in de leeftijdsgebonden energiemetabolisme tussen Mitochondriale oxidatieve fosforylatie en aërobe glycolyse. Hier, laten we het gebruik van commerciële colorimetrische bepaling kits voor lactaat en pyruvaat in de model-organisme C. elegans. Onlangs, de gevoeligheid en nauwkeurigheid van de colorimetrische/fluorimetrische assay kits zijn verbeterd sterk door onderzoek en ontwikkeling olv reagens fabrikanten. De verbeterde reagentia hebt ingeschakeld op het gebruik van kleinschalige tests met een 96-wells-plaat in C. elegans. In het algemeen, is een fluorimetrische assay superieur in gevoeligheid aan een colorimetrische bepaling; de colorimetrische benadering is echter meer geschikt voor het gebruik in gemeenschappelijke laboratoria. Een ander belangrijk punt in deze tests voor kwantitatieve bepaling is eiwit precipitatie van gehomogeniseerde C. elegans monsters. In onze eiwit neerslag methode, gemeenschappelijke neerslagmiddelen (bv., trichloorazijnzuur, perchloorzuur en metaphosphoric zuur) worden gebruikt voor de bereiding van de monsters. Een eiwit-gratis test sample wordt bereid door koude neerslaande (eindconcentratie van 5%) tijdens de homogenisering direct toe te voegen.

Met behulp van de colorimetrische testen voor de kwantitatieve bepaling van de concentraties lactaat en pyruvaat, toonden we de juistheid van deze tests vergeleken met vorige verslagen in C. elegans7,8. Hier, was het proces van eiwit neerslag tijdens de extractie van het monster de meest cruciale stap voor het genereren van nauwkeurige waarden. Bij eiwit precipitatie, gemeenschappelijke neerslagmiddelen (bv., TCA...

We beschrijven een gemodificeerde kleinschalige extractie en colorimetrische vitrotests van lactaat en pyruvaat in de nematode C. elegans. Bij gebruik van commerciële assay kits, is de technische ontwikkeling van hun gevoeligheid en nauwkeurigheid belangrijk. Eiwit neerslag in extractie is de meest kritische stap voor de kwantitatieve bepaling van intracellulaire metabolieten.

Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Dit onderzoek kan helpen bij het beantwoorden van vragen in hen biochem tellen en methodologie veld, zoals een analyse van de ontwikkelingsrechten in aaltjes. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is eiwitneerslag in extraductie en drank en homogenisatie van de wormen. Start dit experiment door het kweken van E.coli OP50 stam in 300 milliliter LB bouillon vloeibaar medium op 37 graden Celsius 's nachts.Bewaar succesvolle OP50 op vier graden Celsius. Pipette twee milliliters van de gekweekte OP50 op minimaal drie eerder voorbereide NGM, of Nematode Growth Media Agar Platen en verspreid met de hand wervelende de plaat. Incubeer de platen bij kamertemperatuur 's nachts om een dunne laag OP50 te creëren.Gebruik vervolgens een steriele tandenstoker om een stuk agar uit een plaat met wormen te halen, om minstens 100 wormen toe te voegen aan elke OP50 NGM-plaat. Kweek ten minste drie platen met de wormen bij 20 graden Celsius, totdat de wormen het volwassen stadium bereiken, wat wordt bevestigd onder stereoscopische microscoop. Zoek gravid hermafrodieten gevuld met eieren met behulp van een stereoscopische microscoop.Na het toevoegen van vijf milliliter S-buffer aan platen, gebruik Pasteur pipet om de wormen van alle drie de platen over te brengen naar een 15 milliliter conische buis. Was de wormen drie keer door het toevoegen van 15 milliliter S-buffer en vervolgens centrifugeren op 300 keer G bij kamertemperatuur gedurende 30 seconden. Als het volume van de S-buffer meer dan vijf milliliter bedraagt, verwijdert u de overtollige buffer na het centrifugeren.Voor succesvolle exonisatie en bulk ei isolatie, los de wormen in 0,5 milliliter alkalische hypo chloraat oplossing. Meng door te keren en incubeer op kamertemperatuur gedurende 10 tot 15 minuten. Centrifuge op 1, 400 RPM gedurende 30 seconden om de oplossing te verwijderen.Gebruik 15 milliliter S-buffer om de eierkorrel te wassen. Na het centrifugeren verwijdert het de supernatant en herhaal deze was minstens drie keer. Na de laatste wasbeurt schorten we de pellet op in vijf tot zes milliliter S-buffer, zonder E.coli en broeden we de eieren 's nachts uit bij 20 graden Celsius om ze uit te broeden en H synchrone kweek van L1-traplarven te bereiken.Pipette 10 microliters van S-buffer met L1 wormen op drie dektappen. Tel de larven onder een stereoscopische microscoop en bereken het gemiddelde om het geschatte aantal L1-trapslarven te bepalen. Breng ten slotte de L1-faselarven over op vijf NGM Agar-platen met OP50 en laat ze groeien bij 20 graden Celsius tot het stadium van de jonge volwassene, waarin zelfbevruchting plaatsvindt en een paar eieren worden gelegd.Observeer de wormen elke dag onder de microscoop en verzamel vervolgens de jonge volwassene, of vijf dagen oude wormen. Om alleen levende wormen te selecteren, voeg de wormen opgehangen in drie tot vier milliliter S-buffer aan een 15 milliliter conische buis. Voeg vervolgens een gelijk volume van ijskoude 60% sacharose toe en meng.Centrifuge de buis op 1, 500 keer G bij vier graden Celsius gedurende 15 seconden. Gebruik vervolgens een Pasteur pipet om de wormen voorzichtig van de muur van de buis te bewegen en verwijder vervolgens de drijvende wormen in een verse buis. Vul de buis met S-buffer om de wormen te wassen, en centrifuge op 1500 keer G bij vier graden Celsius gedurende 30 seconden.Verwijder de buffer en herhaal de was nog twee keer. Verwijder na de derde wasbeurt voorzichtig de supernatant, zorg ervoor dat u geen wormen verwijdert en gebruik een 1.000 microliter pipetpunt om het natte volume van de gewassen wormen te meten. Voor eiwitneerslag gebruikt u een Pasteurpipet om de gewassen wormen toe te voegen aan een gelijk volume ijskoud 10%trichloorazijnzuur in een homogenisator die op ijs wordt geplaatst.Homogeniseren met behulp van 40 slagen van passel met rotatie, tot 1,300 RPM. Gebruik een ultrasone homogenisator met 20% duty cyclus om het homogenaat sonicate. Gebruik een Pasteur pipet om het homogenaat over te brengen naar 1,5 milliliter buis geplaatst op ijs.Na het overbrengen van het homogenaat naar een microcentrifugebuis, centrifuge op 8,000 tijd G bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten om het te verduidelijken. Breng de supernatant naar een verse buis en voeg vier molaire kaliumchloride en incubeer op ijs gedurende 20 minuten om het te neutraliseren. Dan centrifugeren op 8,000 keer G op vier graden Celsius gedurende 10 minuten.Breng de supernatant naar een verse buis en bewaar op 80 graden Celsius tot het nodig is voor verdere tests. Gebruik een colorimetrische testkit om dubbele analyses uit te voeren voor de testmonsters om de concentratie van lactaat te meten. Voeg 10 microliter van de testmonsters toe aan elke put van een 96-putplaat en voeg vervolgens lactaattestbuffer toe aan elk monster om het volume aan te passen aan 15 microliter.Verdun 100 millimolar L+Lactaat Standaard met lactaattestbuffer tot één millimolar. Voeg vervolgens in een reeks putten nul, twee, vier, zes, acht en tien microliter van verdunde L+Lactaat-standaard toe. Voeg 50 microliter van reactie mix aan elke put, en uitbroeden bij kamertemperatuur beschermd tegen licht gedurende ten minste 30 minuten voor de kleur te ontwikkelen.Ten slotte, gebruik maken van een microplate lezer om de absorptie van elke put te meten op 570 nanometer. Trek de absorptie van de achtergrondcontrolemix af van de absorptie van het reactiemengsel. Zet vervolgens de standaardcurve van het lactaat in kaart en bereken de lactaatconcentraties uit de curve door elke concentratie met 2,25 te vermenigvuldigen.Gebruik een colorimetrische testkit om de concentratie pyruvaat in de testmonsters te meten en duplexonderzoeken uit te voeren. Voeg 10 microliter van de testmonsters toe aan verschillende putten van een 96-putplaat en voeg 90 microliter werkende reagens toe aan elk monster. Incubeer 30 minuten bedekt bij kamertemperatuur.Plaats vervolgens de plaat in de microplatelezer om de absorptie van elke put op 570 nanometer te meten. Zet de standaardcurve van pyruvaat in kaart en bereken de pyruvaatconcentraties uit de standaardcurve door elke concentratie met 2,25 te vermenigvuldigen. En ten slotte, om de eiwitconcentratie in de testmonsters te meten, gebruik een colorimetrische testkit zoals beschreven in het tekstprotocol.Na eiwitneerslag kunnen colorimetrische tests worden gebruikt voor de kwantitatieve bepaling van lactaat- en pyruvaatconcentraties. Dit experiment toont de nauwkeurigheid van colorimetrische tests in tegenstelling tot eerdere rapporten in C.Elegans. Bovendien zijn deze tests voldoende gevoelig voor het meten van lactaat- en pyruvaatconcentraties, zelfs in kleinschalige monsters in korte tijd.Om lactaat en pyruvaat in C.elegans nauwkeurig te detecteren, is het cruciaal om eiwitneerslag uit te voeren tijdens homogenisatie van de wormen. De hoeveelheid lactaat en pyruvaat gedetecteerd is hoger wanneer monsters eiwit neergeslagen tijdens homogenisatie, in vergelijking met intacte cytosolische fractie of na homogenisatie wanneer er geen lactaat of pyruvaat gedetecteerd op alle.

small-scale-colorimetric-assays-intracellular-lactate-pyruvate

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Deze video introduceert chemotaxis in het nematode C. elegans en toont een monsterprotocol dat chemotactische afkeer van kopersulfaat test.

C. elegans Chemotaxis Assay: een methode om chemosensatie in wormen te testen

This video describes a colorimetric assay for lactate measurement in cell lysates by using the lactate dehydrogenase enzyme. This enzyme converts lactate into pyruvate, along with the conversion of NAD to NADH that reacts with tetrazolium dyes and gives a colored product that can be measured spectrophotometrically to quantitate the lactate.

Colorimetric Assay for Quantification of Lactate in Test Samples

This video describes a colorimetric assay for quantitatively measuring pyruvate in the cellular fractions of Caenorhabditis elegans. Utilizing the hydrogen peroxide produced from the enzymatic reaction of pyruvate oxidase with cellular pyruvate, a chromogenic dye is oxidized to produce a colored product, measured using colorimetry to determine the pyruvate concentration.

Pyruvate Assay for Estimation of Pyruvate Levels in Cellular Fractions of Worms

We stellen robuuste biochemische en microscopische methoden voor het...

Biochemische en High Throughput microscopische beoordeling van Fat Mass in<em&gt; Caenorhabditis Elegans</em

Skeletspieren is essentieel voor de motoriek en is het lichaam 'belangrijkste eiwit store. Muscle gezondheid metingen binnen C. elegans beschreven. Prospectieve veranderingen in de spier structuur en functie worden beoordeeld met behulp van gelokaliseerde GFP en kationische kleurstoffen.

Methoden om subcellulaire compartimenten van Muscle beoordelen C. elegans

Een protocol wordt beschreven voor in vivo detectie van effecten van mitochondriale remmers in het modelorganisme Caenorhabditis elegans en voor identificatie van potentiële versterkende verbindingen. Dit protocol kan worden gebruikt om geneesmiddelenbibliotheken te screenen op verbindingen die de mitochondriale functie moduleren.

Een Screenbare<em&gt; In Vivo</em&gt; Test voor Mitochondriale Modulators gebruik van Transgene Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

We presenteren een gedragsopname-opstelling en protocol waarmee geautomatiseerde analyse van de nematode, Caenorhabditis elegans , de voorkeur geeft aan oplosbare verbindingen in een populatie gebaseerde assay. Dit artikel beschrijft de constructie van een gedragskamer, het gedragsprotocol en het gebruik van videoanalyse software.

Geautomatiseerde Analyse van een Chemische Sensorische Preference Assay van een Nematodebevolking

Een stapsgewijze handleiding sonde verlies van lysosomale zuurtegraad in de darm van C. elegans met behulp van de pH-gevoelige vitale kleurstof 5 (6) - carboxy - 2', 7'-dichlorofluorescein-DIACETAAT...

Beoordeling van lysosomale gealkaliseerd in de darm van levende Caenorhabditis elegans

Dit protocol beschrijft hoe de intestinale permeabiliteit van Caenorhabditis elegansmeten. Deze methode is nuttig voor fundamenteel biologisch onderzoek naar intestinale gezondheid in verband met de interactie tussen darmbacteriën en hun gastheer en voor screening om te identificeren van probiotische en chemische agentia te genezen van lekkende gut syndroom en inflammatoire darmziekten.

Meten van de effecten van bacteriën en chemicaliën op de intestinale permeabiliteit van Caenorhabditis elegans

Deze studie presenteert protocollen voor twee semi-geautomatiseerde locomotorische activiteitsanalysebenaderingen in C. elegans complex I ziekte gas-1(fc21) wormen, namelijk ZebraLab (een medium-throughput assay) en WormScan (een high-throughput assay) en biedt vergelijkende analyse tussen een breed scala aan onderzoeksmethoden om het gedrag van nematoden en de geïntegreerde neuromusculaire functie te kwantificeren.

Vergelijkende analyse van experimentele methoden om dierlijke activiteit in Caenorhabditis elegans-modellen van mitochondriale ziekte te kwantificeren

Het onderwijs in biologische wetenschappen kan voor studenten stimulerender worden gemaakt door het gebruik van experimenten. Dit manuscript presenteert twee verschillende maar complementaire protocollen die in de klas kunnen worden gebruikt om studenten aan te moedigen hypothesen te formuleren en te testen met betrekking tot calorierijke diëten, uithongering en veroudering.

Goedkope kleurstoffen gebruiken om glycogeenaccumulatie en darmintegriteit bij Caenorhabditis elegans te visualiseren

Leer kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in Caenorhabditis elegans. Deze methode met eiwitprecipitatie verbetert de nauwkeurigheid van metabolietkwantificering in dit modelorganisme.

Kleinschalige colorimetrische testen van intracellulaire lactaat en pyruvaat in de Nematode Caenorhabditis elegans

Meer video's verkennen