Name: Hoge resolutie vergelijking van bacteriële vervoeging frequenties (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Ontdek een protocol voor het detecteren van verschillen in bacteriële conjugatiefrequentie met hoge resolutie. Deze methode meet efficiënt hoe donor bacteriën conjugatie initiëren en plasmide-overdracht kwantificeren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken Dr. K. Kamachi van het National Institute of Infectious Diseases (Japan) voor het verstrekken van pBP136 en Prof. Dr. H. Nojiri van de Universiteit van Tokio (Japan) voor het verstrekken van pCAR1. Wij zijn ook dankbaar Professor Dr. Molin Sølen van de Technische Universiteit van Denemarken voor het verstrekken van pJBA28. Dit werk werd gesteund door JSPS KAKENHI (Grant nummers 15H 05618 en 15KK0278) aan MS (https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15H05618/, https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15KK0278/).

1. bereiding van een Donor met groen fluorescente proteïne (GFP)- en kanamycine resistentie gen-gelabeld plasmiden
<ol><li>Binnenbrengen van de pBP136 van de plasmide doel van markers Opmerking: Het doel van dit protocol is het genereren van pBP136::gfp. De bacteriestammen en plasmiden gebruikt in dit onderzoek zijn vermeld in tabel 1.<ol>
<li>Culturen van Escherichia coli DH10B pBP13617 in 5 mL steriele Luria Bouillon (LB) en E. coli S17-1λpir18 herbergen pJBA2819 herbergen groeien [met een kanamycine (Km)-resistentie gen en gfp mut3 * gen met haar promotor en terminator in een mini-Tn5] in 5 mL steriele LB met 50 μg/mL Km bij 37 ° C's nachts (O/N, 16-24 h) met schudden 200 omwentelingen per minuut (rpm).</li>
		<li>Oogsten en wassen<ol>
<li>Oogst 1 mL van elke cultuur, plaats deze in een 2 mL microtube en centrifuge (10.000 × g, kamertemperatuur, 2 min). Vervolgens Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 2 mL steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).</li>
			<li>Centrifuge opnieuw (10.000 × g, kamertemperatuur, 2 min) en resuspendeer in 500 μL van steriele PBS.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Filteren paring<ol>
<li>Steriele LB platen (met 1,6% agar) voor te bereiden, en plaats een steriele 0,22 μm porie grootte membraanfilter op het. Mix 500 μL van E. coli S17-1λpir herbergen pJBA28 met E. coli DH10B pBP136 en spot het mengsel op het filter op de plaat LB herbergen. Incubeer de plaat O/N bij 30 ° C. Verwijder het filter uit de LB-plaat, plaats deze in een plastic buis van steriele 50 mL en voeg 1 mL steriele PBS. Opmerking: pJBA28 kan repliceren in aanwezigheid van Π eiwit, gecodeerd door de pir gene18, en kan worden overgedragen van S17-1λpir aan DH10B. pBP136 draagt geen marker gene17 en van DH10B kan worden overgedragen aan S17-1λpir. Daarom kunnen wij geen onderscheid S17-1λpir herbergen van pBP136 en pJBA28 van de DH10B herbergen pBP136 en de mini-Tn5 (omgezet in het chromosoom of pBP136) in dit stadium. We gebruikten dan mengsels van hen als donoren in opeenvolgende stappen (1.1.4.–1.1.5.).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Een O/N cultuur van het bovenstaande paring mengsel in steriele LB met 50 μg/mL Km bij 37 ° C met schudden bij 200 rpm en een cultuur van Pseudomonas putida KT2440 groeien [Km-gevoelige (Kms), rifampicine-gevoelige (Rifs), Gentamicine-gevoelige (Gm-s), en tetracycline resistente (Tcr)] in medium met 12,5 μg/mL Tc bij 30 ° C met schudden bij 200 omwentelingen per minuut.</li>
		<li>Na het oogsten en wassen van de cellen zoals in stap 1.1.2, ze (de paring mengsel en KT2440) te gebruiken voor filter paring (O/N, 30 ° C) zoals in stap 1.1.3.</li>
		<li>Bereiden van steriele LB platen met 50 μg/mL Km en 12,5 μg/mL Tc (LB Km + Tc platen).</li>
		<li>Verdun de geresuspendeerde mengsel op het membraanfilter met steriel PBS (101–105-vouwen), en vervolgens verspreiding elke verdunning op LB Km + Tc platen en Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2-3-d.</li>
		<li>Kies kolonies van de platen, groeien een O/N cultuur in steriele LB met Km, evenals Tc en P. resinovorans CA10dm4RG (Rifr en Gmr)6 in steriele LB met Rif (25 μg/mL) en Gm (30 μg/mL) bij 30 ° C en 200 rpm. Opmerking: Zoals beschreven in de vorige opmerking, de kolonies op de LB + Km + Tc platen (van 1.1.7.) kan worden KT2440 herbergen pBP136 die een mini-Tn5 en KT2440 met een mini-Tn5, omdat pJBA28 kunnen direct worden overgebracht van S17-1λpir pBP136 en pJBA28 om KT2440 te herbergen. Dit is de reden waarom een andere paring met P. resinovorans CA10RG is vereist voor het verkrijgen van de target pBP136 met een mini-Tn-5 in de volgende stappen.</li>
		<li>Na het oogsten en wassen van de cellen zoals in stap 1.1.2, ze gebruiken voor filter paring (O/N, 30 ° C) zoals in stap 1.1.3.</li>
		<li>Bereiden van steriele LB platen met Rif, Gm en Km (LB Rif + Km + Gm platen).</li>
		<li>Resuspendeer het mengsel op het filter en vervolgens verdund het 101–105-vouw, verspreid het naar LB Rif + Km + Gm platen en Incubeer de platen voor 2 – 3 d bij 30 ° C.</li>
		<li>Kies de kolonies en controleren als zij pBP136 door PCR met behulp van specifieke primers voor het plasmide haven.</li>
	</ol></li>
	<li>Invoering van een selectieve marker-gen in de target plasmide pCAR1 Opmerking: Het doel van dit protocol is het genereren van pCAR1::gfp
	<ol>
<li>Groeien van een cultuur van de O/N van P. putida KT2440 pCAR1 herbergen (Kms, Gms, Rifs, Tcr)20 200 rpm en 30 ° C en E. coli S17-1λpir18 herbergen pJBA28 in 5 mL steriele LB bevattende 50 μg/mL Km op 200 rpm en 37 ° C.</li>
		<li>Na het oogsten en wassen van de cellen zoals in stap 1.1.2, ze gebruiken voor filter paring (O/N, 30 ° C) zoals in stap 1.1.3.</li>
		<li>Verwijder het filter uit de LB-plaat, plaats deze in een plastic buis van steriele 50 mL en voeg 1 mL steriele PBS.</li>
		<li>Verdun de geresuspendeerde mengsel met steriel PBS (101–105-vouwen), en verspreid het verdunde mengsel op steriele selectieve LB + Tc + Km platen. Opmerking: pCAR1 niet gerepliceerd in E. coli; Dus, P. putida KT2440 herbergen pCAR1 met een mini-Tn5 kunnen worden geselecteerd op LB + Tc + Km platen.</li>
		<li>Kies een kolonie van de plaat, en groeien van een cultuur van de O/N in steriele LB met Km en Tc en een cultuur van P. resinovorans CA10dm4RG in steriele LB met Rif en Gm (200 rpm, 30 ° C).</li>
		<li>Na het oogsten en wassen zoals in stap 1.1.2, de cellen gebruiken voor de filter paring (O/N, 30 ° C) zoals in stap 1.1.3.</li>
		<li>Resuspendeer het mengsel op het filter en vervolgens verdund het, verspreid op LB Rif + Km + Gm platen en Incubeer de platen voor 2 – 3 d bij 30 ° C.</li>
		<li>Kies de kolonies en controleren als zij pCAR1 door PCR met specifieke primers voor het plasmide haven.</li>
	</ol></li>
	<li>Bevestigen van de overdraagbaarheid van de tagged-plasmiden en de donoren voor te bereiden voor de volgende stappen Opmerking: Het doel van dit protocol is te bevestigen de overdraagbaarheid van de bovenstaande gebouwd plasmiden en de donoren voor te bereiden voor de volgende stappen.<ol>
<li>Groeien van een cultuur van de O/N van P. resinovorans CA10dm4RG herbergen pBP136::gfp of pCAR1::gfp in steriele LB met Km en een cultuur van P. putida SMDBS [KmsGms, Rifr, Tcr, lacI q, in welk PA1/O4/O3-gfpmut3* niet vanwege haar chromosomale lacIq gen wordt uitgedrukt]21 in 3 mL LB met Tc (200 rpm, 30 ° C).</li>
		<li>Na het oogsten en wassen van de cellen zoals in stap 1.1.2, ze gebruiken voor filter paring (O/N, 30 ° C) zoals in stap 1.1.3.</li>
		<li>Plaats de filter in een steriele 50 mL kunststof buis en resuspendeer met 1 mL steriele PBS. Verdun de geresuspendeerde mengsel met steriel PBS (101–105-vouw), verspreid het verdunde mengsel op steriele selectieve LB + Tc + Km platen.</li>
		<li>Kies de kolonies en controleren als zij elk van de plasmiden door PCR met specifieke primers haven. Opmerking: Bevestiging van het standpunt van de invoeging van de mini-Tn5 door directe het rangschikken na extractie van het plasmide is optioneel, om te bevestigen dat de invoegpositie niet aan de overdrachtsfunctie van de plasmiden afdoet.</li>
	</ol></li>
</ol>2. berekening van de vervoeging frequentie door de MPN-methode
<ol><li>Bereiden van steriele LB Km en LB + Gm platen.</li>
	<li>Een O/N cultuur van P. putida SMDBS herbergen pBP136 groeien::gfp of pCAR1::gfp in 3 mL steriele LB met Km en een cultuur van P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) in 3 mL LB met Gm (140 rpm, 30 ° C).</li>
	<li>Na het oogsten en wassen van de cellen zoals in stap 1.1.2, ze te gebruiken voor filter paring bij 30 ° C gedurende 45 minuten zoals in stap 1.1.3.</li>
	<li>Serieel verdunde de bovenstaande donor en ontvanger cultuur (101 –107) en verspreid het op LB + Km (donor) of LB + Gm (ontvanger) platen (alle in drievoud) om te tellen de kolonievormende eenheden (kve). Incubeer de platen bij 30 ° C gedurende 2 d.</li>
	<li>Resuspendeer het mengsel op het filter in steriele LB met Km en Gm, en serieel Verdun (van 21 224–107.2) met behulp van een 96-Wells cel cultuur plaat (in viervoud).</li>
	<li>Incubeer de 96-wells-plaat voor het juiste moment (2 d bij 30 ° C).</li>
	<li>De CFU van de donor en de ontvanger op de platen (stap 2.4.) tellen en tellen van het aantal putten waarin de transconjugants groeien.</li>
	<li>Bereken de MPN en haar afwijking met behulp van het MPN berekeningsprogramma ontwikkeld door Jarvis et al. 22, die beschikbaar op http://www.wiwiss.fu-berlin.de/fachbereich/vwl/iso/ehemalige/professoren/wilrich/MPN_ver5.xls is.<ol>
<li>Voer de naam van het experiment (ex., 'testen'), de datum van het experiment (ex., 2018/4/9), het aantal testreeks en de max. Nee. verdunningen (Voer '24') in rij #7 van het 'programma' blad van het Excel-bestand ('MPN_ver5.xls').</li>
		<li>' 2-1 (= 0,5) naar 2-24 (= 5.96 × 10-8)' in de kolom 'verdunning factor d'invoeren '0,01' in de kolom 'volume in ml of g w'en ' 4' in ' nr. van buizen n' in het automatisch geproduceerde gegevenstabellen ' invoer '.</li>
		<li>Voer het aantal putten waarin de transconjugants op elke monsterverdunning (0-4 groeien).</li>
		<li>Druk op de bovenste rechts 'Resultaten berekenen' knop, en vervolgens de resultaten (in MPN/μl) en hun 95%-betrouwbaarheidsgrenzen (boven- en ondergrenzen) krijgen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereken de frequentie van de vervoeging van de plasmiden, door het aantal transconjugants (MPN/mL) te delen door de nummers van donor en ontvanger cellen (CFU/mL).</li>
</ol>3. voorbereiding van de schatting van de waarschijnlijkheid van Donor aangestuurde Woordherkomst en-opbouw
<ol><li>Een O/N cultuur van P. putida SMDBS herbergen pBP136 groeien::gfp of pCAR1::gfp in 3 mL steriele LB met Km en een cultuur van P. putida KT2440RGD (Gmr, Rifr) in 3 mL steriele LB met Gm met behulp van 300 mL kolven (140 rpm, 30 ° C) als precultures.</li>
	<li>Breng 200 μL van de preculture in 200 mL verse steriele LB bevattende Km of Gm maatkolven van 500 mL en Incubeer bij 30 ° C met schudden bij 140 omwentelingen per minuut.</li>
	<li>Meten van de troebelheid op 600 nm (OD600) van de cultuur met behulp van een UV-VIS spectrofotometer en spot de cultuur, verdund in LB (101–108-vouwen verdunningen), op een LB-plaat met Km of Gm. Incubate deze LB platen bij 30 ° C gedurende 1-2 d , en het bepalen van de CFU.</li>
	<li>Plot de600 OD-waarden en de CFU met groei tijd voor het genereren van de groeicurven van de donor en de ontvanger.</li>
	<li>Culturen van de donor en ontvanger stam groeien tot halverwege log fase, op basis van de groeicurve.</li>
	<li>Na het oogsten en wassen van de cellen, 101–103 CFU van de donor in 10 μL van LB en 105–107 CFU van de ontvanger in 100 μl van LB te bereiden.</li>
	<li>Mix 10 μL van de donor en 100 μl van de ontvangende culturen op verschillende dichtheden in 96-wells-platen (in drievoud). Bijvoorbeeld, meng 101 CFU van de donor en 105 CFU van de ontvanger en toevoegen aan elk van de 96-wells, en meng 101 CFU van de donor en 106 CFU van de ontvanger in een andere 96-wells-plaat, en zo verder.</li>
	<li>Incubeer het mengsel bij 30 ° C voor 45 min, en voegt u hoge concentraties van antibiotica (100 μg/mL Km en 60 μg/mL Gm) aan elk putje te remmen verder Woordherkomst en-opbouw.</li>
	<li>Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 2 d.</li>
	<li>Het aantal putten waarin de transconjugants groeien.</li>
	<li>Kies de ontvangende dichtheid die geschikt is voor de schatting van de waarschijnlijkheid van donor aangestuurde geconjugeerde op basis van de bovenstaande gegevens (transconjugants moet worden gevonden in ten minste 1 goed van een 96-wells-plaat). Opmerking: Transconjugants zal groeien in alle putjes als de dichtheid van de cellen van donor en ontvanger hoog zijn en meer dan één vervoeging treedt op in een put. Daarentegen zal geen transconjugants worden gevonden in elke putten wanneer de celdichtheid te laag is. In de volgende sectie, wordt de cel van een enkele donor gesorteerd in een put. Daarom moet de ontvangende dichtheid op maximum.</li>
</ol>4. de schatting van de waarschijnlijkheid van Donor aangestuurde Woordherkomst en-opbouw
<ol><li>Bereiden van 200 mL van de cultuur van een mid log fase van donor P. putida SMDBS herbergen pBP136::gfp of pCAR1::gfp en die van de ontvanger P. putida KT2440RGD, zoals beschreven in 3.6 – 3.7.</li>
	<li>Plaats 106 CFU van de ontvanger in 100 μl van LB in ieder putje van een 96-wells-plaat.</li>
	<li>Opzetten van het systeem van FACS (stroom cytometry en cel sorter met een robotachtig wapen, een 488 nm argon laser en een opening van de sproeier 70 μm). Ingesteld op vooruit (FSC), spreidingsdiagrammen met gegevenspunten verbonden een drempel van 1% als de trigger van de overname. Afstemmen van de H-winst en een winst van de FSC en kant scatter (SSC) op maximale gevoeligheid, die valse positieve signalen, met behulp van PBS als een negatieve controle kunt uitsluiten. Stel de poort van de sorteren op basis van FSC en WS en 0.5 drop sorteren modus voor maximale sorteren zuiverheid.</li>
	<li>Sorteren van een enkele donor-cel met de FACS op een LB-plaat (384 verschillende plekken), Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 2 d en dan tellen hoeveel kolonies op de plaat uit de gesorteerde cellen verschijnen. Opmerking: Deze procedure is voor de validatie van de ingestelde poort. Als er 384 kolonies op de plaat zijn, betekent dit dat 100% van de gesorteerde cellen kolonies kunnen vormen. De gemiddelde geldigheidsduur van het sorteren is altijd 90-95%.</li>
	<li>Sorteren van een enkele donor-cel met de FACS in ieder putje van een 96-wells-plaat met de ontvanger (4.2).</li>
	<li>Incubeer de plaat gedurende 45 minuten bij 30 ° C, en voegt u hoge concentraties van antibiotica (100 μg/mL Km en 60 μg/mL Gm) aan elk putje om te voorkomen dat verdere Woordherkomst en-opbouw.</li>
	<li>Incubeer de plaat bij 30 ° C gedurende 2 d.</li>
	<li>Tel het aantal putten in die transconjugants als groeide bepaald door visueel onderzoek met het blote oog.</li>
	<li>De waarschijnlijkheid van donor aangestuurde geconjugeerde berekenen door het aantal putten met transconjugants door het totale aantal putten waarin de donor was gesorteerd te delen.</li>
</ol>

<ol><li>Cabezon, E., Ripoll-Rozada, J., Pena, A., de la Cruz, F., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+an+integrated+model+of+bacterial+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Towards an integrated model of bacterial conjugation.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (1), 81-95 (2015).</li>
<li>Johnson, C. M., Grossman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+and+conjugative+elements+%28ICEs%29%3A+what+they+do+and+how+they+work%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integrative and conjugative elements (ICEs): what they do and how they work.</a> Annual Review of Genetics. 49, 577-601 (2015).</li>
<li>Garcillán-Barcia, M. P., Alvarado, A., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+bacterial+plasmids+based+on+mobility+and+plasmid+population+biology%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Identification of bacterial plasmids based on mobility and plasmid population biology.</a> FEMS Microbiology Reviews. 35 (5), 936-956 (2011).</li>
<li>Smillie, C., Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., Rocha, E. P., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mobility of plasmids.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (3), 434-452 (2010).</li>
<li>Garcillán-Barcia, M. P., Francia, M. V., de la Cruz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+conjugative+relaxases+and+its+application+in+plasmid+classification%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">The diversity of conjugative relaxases and its application in plasmid classification.</a> FEMS Microbiology Reviews. 33 (3), 657-687 (2009).</li>
<li>Shintani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recipient+range+of+IncP-7+conjugative+plasmid+pCAR2+from+Pseudomonas+putida+HS01+is+broader+than+from+other+Pseudomonas+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Letters%22%5BJournal%5D)">Recipient range of IncP-7 conjugative plasmid pCAR2 from Pseudomonas putida HS01 is broader than from other Pseudomonas strains.</a> Biotechnology Letters. 27 (23-24), 1847-1853 (2005).</li>
<li>Yanagida, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+the+transferability+of+plasmids+pCAR1%2C+pB10%2C+R388%2C+and+NAH7+among+Pseudomonas+putida+at+different+cell+densities%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Comparisons of the transferability of plasmids pCAR1, pB10, R388, and NAH7 among Pseudomonas putida at different cell densities.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 80 (5), 1020-1023 (2016).</li>
<li>Schuurmans, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+growth+rate+and+selection+pressure+on+rates+of+transfer+of+an+antibiotic+resistance+plasmid+between+E.+coli+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Effect of growth rate and selection pressure on rates of transfer of an antibiotic resistance plasmid between E. coli strains.</a> Plasmid. 72, 1-8 (2014).</li>
<li>Bradley, D. E., Taylor, D. E., Cohen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+surface+mating+systems+among+conjugative+drug+resistance+plasmids+in+Escherichia+coli+K-12%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Specification of surface mating systems among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K-12.</a> Journal of Bacteriology. 143 (3), 1466-1470 (1980).</li>
<li>Nakazawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+transferability+of+incompatibility+%28Inc%29+P-7+plasmid+pCAR1+and+IncP-1+plasmid+pBP136+in+stirring+liquid+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Different transferability of incompatibility (Inc) P-7 plasmid pCAR1 and IncP-1 plasmid pBP136 in stirring liquid conditions.</a> PLoS One. 12 (10), e0186248(2017).</li>
<li>Verma, T., Ramteke, P. W., Garg, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ecological+factors+on+conjugal+transfer+of+chromium-resistant+plasmid+in+Escherichia+coli+isolated+from+tannery+effluent%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Applied+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Effect of ecological factors on conjugal transfer of chromium-resistant plasmid in Escherichia coli isolated from tannery effluent.</a> Biotechnology and Applied Biochemistry. 102 (1-6), 5-20 (2002).</li>
<li>Sakuda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Divalent+cations+increase+the+conjugation+efficiency+of+the+incompatibility+P-7+group+plasmid+pCAR1+among+different+Pseudomonas+hosts%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Divalent cations increase the conjugation efficiency of the incompatibility P-7 group plasmid pCAR1 among different Pseudomonas hosts.</a> Microbiology. 164 (1), 20-27 (2018).</li>
<li>Corliss, T. L., Cohen, P. S., Cabelli, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-plasmid+transfer+to+and+from+Escherichia+coli+strains+Isolated+from+human+fecal+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">R-plasmid transfer to and from Escherichia coli strains Isolated from human fecal samples.</a> Applied and Environmental Microbiology. 41 (4), 959-966 (1981).</li>
<li>Zhong, X., Krol, J. E., Top, E. M., Krone, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accounting+for+mating+pair+formation+in+plasmid+population+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Theoretical+Biology%22%5BJournal%5D)">Accounting for mating pair formation in plasmid population dynamics.</a> Journal of Theoretical Biology. 262 (4), 711-719 (2010).</li>
<li>Gilmour, M. W., Lawley, T. D., Taylor, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytology+of+bacterial+conjugation%5BTitle%5D)+AND+%22EcoSal+Plus%22%5BJournal%5D)">The cytology of bacterial conjugation.</a> EcoSal Plus. 2004, (2004).</li>
<li>Minoia, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochasticity+and+bistability+in+horizontal+transfer+control+of+a+genomic+island+in+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Stochasticity and bistability in horizontal transfer control of a genomic island in Pseudomonas.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (52), 20792-20797 (2008).</li>
<li>Kamachi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+pBP136+from+Bordetella+pertussis+represents+an+ancestral+form+of+IncP-1beta+plasmids+without+accessory+mobile+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Plasmid pBP136 from Bordetella pertussis represents an ancestral form of IncP-1beta plasmids without accessory mobile elements.</a> Microbiology. 152 (12), 3477-3484 (2006).</li>
<li>Simon, R., Priefer, U., Pühler, A. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nbt1183-784">A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria.</a> Nature Biotechnology. 1 (9), 784-791 (1983).</li>
<li>Andersen, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+unstable+variants+of+green+fluorescent+protein+for+studies+of+transient+gene+expression+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria.</a> Applied and Environmental Microbiology. 64 (6), 2240-2246 (1998).</li>
<li>Shintani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+replication%2C+maintenance%2C+and+transfer+features+of+the+IncP-7+plasmid+pCAR1%2C+which+carries+genes+involved+in+carbazole+and+dioxin+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the replication, maintenance, and transfer features of the IncP-7 plasmid pCAR1, which carries genes involved in carbazole and dioxin degradation.</a> Applied and Environmental Microbiology. 72 (5), 3206-3216 (2006).</li>
<li>Shintani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analyses+revealed+transfer+ranges+of+IncP-1%2C+IncP-7%2C+and+IncP-9+plasmids+in+a+soil+bacterial+community%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Single-cell analyses revealed transfer ranges of IncP-1, IncP-7, and IncP-9 plasmids in a soil bacterial community.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (1), 138-145 (2014).</li>
<li>Jarvis, B., Wilrich, C., Wilrich, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconsideration+of+the+derivation+of+most+probable+numbers%2C+their+standard+deviations%2C+confidence+bounds+and+rarity+values%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Reconsideration of the derivation of most probable numbers, their standard deviations, confidence bounds and rarity values.</a> Journal of Applied Microbiology. 109 (5), 1660-1667 (2010).</li>
<li>Haagensen, J. A., Hansen, S. K., Johansen, T., Molin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+detection+of+horizontal+transfer+of+mobile+genetic+elements%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiology+Ecology%22%5BJournal%5D)">In situ detection of horizontal transfer of mobile genetic elements.</a> FEMS Microbiology Ecology. 42 (2), 261-268 (2002).</li>
<li>Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+vectors+containing+non-antibiotic+resistance+selection+markers+for+cloning+and+stable+chromosomal+insertion+of+foreign+genes+in+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Transposon vectors containing non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal insertion of foreign genes in gram-negative bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 172 (11), 6557-6567 (1990).</li>
<li>Bagdasarian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific-purpose+plasmid+cloning+vectors.+II.+Broad+host+range%2C+high+copy+number%2C+RSF1010-derived+vectors%2C+and+a+host-vector+system+for+gene+cloning+in+Pseudomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas.</a> Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).</li>
<li>Maeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+nucleotide+sequence+of+carbazole%2Fdioxin-degrading+plasmid+pCAR1+in+Pseudomonas+resinovorans+strain+CA10+indicates+its+mosaicity+and+the+presence+of+large+catabolic+transposon+Tn4676%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Complete nucleotide sequence of carbazole/dioxin-degrading plasmid pCAR1 in Pseudomonas resinovorans strain CA10 indicates its mosaicity and the presence of large catabolic transposon Tn4676.</a> Journal of Molecular Biology. 326 (1), 21-33 (2003).</li>
<li>Takahashi, Y., Shintani, M., Yamane, H., Nojiri, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+nucleotide+sequence+of+pCAR2%3A+pCAR2+and+pCAR1+were+structurally+identical+IncP-7+carbazole+degradative+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The complete nucleotide sequence of pCAR2: pCAR2 and pCAR1 were structurally identical IncP-7 carbazole degradative plasmids.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 73 (3), 744-746 (2009).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Hier presenteren we een high-resolution protocol voor de detectie van verschillen in vervoeging frequentie onder verschillende omstandigheden, gebruik een MPN-methode voor de raming van het aantal transconjugants. Een belangrijke stap in het protocol is het verdunnen van het mengsel van donor en ontvanger na de paring tot geen transconjugants groeien. Een andere stap is het toevoegen van hoge concentraties van antibiotica aan de selectieve vloeistof om te voorkomen dat verdere Woordherkomst en-opbouw. Deze procedures kun...

Bacteriële vervoeging van mobiele genetische elementen, conjugative plasmiden en integratieve en conjugative elementen (ICEs) is belangrijk voor de horizontale verspreiding van genetische informatie. Het kan bevorderen snelle bacteriële evolutie en aanpassing en overbrengen van multidrug resistentie genen1,2. De vervoeging frequentie kan worden beïnvloed door eiwitten gecodeerd op de conjugative elementen voor mobilisatie van DNA (MOB) en de paring paar vorming (MPF), met inbegrip van geslacht pili, die zijn ingedeeld volgens MOB en MPF type3,,4, 5. Het kan ook worden beïnvloed door de donor en ontvanger paar6 en de voorwaarden van de groei van de cellen7,8,9,10,11,12 ( groeitempo op jaarbasis, celdichtheid, stevige ondergrond of opgietvloeistof, temperatuur, beschikbaarheid van nutriënten en de aanwezigheid van kationen). Om te begrijpen hoe de conjugative elementen verspreid onder bacteriën, is het noodzakelijk om te vergelijken vervoeging frequentie in detail.
De vervoeging frequentie tussen donor en ontvanger paren na de paring worden meestal als volgt geschat door conventionele methoden. (i) ten eerste, het aantal kolonies van donor en ontvanger worden geteld; (ii) dan worden de ontvangende kolonies, waaraan de conjugative elementen (= transconjugants) geteld; (iii) en ten slotte de vervoeging frequentie wordt berekend door de kolonievormende eenheden (kve) van de transconjugants door die van de donor en/of ontvanger13. Wanneer u deze methode gebruikt, is de achtergrond echter hoog als gevolg van extra vervoeging gebeurtenissen die ook op de selectieve platen gebruikt plaatsvinden kunnen voor het verkrijgen van transconjugants wanneer de celdichtheid hoge10is. Het is daarom moeilijk te detecteren van kleine verschillen in frequentie (onder een 10-fold verschil). We introduceerde onlangs een meest waarschijnlijke aantal (MPN) methode met behulp van vloeibaar medium met een hogere concentratie van antibiotica. Hierdoor verminderd de achtergrond door remming van verdere vervoeging in het selectieve medium; Dus, de vervoeging frequentie kan worden geraamd met een hogere resolutie.
Vervoeging kan worden onderverdeeld in drie stappen: (1) bevestiging van de donor-ontvanger paar (2) opening van conjugative overdracht, en (3) dissociatie van het paar14. Tijdens stap (1) en (3) is er fysieke interactie tussen de donor en de ontvanger cellen; Dus, celdichtheid en de milieuomstandigheden kunnen invloed op deze stappen, hoewel de kenmerken van het geslacht pili ook belangrijk zijn. Stap (2) is waarschijnlijk geregeld door de expressie van verschillende genen die betrokken zijn bij de vervoeging in reactie op externe veranderingen, die kunnen worden beïnvloed door verschillende functies van de plasmide, donor en ontvanger. Hoewel de fysieke bijlage of detachement van donor en ontvanger paren kan worden wiskundig gesimuleerd met behulp van een schatting van cellen als deeltjes, worden de frequentie van de stap (2) experimenteel gemeten. Er zijn een paar verslagen over directe waarnemingen van hoe vaak donoren kunnen dit leiden tot vervoeging [stap (2)] met behulp van fluorescentie microscopie15,16; deze methoden zijn echter niet high-throughput omdat een groot aantal cellen moet worden gecontroleerd. Dus, wij een nieuwe methode ontwikkeld om schatting van de waarschijnlijkheid van het optreden van de stap (2) met behulp van fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS). Onze methode kan worden toegepast op elke plasmide, zonder identificatie van de essentiële genen voor Woordherkomst en-opbouw.

<table><tbody><tr><td>MoFlo XDP</td><td>Beckman-Coulter</td><td>ML99030</td><td>FACS</td></tr><tr><td>IsoFlow</td><td>Beckman-Coulter</td><td>8599600</td><td>Sheath solution</td></tr><tr><td>Fluorospheres (10 &mu;m)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>6605359</td><td>beads to set up the FACS</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Yamato Scientific Co. Ltd</td><td>211197-IC802</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS Spectrophotometer UV-1800</td><td>SIMADZU Corporation</td><td>UV-1800</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates</td><td>NIPPON Genetics Co, Ltd</td><td>TR5003</td><td></td></tr><tr><td>microplate type Petri dish</td><td>AXEL</td><td>1-9668-01</td><td>for validation of sorting</td></tr><tr><td>membrane filter</td><td>ADVANTEC</td><td>C045A025A</td><td>for filter mating</td></tr><tr><td>pippettes</td><td>Nichiryo CO. Ltd</td><td>00-NPX2-20, 00-NPX2-200, 00-NPX2-1000</td><td>0.5-10 &mu;L, 20-200 &mu;L, 100-1000 &mu;L</td></tr><tr><td>multi-channel pippetes</td><td>Nichiryo CO. Ltd</td><td>00-NPM-8VP, 00-NPM-8LP</td><td>0.5-10 &mu;L, 20-200 &mu;L</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>BD Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BD Difco</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S-5886</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Nakarai tesque</td><td>01162-15</td><td></td></tr><tr><td>rifampicin</td><td>Wako</td><td>185-01003</td><td></td></tr><tr><td>gentamicin</td><td>Wako</td><td>077-02974</td><td></td></tr><tr><td>kanamycin</td><td>Wako</td><td>115-00342</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>AXEL</td><td>3-1491-51</td><td>JPND90-15</td></tr><tr><td>microtubes</td><td>Fukaekasei</td><td>131-815C</td><td></td></tr><tr><td>500 mL disposable spinner flask</td><td>Corning</td><td>CLS3578</td><td></td></tr></tbody></table>

hoge resolutie vergelijking van bacteriële vervoeging frequenties

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Bacteriële conjugatie is een belangrijke stap in de horizontale overdracht van antibiotica-resistentiegenen via een conjugative DNA-element. Diepgaande vergelijkingen van geconjugeerde frequentie onder verschillende omstandigheden moeten begrijpen hoe verspreidt het conjugative element in de natuur. Conventionele methodes voor het vergelijken van geconjugeerde frequentie zijn echter niet geschikt voor diepgaande vergelijkingen vanwege de hoge achtergrond veroorzaakt door extra vervoeging gebeurtenissen op de selectieve plaat. We verlaagd met succes de achtergrond door de invoering van een meest waarschijnlijke aantal (MPN) methode en een hogere concentratie van antibiotica ter voorkoming van verdere vervoeging in selectieve vloeistof. Daarnaast ontwikkelden we een protocol voor het inschatten van de kans op hoe vaak donor cellen starten vervoeging gesorteerd enkele donor cellen in ontvangende zwembaden door fluorescentie-activated cell sorting (FACS). Met behulp van twee plasmiden, kon pBP136 en pCAR1, de verschillen in de frequentie van de vervoeging in Pseudomonas putida cellen worden opgespoord in vloeistof tegen verschillende opzwepende tarieven. De frequenties van geconjugeerde Inleiding waren hoger voor pBP136 dan voor pCAR1. Met deze resultaten, kunnen we beter de functies van de vervoeging in deze twee plasmiden begrijpen.

Vergelijking van geconjugeerde frequentie door de MPN-methode
In ons vorige verslag, vergeleken we de frequenties van de vervoeging van pBP136::gfp en pCAR1::gfp in drievoudige verdunde LB (1/3 LB) vloeistof met verschillende opzwepende tarieven na een 45 min paring met 125 mL spinner kolven10. We vergeleken de frequenties van de vervoeging van pBP136::gfp en pCAR1::gfp me...

Met een doel te begrijpen van het gedrag van verschillende bacteriële conjugative DNA elementen onder verschillende omstandigheden, beschrijven we een protocol voor de detectie van verschillen in de frequentie van de conjugatie, met een hoge resolutie te schatten hoe efficiënt de donor-bacterie met deze opdracht start Woordherkomst en-opbouw.

Hoge resolutie vergelijking van bacteriële vervoeging frequenties

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in de microbiologie veld over hoe vaak plasmiDE DNA kan worden verspreid onder verschillende bacteriën. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat door het verminderen van de achtergrond, kunnen we kleine verschillen in de vervoegingsfrequentie met een hoge resolutie detecteren. Het aantonen van de procedure zal Kosuke Yanagiya, een afgestudeerde student van mijn laboratorium.Om de vervoegingsfrequentie te berekenen aan de meest waarschijnlijke getal, filtert u een milliliter uit een nachtelijke donorcultuur met één milliliter uit een nachtontvangercultuur gedurende 45 minuten bij 30 graden Celsius, zoals zojuist is aangetoond. Terwijl de co-cultuur is uitbroeden, serieel verdunnen van de oorspronkelijke donor en ontvanger culturen voor plating in drievoud op donor Luria bouillon, of LB, plus kanamycine, of ontvanger LB plus gentamycine platen voor een twee-daagse cultuur op 30 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, resuspend de cultuur op het filter in steriele LB met kanamycine en gentamycine voor seriële verdunning in een 96-bron celkweekplaat in quadruplicate.Tel na twee dagen bij 30 graden Ce

high-resolution-comparison-of-bacterial-conjugation-frequencies

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Een snelle en efficiënte methode om vreemd DNA van belang te integreren in pre-en-klare acceptor stammen, aangeduid als landingsplaats stammen, beschreven. De methode maakt het mogelijk site-specifieke integratie van een DNA-cassette in de gemanipuleerde landingsplaats locus van een bepaalde stam, door middel van conjugatie en de expressie van de ΦC31 integrase.

Site-specifieke bacteriële chromosoom Engineering: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Source: Erdogan, F.,et al., Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation. J. Vis. Exp. (2017)This video demonstrates the procedure for transferring an F plasmid from donor to recipient E. coli cells using a rescue plasmid and selecting transconjugants through dual antibiotic resistance. The process includes mixing bacterial cultures, incubation without shaking, disrupting mating pairs, and plating on selective media to confirm...

F Plasmid Transfer and Dual Antibiotic Selection in E. coli

Source: Chetrit, D., et al. Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates the preparation and imaging of fluorescently labeled pathogenic bacteria. Agarose pads are first prepared and positioned within an adhesive frame. A suspension of genetically modified bacteria expressing a fluorescent protein is applied to the pad to immobilize the cells. The...

Sample Preparation and Imaging of Fluorescently Labeled Bacteria

Hier presenteren we een protocol om een gen van belang dat betrokken is bij plasmide-conjugatie uit te schakelen en vervolgens het effect van het ontbreken ervan te analyseren met behulp van paringstests. De functie van het gen wordt verder onderzocht tot een specifiek gebied van zijn sequentie met behulp van deletie- of puntmutaties.

Conjugative Mating Testen voor sequentie-specifieke analyse van Transfer eiwitten die betrokken zijn in bacterieconjugatie

We beschrijven hier drie verschillende protocollen voor de in vitro onderzoek conjugatie, transductie en natuurlijke transformatie in Staphylococcus aureus.

Methodologie voor de studie van horizontale genoverdracht in<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Hier is een eenvoudige methode voor het maken van een bibliotheek van high-density transposon invoeging in Escherichia coli of Shigella flexneri met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw. Dit protocol kan de oprichting van een verzameling van honderden duizenden van unieke mutanten in bacteriën door de willekeurige genomic invoeging van een transposon.

Oprichting van een dichte Transposon invoeging bibliotheek met behulp van bacteriële Woordherkomst en-opbouw in de Enterobacterial stammen zoals Escherichia Coli of Shigella flexneri

Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van hoe ik) een zelfreplicerende vector met behulp van de cyanogate modulaire kloon Toolkit, II), introduceren de vector in een cyanobacterial gastheer door conjugatie, en III) karakteriseren transgene cyanobacteriën stammen met behulp van een plaat lezer of flow cytometrie.

Genetische modificatie van cyanobacteriën door conjugatie met behulp van de CyanoGate modulaire kloon Toolkit

Dit werk presenteert een microscopiemethode die live beeldvorming van een enkele cel Escherichia coli mogelijk maakt voor analyse en kwantificering van het stochastische gedrag van synthetische gencircuits.

Continue meting van biologische ruis in Escherichia Coli met behulp van time-lapse microscopie

Dit manuscript beschrijft een methode voor het gebruik van eencellige fluorescentiemicroscopie om bacteriële concurrentie in cocultuur te visualiseren en te kwantificeren.

Kwantificering van interbacteriële concurrentie met behulp van single-cell fluorescentiebeeldvorming

Conjugatie bemiddelt horizontale genoverdracht door plasmide-DNA over twee verschillende cellen te mobiliseren, waardoor de verspreiding van nuttige genen wordt vergemakkelijkt. Dit werk beschrijft een veelgebruikte methode voor de efficiënte detectie van conjugatieve plasmideoverdracht, gebaseerd op het gebruik van differentiële markers in het conjugatieve plasmide, donor en ontvanger om transconjugatie te detecteren.

Detectie van horizontale genoverdracht gemedieerd door natuurlijke conjugatieve plasmiden in E. coli

Ontdek een protocol voor het detecteren van verschillen in bacteriële conjugatiefrequentie met hoge resolutie. Deze methode meet efficiënt hoe donor bacteriën conjugatie initiëren en plasmide-overdracht kwantificeren.

Hoge resolutie vergelijking van bacteriële vervoeging frequenties

Meer video's verkennen