Name: Een roman verzadiging mutagenese aanpak: Macrostap karakterisering van regelgevende proteÃ¯ne bindend Sites in RNA met behulp van fosforthioaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 49 s
Description: Leer een nieuwe fosforthioaatmethode voor saturatiemutagenese van eiwitbindingsplaatsen in RNA. Deze techniek vereenvoudigt onderzoek naar genregulatie en RNA-eiwitinteracties in één stap.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteur dankt de National Institutes of Health voor de afgelopen financiering en Bedankt Michael R. Green voor synthese oligonucleotides.

Opmerking: Figuur 1 geeft een overzicht van phosphorothioate mutagenese en geeft een overzicht van belangrijke stappen in het proces.
1. generatie van een bibliotheek van mutanten — Doping DNA sjabloon met niet-wild Type nucleotiden
<ol><li>Synthetiseren T7 Primer (5'-GTAATACGACTCACTATAG-3') door chemische synthese op een DNA synthesizer.</li>
	<li>Synthetiseren een gedoopt oligonucleotide (complementaire strand) door chemische synthese op een DNA-synthesizer die overeenkomt met de site van de bindende eiwit. Gebruik een passende mix van phosphoramidites tijdens de chemische synthese voor elke site van doping (X hieronder) met een ratio van 90% A als de wild-type nucleotide en 10% T als de niet-wild type nucleotide (Zie representatieve resultaten voor meer informatie over deze verhouding). Opmerking: Hier, de volgorde van de gedoopt oligonucleotide is 5'-GTTCACTACACTXGAXAXAXAXCAXCXAXAXGXTGCCCTATAGTGAGTCGTATTAC-3 '. De onderstreepte volgorde is de omgekeerde aanvulling van SXL eiwit bindende site, plus extra nucleotiden buiten de bindende site waarmee nuttige besturingselementen waarin wordt bevestigd dat niet elke wijziging in het RNA beïnvloedt bindend, maar ook als laden besturingselementen voor vergelijking en normalisering van nucleotiden in de bindende site. De SXL-bindende site reeks UUUUUGUUGUUUUUUUU, die aanwezig is in de transformator pre-mRNA14,15,16,17, werd gebruikt om de voorgestelde methodologie te ontwikkelen. De volgorde in cursief is een aanvulling op de volgorde van de primer T7 en de T7 promotor voor in vitro transcriptie.</li>
</ol>2. synthese van RNA
<ol><li>
RNA in een 20 µL transcriptie reactie, als eerder beschreven18synthetiseren.
	<ol>
<li>Mix-T7 transcriptie buffer en 1 µM T7 oligonucleotide, 1 µM doped oligonucleotide, 10 mM dithiothreitol (DTT), 2 mM GTP, 1 mM elke ATP, CTP, en UTP (calciumguanosine, adenosine, cytosinetrifosfaat en uridine trifosfaat) en 2 U/µL T7 RNA-polymerase.</li>
		<li>Toevoegen, in twee aparte microcentrifuge buizen, 0.167 mM α-thio ATP of 0.05 mM α-thio UTP fosforthioaten (zie schema in Figuur 2) geïntegreerd RNAs. Opmerking: Voor alternatieve protocollen, toevoegen 0.2 mM α-thio CTP of 0,2 mM α-thio GTP een passende transcriptie reageren met een gedoopt oligonucleotide om te testen van de twee resterende nucleotide vervangingen.</li>
		<li>Incubeer de RNA-synthese reactiemengsel gedurende 2 uur bij 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.5 µL hitte-labiele alkalisch fosfatase en 2.5 µL 10xphosphatase buffer toevoegen aan het RNA-monster. Deze 25 µL reactie gedurende 10-30 minuten bij 37 ° C te verwijderen 5' fosfaten uit te broeden.</li>
	<li>Inactivering van de alkalische fosfatase-enzym door verwarming bij 80 ° C gedurende 2-5 min.</li>
	<li>Radiolabel van het einde 5' van gedefosforyleerd RNA (5 pmole) met behulp van 1 µL T4 polynucleotide kinase en 1 µL γ -32P ATP in een 10 µL reactie volume. Incubeer de reactie mix gedurende 30-60 minuten bij 37 ° C.</li>
	<li>Inactivering van de T4 polynucleotide kinase enzym door verwarming bij 65 ° C gedurende 20-30 min.</li>
	<li>Gel zuiveren het RNA door elektroforese in een 10% polyacrylamidegel denaturering. Zoek RNA op de gel met behulp van autoradiografie. Het segment van de gel met radiolabeled RNA accijnzen, verpletteren in een microcentrifuge-buis door te drukken tegen de muren met een pipet tip en geniet in proteïnase K (PK) buffer (100 mM Tris, pH 7.5, 12.5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% natrium dodecyl sulfaat). Draai de buis bij kamertemperatuur van 2 h tot 's nachts.</li>
	<li>Centrifugeer de gel drijfmest, negeren de gel en verzamelen van de bufferoplossing.</li>
	<li>Pak de oplossing tweemaal met gelijk volume van fenol-chloroform en een keer met chloroform en verzamelen van de waterige fase.</li>
	<li>Toevoegen aan het volume van de waterfase 0.1 van 3M Natriumacetaat, pH 5.2, vervoerder tRNA of glycogeen en 2.5 volume ethanol. Houd het monster bij-80 ° C gedurende 1 uur.</li>
	<li>Het monster gedurende 5-10 min. in een hoge snelheid microcentrifuge 16,873 x gcentrifugeren. Verwijder zorgvuldig de buffer/ethanol oplossing zonder verstoring van de RNA-pellet.</li>
	<li>Wassen van de pellet met 70% ethanol en Centrifugeer gedurende 2-5 min. verwijderen ethanol zorgvuldig. Droog de pellet in lucht.</li>
	<li>Resuspendeer de pellet in 20 – 50 µL diethyl pyrocarbonate (DEPC)-behandeld water. Bewaren bij-20 ° C tot gebruik. Opmerking: Alle stappen met radiolabeled RNA met behulp van passende voorzorgsmaatregelen en over een plexiglas schild te beschermen tegen radioactiviteit. Op dit moment zijn draai kolommen veelgebruikte en handiger te verwijderen designated radioactiviteit, als alternatief voor de reiniging van het gel van RNA.</li>
</ol>3. eiwit bindende reactie en scheiding van afhankelijke RNA
<ol><li>De recombinante eiwitten in Express en zuiveren van E. coli.</li>
	<li>Recombinant eiwitconcentratie te schatten door spectrofotometrie of door onderscheid in een SDS-polyacrylamide-gel naast een bekende eiwit standaard, boviene serum albumine (BSA). Visualiseer de proteïne van belang en de BSA standaard door kleuring van de gel met Coomassie briljant blauw R-250. Kwantificeren van de proteïne in vergelijking met een bekende hoeveelheid BSA verdunningen op het zelfde gel. Opmerking: Bewaar recombinant eiwit bij - 80 ° C tot gebruik en verdund in 20 mM 4-(2-Hydroxyethyl) piperazine-1-ethanesulfonic zuur (HEPES), pH 8,0, 1 mM dithiothreitol (DTT), 0,2 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), 0.05% NP-40, 20% glycerol. Gebruik van 0.5-1.0 mM protease inhibitor phenylmethane sulfonyl fluoride (PMSF) is optioneel.</li>
	<li>Uitvoeren van RNA-bindende reactie (20-100 µL) van 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM DTT, 50 mM KCl, 0.5 eenheden/µL RNase remmer, 0.09 µg/µL geacetyleerd bovien serumalbumine, 1 mM EDTA, 0,15 µg/µL tRNA, 5'-eind radiolabeled RNA en 6 µL van (een geschikte concentratie concentratie waartegen ~ 50% van het RNA aan proteïne bindt) van het eiwit. Nota: Deze bindende buffer werkt voor drie RNA-bindende proteÃ¯nen (SXL, U2AF65, en PTB), maar moet worden gestandaardiseerd voor een proteïne van belang. Eiwitconcentratie empirisch, schatten met behulp van verschillende verdunningen voor een bepaald eiwit-preparaat, die is vereist voor het verkrijgen van ongeveer 50% RNA-bindende. Deze voorwaarde of Kd vertegenwoordigt het meest gevoelige deel van de RNA-bindende-curve.</li>
	<li>Incubeer de reactie van de bindende eiwit voor 20-30 min bij 25 ° C (of op ijs).</li>
	<li>
Scheiden de eiwit-afhankelijke RNA-Fractie van de niet-afhankelijke breuk met behulp van een van de twee benaderingen:
	<ol>
<li>Nitrocellulose filter bindende<ol>
<li>De bindende reactie (20-100 µL) toepassen op een nitrocellulose filter aangesloten op een vacuüm variëteit bij kamertemperatuur. Opmerking: Alleen de RNA-eiwit complex wordt bewaard op het filter en niet-afhankelijke RNA stromen door de filter. De aanpak van de bindende filter kunt hogere herstel van de afhankelijke RNA en is sneller en eenvoudiger, in vergelijking met de gel assay voor de verschuiving van de mobiliteit. Door het plaatsen van een membraan DEAE onder het nitrocellulose filter is het ook mogelijk om te verzamelen van de niet-afhankelijke RNA-fractie of gratis RNA voor vergelijking met de gebonden Fractie.</li>
			<li>Het gedeelte van het nitrocellulose filter met de ingehouden knippen radioactieve RNA in kleinere stukken te passen in een microcentrifuge buis, geniet in voldoende PK buffer (300 – 500 µL met 10-20 µg PK) om onder te dompelen de filter stukken en elueer RNA van het filter voor 2 tot 3 h of 's nachts.</li>
			<li>Pak met fenol-chloroform, chloroform, en verzamelen van de waterige fase. Natriumacetaat en ethanol toevoegen na incubatie in vriezer, centrifugeren, wassen, drogen en resuspendeer RNA in DEPC-behandeld water. Ga als volgt te werk zoals beschreven in stappen 2.10 tot en met 2.14 boven.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Gel mobiliteit shift<ol>
<li>Bereiden en te polymeriseren een inheemse polyacrylamidegel van 5% (60:1 Acrylamide:bis-acrylamide) in 0,5 x TBE (standaard Tris-boraat-EDTA-buffer) voordat de bindende reactie, als alternatief voor de filter bindende methode.</li>
			<li>Stel vooraf de gel gedurende 15 minuten bij 250 V in een koude kamer (4 ° C).</li>
			<li>Laad elke bindende reactie (boven) in aparte putjes van de bovenstaande vooraf uitvoeren gel. Opmerking: De buffer van de opslag eiwit biedt voldoende glycerol hetvullenvan monster wells.</li>
			<li>Scheiden het RNA eiwitten gebonden door de Elektroforese van het gel in een koude kamer op 250 V gedurende 1 tot 2 uur, afhankelijk van de grootte van RNA en de specifieke proteïne.</li>
			<li>Zoek de positie van het RNA-eiwit complex aan de gel met behulp van autoradiografie. Accijnzen het gel-segment met de RNA-eiwit complex. Elueer RNA van het gel-segment door het verpletteren van het gel-segment en onderdompelen in de PK-buffer.</li>
			<li>Pak met fenol-chloroform, chloroform, en verzamelen van de waterige fase. Natriumacetaat en ethanol toevoegen na incubatie in vriezer, centrifugeren, wassen, lucht droog, en resuspendeer RNA in DEPC-behandeld water. Ga als volgt te werk zoals beschreven in stappen 2.10 tot en met 2.14 boven.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analyse van jodium-gekloofd Phosphorothioate producten voor detectie van Mutant Nucleotide posities
<ol><li>Toevoegen van 1 mM jodium in een 20 µL DEPC-behandeld water met maximaal 10 µg vervoerder tRNA te klieven RNAs (afhankelijke en totale RNAs) op de sites phosphorothioate statuten. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. Opmerking: Meer informatie over jodium decolleté met iets andere voorwaarden — 7% (v/v) iodoethanol, Verwarming op 95 ° C gedurende 3 min — kan worden gevonden in Gish & Eckstein 198819.</li>
	<li>Neerslag gekloofd RNA door toevoeging van natrium acetaat/ethanol, zoals hierboven beschreven. Resuspendeer in een laden kleurstof voor denaturering gels. Verhit en laden van het monster te scheiden van de fragmenten van RNA door elektroforese in een denatureren polyacrylamidegel van 15-20%.</li>
	<li>Bloot het polyacrylamidegel naar een X-ray film.</li>
	<li>Detecteren bands in de gebonden fractie ten opzichte van de totale pool met behulp van autoradiografie. Opmerking: Voer alle stappen uit met jodium in de kap van een uitlaat. Voor RNA scheiding komt hier te staan, is een wig-vormige gel gebruikt, die wordt bereikt door een verdubbeling van de dikte van de beide afstandhouders aan de onderkant van de gel-platen door het invoegen van een extra duim lang spacer aan de onderkant van de gel. Deze shape kunt meer eenvormige of dichter afstand tussen kortere fragmenten van RNA. U kunt ook kan een phosphorimager worden gebruikt in plaats van X-ray films voor detectie en kwantificatie van radioactiviteit.</li>
</ol>

<ol><li>Schutt, C., Nothiger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+function+and+evolution+of+sex-determining+systems+in+Dipteran+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Structure, function and evolution of sex-determining systems in Dipteran insects.</a> Development. 127 (4), 667-677 (2000).</li>
<li>Mahowald, A. P., Wei, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+determination+of+germ+cells+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Ciba+Found.+Symp%22%5BJournal%5D)">Sex determination of germ cells in Drosophila.</a> Ciba Found. Symp. 182, 193-202 (1994).</li>
<li>Steinmann-Zwicky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+germ+cells+choose+their+sex%3F+Drosophila+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">How do germ cells choose their sex? Drosophila as a paradigm.</a> Bioessays. 14 (8), 513-518 (1992).</li>
<li>Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex%2C+stem+cells+and+tumors+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Sex, stem cells and tumors in the Drosophila ovary.</a> Fly (Austin). 7 (1), 3-7 (2013).</li>
<li>Gawande, B., Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Sex-lethal+protein+mediates+polyadenylation+switching+in+the+female+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+J%22%5BJournal%5D)">Drosophila Sex-lethal protein mediates polyadenylation switching in the female germline.</a> Embo J. 25 (6), 1263-1272 (2006).</li>
<li>Robida, M. D., Rahn, A., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+of+alternatively+spliced+mRNA+targets+of+specific+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins.</a> PLoS One. 2 (6), e520(2007).</li>
<li>Samuels, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+by+Sxl+proteins+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA binding by Sxl proteins in vitro and in vivo.</a> Mol. Cell. Biol. 14 (7), 4975-4990 (1994).</li>
<li>Fujii, S., Amrein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+expressed+in+the+Drosophila+head+reveal+a+role+for+fat+cells+in+sex-specific+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Genes expressed in the Drosophila head reveal a role for fat cells in sex-specific physiology.</a> EMBO J. 21 (20), 5353-5363 (2002).</li>
<li>Kelley, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+msl-2+causes+assembly+of+dosage+compensation+regulators+on+the+X+chromosomes+and+female+lethality+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression of msl-2 causes assembly of dosage compensation regulators on the X chromosomes and female lethality in Drosophila.</a> Cell. 81 (6), 867-877 (1995).</li>
<li>Hager, J., Cline, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+female+Sex-lethal+RNA+splicing+in+male+germ+cells%3A+implications+for+Drosophila+germline+sex+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Induction of female Sex-lethal RNA splicing in male germ cells: implications for Drosophila germline sex determination.</a> Development. 124 (24), 5033-5048 (1997).</li>
<li>Vied, C., Halachmi, N., Salzberg, A., Horabin, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antizyme+is+a+target+of+sex-lethal+in+the+Drosophila+germline+and+appears+to+act+downstream+of+hedgehog+to+regulate+sex-lethal+and+cyclin+B%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Antizyme is a target of sex-lethal in the Drosophila germline and appears to act downstream of hedgehog to regulate sex-lethal and cyclin B.</a> Dev Biol. 253 (2), 214-229 (2003).</li>
<li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-lethal+facilitates+the+transition+from+germline+stem+cell+to+committed+daughter+cell+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Sex-lethal facilitates the transition from germline stem cell to committed daughter cell in the Drosophila ovary.</a> Genetics. 182 (1), 121-132 (2009).</li>
<li>Chau, J., Kulnane, L. S., Salz, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex-lethal+enables+germline+stem+cell+differentiation+by+down-regulating+Nanos+protein+levels+during+Drosophila+oogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Sex-lethal enables germline stem cell differentiation by down-regulating Nanos protein levels during Drosophila oogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (24), 9465-9470 (2012).</li>
<li>Singh, R., Valcarcel, J., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+binding+specificities+and+functions+of+higher+eukaryotic+polypyrimidine+tract-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins.</a> Science. 268 (5214), 1173-1176 (1995).</li>
<li>Singh, R., Banerjee, H., Green, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+recognition+of+the+polypyrimidine-tract+by+the+general+splicing+factor+U2AF65+and+the+splicing+repressor+sex-lethal%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Differential recognition of the polypyrimidine-tract by the general splicing factor U2AF65 and the splicing repressor sex-lethal.</a> RNA. 6 (6), 901-911 (2000).</li>
<li>Sakashita, E., Sakamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+RNA+binding+specificity+of+the+Drosophila+sex-+lethal+protein+by+in+vitro+ligand+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of RNA binding specificity of the Drosophila sex- lethal protein by in vitro ligand selection.</a> Nucleic Acids Res. 22 (20), 4082-4086 (1994).</li>
<li>Kanaar, R., Lee, A. L., Rudner, D. Z., Wemmer, D. E., Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+the+sex-lethal+RNA+binding+domains+with+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Interaction of the sex-lethal RNA binding domains with RNA.</a> EMBO J. 14 (18), 4530-4539 (1995).</li>
<li>Milligan, J. F., Uhlenbeck, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+small+RNAs+using+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Synthesis of small RNAs using T7 RNA polymerase.</a> Methods Enzymol. 180, 51-62 (1989).</li>
<li>Gish, G., Eckstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+and+RNA+sequence+determination+based+on+phosphorothioate+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">DNA and RNA sequence determination based on phosphorothioate chemistry.</a> Science. 240 (4858), 1520-1522 (1988).</li>
</ol>

De auteur verklaart geen concurrerende financiële belangen.

Mutagenese heeft lange tijd gebruikt om het eiwit bandplaatsen karakteriseren. Eerst kan een aantal mutanten worden gebouwd en individueel getest in de testen voor het analyseren van de gevolgen daarvan voor affiniteit bindend bindend. Hoewel een standaard mutagenese aanpak biedt een manier om te analyseren verschillende reeksen, meerdere stappen betrokken bij de standaardbenadering, zoals de bouw van mutanten en uitvoeren van een reeks van bindende reacties voor elke mutant, is moeizaam en tijdrovend en kan niet het toe...

Genregulatie speelt een belangrijke rol in de biologie. Genen kunnen worden geregeld op het niveau van de transcriptie, pre-mRNA-splicing, 3' eind vorming, RNA export, vertaling, lokalisatie van mRNA, verval, posttranslationele wijziging/stabiliteit, etc. die beide DNA - en RNA-bindende proteÃ¯nen spelen een sleutelrol in gen verordening. Terwijl moleculair genetische analyses hebben talrijke regelgevende proteïnen geïdentificeerd, hebben slechts een klein gedeelte van hen volledig was gekenmerkt voor hun cellulaire functies of bindende sites in vivo. Fylogenetische sequentieanalyse en mutagenese bieden complementaire benaderingen karakteriseren van DNA - of RNA-eiwit interacties.
RNA-bindende proteÃ¯nen zijn belangrijk in ontwikkelings processen, met inbegrip van seksuele differentiatie. De Drosophila eiwit Sex-dodelijke (SXL) of het geslacht-hoofdschakelaar eiwit ontbreekt in de mannetjes, maar heden bij vrouwtjes. Het herkent uridine-rijke sequenties of pyrimidine-traktaten grenzend aan specifieke splice sites in downstream pre-mRNA doelen (transformator, Sex-dodelijkeen man-specifieke lethal2) in somatische cellen1,2 ,3,4. Daarnaast reguleert het polyadenylatie site overschakelen door binding aan uridine-rijke polyadenylatie versterker sequenties in de versterker van rudimentaire (e(r)) transcript5,6. SXL waarschijnlijk regelt extra doelen in de vrouwelijke germline dat nog moet worden vastgesteld van1,7,8,9,10,11, 12 , 13.
Karakterisering van een bindende site impliceert typisch, mutagenese, bijvoorbeeld door schrapping of vervanging van één of meerdere nucleotiden. Elke mutant bindende site, ten opzichte van de wild-typen RNA volgorde, is vervolgens geanalyseerd met behulp van een reeks eiwitten concentraties te bepalen zijn bindende affiniteit (Kd of evenwicht dissociatie constant) voor de proteïne van belang; Kd is de eiwitconcentratie moet 50% RNA-bindende verkrijgen. Deze arbeidsintensieve proces van gedetailleerde mutagenese betreft generatie en analyse van talrijke mutanten — drie niet-wild type nucleotiden voor elke positie in de bindende site. Er is dus behoefte aan een alternatieve benadering voor snellere, eenvoudigere en goedkope verzadiging mutagenese van eiwit bandplaatsen in RNA.
Hier beschrijven we een one-step-aanpak waarmee de verzadiging mutagenese van een bindende eiwit in RNA. Het gaat om doping DNA sjabloon met niet-wild-type nucleotiden binnen de bindende site, synthese van afzonderlijke RNAs met elk nucleotide phosphorothioate en isolatie van de afhankelijke breuk na incubatie met eiwit. Interferentie van niet-wild-type nucleotiden leidt tot hun preferentiële uitsluiting uit de eiwit-gebonden. Dit wordt gecontroleerd door de Elektroforese van het gel na selectieve chemische decolleté met jodium van phosphodiester obligaties met fosforthioaten (phosphorothioate mutagenese of PTM). Deze-voor-stapmodus verzadiging mutagenese aanpak geldt voor de karakterisering van elke site bindende eiwit in RNA.

<table><tbody><tr><td>Uridine 5&rsquo; a-thio trifosfaat</td><td>NEN (Boston, Massachusetts)</td><td>NLP-017</td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 5&rsquo; a-thio trifosfaat</td><td>NEN (Boston, Massachusetts)</td><td>NLP-016</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum manifold</td><td>Fisher Scientific</td><td>XX1002500</td><td>Millipore&nbsp;25&nbsp;mm Glass Microanalysis Vacuum Filter</td></tr><tr><td>Vacuum manifold</td><td>Millipore</td><td>XX2702552</td><td>1225 Sampling Vacuum Manifold</td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Millipore</td><td>HAWP</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose</td><td>Schleicher &amp; Schuell</td><td>PROTRAN</td><td></td></tr><tr><td>Dephosphorlyation Kit</td><td>NEB</td><td>M0508</td><td></td></tr><tr><td>T4 Polynucleotide Kinase</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>NEB</td><td>P8107S</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>NEB</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>RNasin</td><td>Promega</td><td></td><td>RNase inhibitor</td></tr><tr><td>Glazen platen</td><td>Standaard</td><td>Standaard</td><td></td></tr><tr><td>Gel elektroforeseapparatuur</td><td>Standaard</td><td>Standaard</td><td></td></tr><tr><td>X-ray films</td><td>Standaard</td><td>Standaard</td><td></td></tr><tr><td>Polyacrylamide gel oplossingen</td><td>Standaard</td><td>Standaard</td><td></td></tr></tbody></table>

een roman verzadiging mutagenese aanpak: macrostap karakterisering van regelgevende proteÃ¯ne bindend sites in rna met behulp van fosforthioaten

A Novel Saturation Mutagenesis Approach: Single Step Characterization of Regulatory Protein Binding Sites in RNA Using Phosphorothioates

Genregulatie speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling. Talrijke DNA - en RNA-bindende proteïnen binden hun doel sequenties met hoge specificiteit te controleren van de genexpressie. Deze regelgevende eiwitten bepalen de expressie van genen op het niveau van DNA (transcriptie) of op het niveau van RNA (pre-mRNA-splicing, polyadenylatie, mRNA vervoer, verval en vertaling). Identificatie van regulerende sequenties helpt te begrijpen niet alleen hoe een gen is overgeschakeld in- of uitschakelen, maar ook welke downstream genen worden gereguleerd door een bepaalde regelgevende proteÃ¯ne. Hier beschrijven we een one-step-aanpak waarmee de verzadiging mutagenese van een bindende eiwit in RNA. Het gaat om doping DNA sjabloon met niet-wild-type nucleotiden binnen de bindende site, synthese van afzonderlijke RNAs met elk nucleotide phosphorothioate en isolatie van de afhankelijke breuk na incubatie met eiwit. Interferentie van niet-wild-type nucleotiden leidt tot hun preferentiële uitsluiting uit de eiwit-gebonden. Dit wordt gecontroleerd door de Elektroforese van het gel na selectieve chemische decolleté met jodium van phosphodiester obligaties met fosforthioaten (phosphorothioate mutagenese of PTM). Deze-voor-stapmodus verzadiging mutagenese aanpak geldt voor de karakterisering van elke site bindende eiwit in RNA.

Beginsel van verzadiging mutagenese met behulp van doping:
Voor een passende molaire verhouding van wild-type en andere nucleotiden, door een gelijke mix van alle vier nucleotiden te gebruiken als slechts één positie is om te worden geanalyseerd. Echter als meerdere posities gelijktijdig worden geanalyseerd, moet de verhouding van niet-wild type te wild-type nucleotiden worden aangepast, dat wil zeggen, verminderd. Anders,...

Eiwitten die specifieke RNA opeenvolgingen binden spelen een kritieke rol in genexpressie. Gedetailleerde karakterisering van deze bandplaatsen is van cruciaal belang voor ons begrip van de genexpressie. Hier, wordt een-voor-stapmodus aanpak voor verzadiging mutagenese van eiwit-bandplaatsen in RNA beschreven. Deze aanpak geldt voor alle websites van de binding aan eiwitten in RNA.

Een roman verzadiging mutagenese aanpak: Macrostap karakterisering van regelgevende proteÃ¯ne bindend Sites in RNA met behulp van fosforthioaten

Gene regulation plays an important role in development. Numerous DNA- and RNA-binding proteins bind their target sequences with high specificity to ...

Het algemene doel van deze fosfothioaatbenadering in RNA is om verzadigingsmutagenese in één stap uit te voeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van moleculaire biologie, zoals genexpressie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat men in één stap verzadigingsmutagenese van een eiwitbindende plaats in RNA kan bereiken.Een sleutelstap in dit protocol voor verzadigingsmutagenese in één stap is het dopen van de DNA-sjabloon met niet-wildtype nucleotiden binnen de eiwitbindende plaats. Syntheseer eerst een T7-primer door chemische synthese op een DNA-synthesizer. Vervolgens synthetiseer een gedopte oligonucleotide die overeenkomt met de eiwitbindende plaats.In dit voorbeeld bevat de onderstreepte sequentie het omgekeerde complement van de seksuele letale eiwitbindende plaats van de Drosophila, waarbij elke dopingplaats wordt weergegeven door een X. Gebruik een verhouding van 90% wildtype-nucleotide naar 10% niet-wildtype-nucleotide voor elke dopingplaats. De groene sequentie is complementair aan de T7-primersequentie en is de T7-promotor voor in vitro-transcriptie. De volgende stap in dit protocol is de synthese van afzonderlijke RNA's met elk fosfothioaatnucleotide gevolgd door 5'-einde radiolabeling van het RNA.Synthesizeer RNA's voor elk fosfothioaat in een 20-microliter transcriptiereactie. Voeg aan elke microcentrifugebuis het volgende toe: T7-transcriptiebuffer, een micromolaire T7-oligonucleotide, een micromolaire gedopte oligonucleotide, 10 millimolair DTT, twee millimolair GTP, een millimolair elk van ATP, CTP en UTP, en twee eenheden per microliter T7-RNA-polymerase. Voeg 0,167 millimolair alfa-thio-ATP toe aan één buis en 0,05 millimolair alfa-thio-UTP aan de andere buis.Incubeer de RNA-synthesereactiemengsels gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Voeg na twee uur 2,5 microliter hittelabiel alfa-fosfatase en 2,5 microliter 10X-fosfatasebuffer toe aan elk RNA-monster. Incubeer gedurende 10 tot 30 minuten bij 37 graden Celsius om 5'-fosfaten te verwijderen.Inactiveer het alkalische fosfatasenzym door twee tot vijf minuten bij 80 graden Celsius te verwarmen. De resterende stappen omvatten het gebruik van radioactiviteit en moeten worden uitgevoerd met behulp van passende voorzorgsmaatregelen en een Plexiglas schild om bescherming te bieden tegen radioactiviteit. Gebruik voor het radiolabelen van het 5'-einde van het gedefosforyleerde RNA één microliter T4-polynucleotidylkinase en één microliter Gamma P32 ATP in een reactievolume van 10 microliter.Incubeer de reactiemengsels gedurende 30 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius. Inactiveer het T4-polynucleotidylkinase-enzym door 20 tot 30 minuten bij 65 graden Celsius te verwarmen. Voer de reacties uit in een 10% denaturerende polyacrylamidegel.Lokaliseer RNA op de gel door middel van autoradiografie en snijd het gelsegment met het radiogelabelde RNA uit. Plet het gelsegment in een microcentrifugebuis door het met een pipetpunt tegen de zijkant te drukken en voeg vervolgens proteïnase K-buffer toe. Draai de buisjes bij kamertemperatuur gedurende twee uur tot een nacht.Centrifugeer vervolgens de geloplossing, verzamel de bufferoplossing en gooi de gel weg. Extraheer elke oplossing tweemaal met een gelijk volume fenol chloroform. Extraheer de oplossing daarna eenmaal met chloroform.Verzamel de waterige fase en voeg er 0,1 volume drie-molaire natriumacetaat pH 5,2, carrier tRNA of glycogeen en 2,5 volumes ethanol aan toe. Bewaar de monsters gedurende één uur bij min 80 graden Celsius. Centrifugeer de monsters in een hoogsnelheidsmicrocentrifuge gedurende vijf tot 10 minuten bij 16.873 keer g.Verwijder de buffer-ethanoloplossing voorzichtig zonder de RNA-pellets te verstoren. Was de pellets met 70% ethanol en centrifugeer gedurende twee tot vijf minuten. Verwijder het ethanol voorzichtig en laat de pellets drogen.Suspenseer elke pellet in 20 tot 50 microliter DEPC-behandeld water. Bewaar bij min 20 graden Celsius tot gebruik. Het concept van partitiëring door interferentie wordt hier geïllustreerd.Tijdens het proces van eiwitbinding verdelen RNA-moleculen zich tussen de eiwitgebonden fractie en de ongebonden fractie. Als een specifiek nucleotide op een bepaalde positie de eiwitbinding verstoort, zal het bij voorkeur worden uitgesloten van de eiwitgebonden fractie. Vervolgens wordt jodium gebruikt om de RNA's te splitsen op de plaatsen van fosfothioaat-incorporatie.Om deze procedure te beginnen, zet u de eiwit-RNA-bindingsreacties op met elke reactie die 10 millimolair Tris-HCl, één millimolair DTT, 50 millimolair kaliumchloride, 0,5 eenheden per microliter RNase-remmer, 0,09 microgram per microliter geacetyleerd bovien serumalbumine, één millimolair EDTA, 0,15 microgram per microliter tRNA, 5'-einde radiogelabeld RNA en zes microliter van een geschikte concentratie van het eiwit bevat. Incubeer de eiwitbindingsreacties gedurende 20 tot 30 minuten bij 25 graden Celsius. Scheid de eiwitgebonden RNA-fractie van de ongebonden fractie door middel van nitrocellulose filterbinding.Breng de bindingsreactie aan op een nitrocellulose filter dat is aangesloten op een vacuümmanifold bij kamertemperatuur. Alleen het RNA-eiwitcomplex zal op het filter worden vastgehouden, terwijl ongebonden RNA door het filter stroomt. Snijd het deel van het nitrocellulose filter dat het vastgehouden radioactieve RNA bevat in kleinere stukken om in een microcentrifugebuis te passen en voeg voldoende proteïnase K-buffer toe om de filterstukken onder te dompelen.Elueer RNA uit de filterstukken gedurende twee tot drie uur of een nacht. Breng vervolgens de oplossing van elke buis over in een nieuwe buis en extraheer met fenol chloroform en chloroform zoals eerder gedemonstreerd. Verzamel de waterige fase en voeg er 0,1 volume drie-molaire natriumacetaat pH 5,2 en 2,5 volumes ethanol aan toe en incubeer in de vriezer.Na centrifugatie, wassen en drogen van het RNA zoals

a-novel-saturation-mutagenesis-approach-single-step-characterization

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Vanwege het tijdelijke karakter van de pre-mRNA, kan het moeilijk zijn te isoleren en te...

Een snelle High-throughput Methode voor Mapping Ribonucleoproteins (RNP&#39;s) op de menselijke pre-mRNA

RNA transcripten zijn onderworpen aan een uitgebreide posttranscriptionele regulering die wordt bemiddeld door een veelheid van trans-werkende RNA-bindende eiwitten (RBPs). Hier presenteren wij een generaliseerbaar methode om te identificeren precies en op een transcriptoom schaal van de RNA-bindingsplaatsen van RBPs.

PAR-Clip - een methode om Transcriptome-breed de bindingsplaatsen van RNA-bindende eiwitten te identificeren

We presenteren een protocol voor de functionele beoordeling van de uitgebreide single-site verzadigingsmutagenese bibliotheken van eiwitten met behulp van high-throughput sequencing. Belangrijk is dat deze aanpak maakt gebruik van orthogonale primer paren bibliotheek bouw en sequencing multiplexen. Representatieve resultaten met behulp van TEM-1 β-lactamase gekozen klinisch relevante dosering van ampicilline wordt verschaft.

Een protocol voor Functionele Evaluatie van Whole-Protein verzadigingsmutagenese Bibliotheken Met behulp van High-throughput sequencing

RNA-eiwitinteracties liggen aan de basis van veel cellulaire processen. Hier beschrijven we een in vivo methode om specifiek RNA te isoleren en nieuwe eiwitten te identificeren die ermee geassocieerd zijn. Dit kan nieuw licht werpen op hoe RNA's in de cel worden gereguleerd.

Novel-RNA-bindende eiwitten Isolatie door de snelle Methodologie

Peptide competitiebepalingen worden veel gebruikt in een verscheidenheid aan moleculaire en immunologische experimenten. Dit document beschrijft een gedetailleerde methode voor een in vitro oligopeptide-concurrerende kinase-analyse en de bijbehorende validatieprocedures, die nuttig kunnen zijn om specifieke fosforyleringsplaatsen te vinden.

Oligopeptide Concurrentie Assay voor Fosforylatie Site Bepaling

Ribonucleotides behoren tot de meest voorkomende niet-canonieke nucleotiden in het genoom opgenomen tijdens de eukaryote nucleair DNA-replicatie. Als het niet correct is verwijderd, kan ribonucleotides DNA-beschadiging en mutagenese veroorzaken. Hier presenteren we twee experimentele benaderingen die worden gebruikt voor het beoordelen van de overvloed van ribonucleotide opneming in DNA en zijn mutagene effecten.

Studeren Ribonucleotide opneming: Strand-specifieke detectie van Ribonucleotides in het genoom van de gist en het meten van Ribonucleotide-geïnduceerde mutagenese

Plaats-geleide mutagenese is een techniek die wordt gebruikt om specifieke mutaties in deoxyribonucleic acid (DNA). Dit protocol beschrijft hoe het te doen plaats-geleide mutagenese met een 2-step en 3-staps polymerase-kettingreactie (PCR) gebaseerde benadering, die is van toepassing op elk fragment van DNA van belang.

Plaats-geleide mutagenese voor In Vitro en In Vivo experimenten wordt geïllustreerd met RNA interacties in Escherichia Coli

Bij deze methode kwantificeren we de bindende affiniteit van RNA-bindende eiwitten (rbp's) naar verwant en niet-verwant binding sites met behulp van een eenvoudige, Live, reporter assay in bacteriële cellen. De test is gebaseerd op onderdrukking van een reporter-gen.

Een test voor het kwantificeren van eiwit-RNA-binding bij bacteriën

Sequentie specificiteit is essentieel voor genregulatie. Regelgevende eiwitten die specifieke sequenties herkennen zijn belangrijk voor genregulatie. Het definiëren van functionele binding sites voor dergelijke eiwitten is een uitdagend biologisch probleem. Een iteratieve benadering voor de identificatie van een bindingsplaats voor een RNA-bindend eiwit wordt hier beschreven en is toepasbaar op alle RNA-bindende eiwitten.

Sequentie ruimte verkennen om bindende sites te identificeren voor regulatoire RNA-bindende eiwitten

Dit protocol beschrijft een niet-radioactieve test om kinase activiteit van polynucleotide kinases (PNKs) te meten op kleine DNA- en RNA-substraten.

Niet-radioactieve test om polynucleotide fosforylatie van kleine nucleotide substraten te meten

Het protocol geeft instructies voor het modificeren van RNA met dimethylsulfaat voor mutatieprofileringsexperimenten. Het omvat in vitro en in vivo tasten met twee alternatieve bibliotheekvoorbereidingsmethoden.

Onderzoekende RNA-structuur met dimethylsulfaatmutatieprofilering met sequencing in vitro en in cellen

Leer een nieuwe fosforthioaatmethode voor saturatiemutagenese van eiwitbindingsplaatsen in RNA. Deze techniek vereenvoudigt onderzoek naar genregulatie en RNA-eiwitinteracties in één stap.

Een roman verzadiging mutagenese aanpak: Macrostap karakterisering van regelgevende proteÃ¯ne bindend Sites in RNA met behulp van fosforthioaten (Video) | JoVE Journal

Een roman verzadiging mutagenese aanpak: Macrostap karakterisering van regelgevende proteÃ¯ne bindend Sites in RNA met behulp van fosforthioaten

Meer video's verkennen