Een roman verzadiging mutagenese aanpak: Macrostap karakterisering van regelgevende proteïne bindend Sites in RNA met behulp van fosforthioaten

Het algemene doel van deze fosfothioaatbenadering in RNA is om verzadigingsmutagenese in één stap uit te voeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen op het gebied van moleculaire biologie, zoals genexpressie. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat men in één stap verzadigingsmutagenese van een eiwitbindende plaats in RNA kan bereiken.

Een sleutelstap in dit protocol voor verzadigingsmutagenese in één stap is het dopen van de DNA-sjabloon met niet-wildtype nucleotiden binnen de eiwitbindende plaats. Syntheseer eerst een T7-primer door chemische synthese op een DNA-synthesizer. Vervolgens synthetiseer een gedopte oligonucleotide die overeenkomt met de eiwitbindende plaats.

In dit voorbeeld bevat de onderstreepte sequentie het omgekeerde complement van de seksuele letale eiwitbindende plaats van de Drosophila, waarbij elke dopingplaats wordt weergegeven door een X. Gebruik een verhouding van 90% wildtype-nucleotide naar 10% niet-wildtype-nucleotide voor elke dopingplaats. De groene sequentie is complementair aan de T7-primersequentie en is de T7-promotor voor in vitro-transcriptie. De volgende stap in dit protocol is de synthese van afzonderlijke RNA's met elk fosfothioaatnucleotide gevolgd door 5'-einde radiolabeling van het RNA.

Synthesizeer RNA's voor elk fosfothioaat in een 20-microliter transcriptiereactie. Voeg aan elke microcentrifugebuis het volgende toe: T7-transcriptiebuffer, een micromolaire T7-oligonucleotide, een micromolaire gedopte oligonucleotide, 10 millimolair DTT, twee millimolair GTP, een millimolair elk van ATP, CTP en UTP, en twee eenheden per microliter T7-RNA-polymerase. Voeg 0,167 millimolair alfa-thio-ATP toe aan één buis en 0,05 millimolair alfa-thio-UTP aan de andere buis.

Incubeer de RNA-synthesereactiemengsels gedurende twee uur bij 37 graden Celsius. Voeg na twee uur 2,5 microliter hittelabiel alfa-fosfatase en 2,5 microliter 10X-fosfatasebuffer toe aan elk RNA-monster. Incubeer gedurende 10 tot 30 minuten bij 37 graden Celsius om 5'-fosfaten te verwijderen.

Inactiveer het alkalische fosfatasenzym door twee tot vijf minuten bij 80 graden Celsius te verwarmen. De resterende stappen omvatten het gebruik van radioactiviteit en moeten worden uitgevoerd met behulp van passende voorzorgsmaatregelen en een Plexiglas schild om bescherming te bieden tegen radioactiviteit. Gebruik voor het radiolabelen van het 5'-einde van het gedefosforyleerde RNA één microliter T4-polynucleotidylkinase en één microliter Gamma P32 ATP in een reactievolume van 10 microliter.

Incubeer de reactiemengsels gedurende 30 tot 60 minuten bij 37 graden Celsius. Inactiveer het T4-polynucleotidylkinase-enzym door 20 tot 30 minuten bij 65 graden Celsius te verwarmen. Voer de reacties uit in een 10% denaturerende polyacrylamidegel.

Lokaliseer RNA op de gel door middel van autoradiografie en snijd het gelsegment met het radiogelabelde RNA uit. Plet het gelsegment in een microcentrifugebuis door het met een pipetpunt tegen de zijkant te drukken en voeg vervolgens proteïnase K-buffer toe. Draai de buisjes bij kamertemperatuur gedurende twee uur tot een nacht.

Centrifugeer vervolgens de geloplossing, verzamel de bufferoplossing en gooi de gel weg. Extraheer elke oplossing tweemaal met een gelijk volume fenol chloroform. Extraheer de oplossing daarna eenmaal met chloroform.

Verzamel de waterige fase en voeg er 0,1 volume drie-molaire natriumacetaat pH 5,2, carrier tRNA of glycogeen en 2,5 volumes ethanol aan toe. Bewaar de monsters gedurende één uur bij min 80 graden Celsius. Centrifugeer de monsters in een hoogsnelheidsmicrocentrifuge gedurende vijf tot 10 minuten bij 16.873 keer g.

Verwijder de buffer-ethanoloplossing voorzichtig zonder de RNA-pellets te verstoren. Was de pellets met 70% ethanol en centrifugeer gedurende twee tot vijf minuten. Verwijder het ethanol voorzichtig en laat de pellets drogen.

Suspenseer elke pellet in 20 tot 50 microliter DEPC-behandeld water. Bewaar bij min 20 graden Celsius tot gebruik. Het concept van partitiëring door interferentie wordt hier geïllustreerd.

Tijdens het proces van eiwitbinding verdelen RNA-moleculen zich tussen de eiwitgebonden fractie en de ongebonden fractie. Als een specifiek nucleotide op een bepaalde positie de eiwitbinding verstoort, zal het bij voorkeur worden uitgesloten van de eiwitgebonden fractie. Vervolgens wordt jodium gebruikt om de RNA's te splitsen op de plaatsen van fosfothioaat-incorporatie.

Om deze procedure te beginnen, zet u de eiwit-RNA-bindingsreacties op met elke reactie die 10 millimolair Tris-HCl, één millimolair DTT, 50 millimolair kaliumchloride, 0,5 eenheden per microliter RNase-remmer, 0,09 microgram per microliter geacetyleerd bovien serumalbumine, één millimolair EDTA, 0,15 microgram per microliter tRNA, 5'-einde radiogelabeld RNA en zes microliter van een geschikte concentratie van het eiwit bevat. Incubeer de eiwitbindingsreacties gedurende 20 tot 30 minuten bij 25 graden Celsius. Scheid de eiwitgebonden RNA-fractie van de ongebonden fractie door middel van nitrocellulose filterbinding.

Breng de bindingsreactie aan op een nitrocellulose filter dat is aangesloten op een vacuümmanifold bij kamertemperatuur. Alleen het RNA-eiwitcomplex zal op het filter worden vastgehouden, terwijl ongebonden RNA door het filter stroomt. Snijd het deel van het nitrocellulose filter dat het vastgehouden radioactieve RNA bevat in kleinere stukken om in een microcentrifugebuis te passen en voeg voldoende proteïnase K-buffer toe om de filterstukken onder te dompelen.

Elueer RNA uit de filterstukken gedurende twee tot drie uur of een nacht. Breng vervolgens de oplossing van elke buis over in een nieuwe buis en extraheer met fenol chloroform en chloroform zoals eerder gedemonstreerd. Verzamel de waterige fase en voeg er 0,1 volume drie-molaire natriumacetaat pH 5,2 en 2,5 volumes ethanol aan toe en incubeer in de vriezer.

Na centrifugatie, wassen en drogen van het RNA zoals