De Replica Set, methode: Een High-throughput benadering van kwantitatief maatregel Caenorhabditis elegans levensduur

Honderden genen zijn geïdentificeerd waarvan de functie van invloed is op hoe een organisme veroudert. Maar veel van hun relaties zijn slecht begrepen. Deze methode kan helpen een sleutelvraag in het verouderingsveld te beantwoorden.

Namelijk, wat zijn de genetische onderlinge relaties tussen gerA-genen? Het belangrijkste voordeel van deze techniek is een toename in doorvoer, het aantal genetische debatten dat tegelijkertijd kwantitatief kan worden gemeten, is met ten minste een orde van grootte toegenomen. Levensduurdata, verzameld met deze procedure, kunnen worden uitgezet en geanalyseerd met behulp van software die we bij deze publicatie verstrekken.

Naast het verschaffen van inzicht in de levensduur, kan deze methode ook worden toegepast op andere leeftijdsgerelateerde fenotypes, zoals stressresistentie en veranderingen in gezondheidsplan. Voor deze procedure maakt u een verse stempel van de RNAi-subbibliotheek. Verdeel eerst elke put van een 96-wellplaat met 200 microliter LB met ampicilline, met behulp van een 12-kanaals pipet.

Steriliseer een 96-pin replicator door de pinnen opeenvolgend in 50% bleek te dompelen, gevolgd door ultra puur water. Dompel vervolgens de punten in ethanol en vlam de punten voorzichtig. Vervolgens verwijdert u voorzichtig de kleeffolie van een bevroren 96-well glycerol stockbibliotheekplaat en verliest u voorzichtig de punten van de gesteriliseerde plaatreplicator in de putten van de nog bevroren glycerol stocks.

Vervolgens inoculeert u de culturen en verzegelt u de geïnoculeerde plaat met de permeabele membraan. Laat de culturen een nacht op de werktafel groeien. De volgende dag steriliseert u de plaatreplicator en verwijdert u voorzichtig het zegel van de nachtcultuur en dompelt u de punten van de replicatorpinnen.

Vervolgens inoculeert u een rechthoekige LB ampicilline en tetracycline agarplaat met de pinnen. Oefen gelijkmatige druk uit en gebruik een kleine, cirkelvormige beweging om de bacteriën over te brengen zonder dat de vlekken te dicht bij elkaar komen. Vervolgens worden de platen een nacht in een broedkast van 37 graden Celsius bewaard.

De volgende dag laadt u voor elke 10 replica platen die nodig zijn, elk putje van een diepe 96-well plaat met 1,5 milliliter LB met ampicilline. Vervolgens inoculeert u de putjes met de gekweekte bacteriën. Vervolgens wordt de plaat afgesloten met een ademende membraan, gekweekt gedurende 20 uur met schudden.

Controleputjes moeten over de 96 putjes worden verspreid, zodat wanneer de 96-well subbibliotheekplaat wordt verdeeld in groepen van 24, elke verdeling van 24 putjes er één van elk van de controles heeft. De volgende dag laadt u 120 microliter aliquots van de cultuur, naar de 24-well platen, met behulp van een zes-well multichannel pipet, met verstelbare tipafstand. Droog vervolgens platen onbedekt in een laminaire stromingskast tot alle vloeistof is geabsorbeerd.

Laat ze niet te droog worden. Zorg ervoor dat u uw focus behoudt bij het afpipetten van vloeibare culturen, om ervoor te zorgen dat de juiste bacteriecultuur in de juiste put in de 24-well plaat wordt geplaatst. Replica set experimenten beginnen met de set onafhankelijke, 24-well replicaatplaten, elk gezaaid met dezelfde bacterie RNAi klonen.

Voor levensduur experimenten worden 15 tot 20 L1 dieren aan elke plaatput toegevoegd en toegestaan om te groeien tot de L4 fase. Bij L4 wordt FUdR toegevoegd aan alle putjes in replica's. Later op dezelfde dag kan een replicaplaat uit de set worden genomen en als eerste tijdstip worden gescored.

Om de levensduur te scoren, wordt er vloeistof toegevoegd aan de putjes van de plaat om beweging van de dieren te induceren. Dieren die niet beginnen te bewegen worden voorzichtig aangeraakt met een wormpick. Het totale aantal dieren en het aantal dode dieren worden vervolgens geregistreerd.

De plaat van de eerste observatie wordt vervolgens weggegooid. Bij het volgende observatietijdstip wordt een andere replicaplaat uit de set genomen en op dezelfde manier gescored. Dit wordt herhaald op het vastgestelde scoreinterval.

Elke keer met een nieuwe plaat uit de replica set. Ga door met het scoren van een set platen totdat er geen dieren meer levend zijn. Synchroniseer eerst een populatie dieren met dezelfde bleek-gebaseerde voorbereidingsmethode die wordt gebruikt voor de traditionele levensduurtest.

Vervolgens zaait u met behulp van een zes-well pipet met verstelbare tipafstand en reagent reservoir, 15 tot 20 L1 dieren in elk putje van de voorbereide 24-well platen. Terwijl u de platen zaait, mengt u periodiek de L1 dieren in oplossing om een gelijkmatige verdeling te behouden. Laat nu de dieren ontwikkelen tot L4. Het tijdstip van L4 ontwikkeling moet voor dit protocol bekend zijn.

Controleer regelmatig de ontwikkeling van de wormen. Wanneer dieren L4 bereiken, voegt u 24 microliter 50x FUdR toe aan elk putje en zet de platen terug in de broedkast. Het gebruik van L4 dieren is cruciaal.

Als hermafrodieten voor het toevoegen van FUdR reproductieve volwassenheid bereiken, zullen hun nakomelingen overleven en het voedsel eten. Omgekeerd leidt het te vroeg toevoegen van FUdR tot gebroken dieren. Op de gewenste tijdstippen gebruikt u één replicaplaat om de levensvatbaarheid te scoren.

Om dit te doen, overspoelt u het putje met M9 oplossing. Voordat u de levensvatbaarheid elke dag scoort, controleert u eventuele putjes die geen voedsel hebben, er besmet uitzien of dieren hebben met morfologische of ontwikkelingsdefecten. Voor elk putje noteert u het totale aantal dieren per putje en controleert u de status van niet bewegende wormen door ze voorzichtig op het hoofd aan te raken met een wormpick.

Na het tellen van alle niet bewegende doden in een plaat, gooit u de plaat weg. Voor deze procedure laat u getransformeerde e. Coli overnacht groeien in LB met ampicilline.

De volgende dag concentreert u de bacteriën door centrifugatie bij 3