Name: De rankpootkreeften Balanus improvisus als een Marine Model - kweken en genexpressie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Leer het kweken van de rankpootkreeft Balanus improvisus voor marien onderzoek naar osmoregulatie en antifouling. Deze methode levert tot 50.000 larven per week op voor genexpressiestudies.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dit onderzoek werd gesteund door subsidie 2017-04559 van de Zweedse Raad voor onderzoek (VR) en de EU ondersteunde project kust naar Anders Blomberg. In het bijzonder, de oprichting van het kweken faciliteit, jarenlang werd ondersteund door subsidies aan Per R. Jonsson uit de volgende financieringsinstanties: SSF (Zweedse Stichting voor strategisch onderzoek) via het programma mariene wetenschap en technologie en MISTRA via het programma Marine verf. Kent Berntsson speelde in de vroege fasen van het opzetten van de culturingfacility. Extra geld voor de vaststelling van de kweken faciliteit is gekomen van het centrum voor mariene evolutionaire biologie (www.cemeb.science.gu.se), die is gesteund door een subsidie van Linnaeus van de Zweedse onderzoek raden FORMAS en VR.

<ol><li>Darwin, C. <a target="_blank" href="https://www.biodiversitylibrary.org/bibliography/2104#/summary">A monograph of the sub-class Cirripedia, with figures of all species. The Balanidae (or sessile cirripedes); the Verrucidae, etc., etc., etc</a>. , Ray Society. London, UK. (1854).</li>
<li>Lind, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aquaporins+from+the+euryhaline+barnacle+Balanus+improvisus+reveals+differential+expression+in+response+to+changes+in+salinity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Analysis of aquaporins from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals differential expression in response to changes in salinity.</a> PLoS ONE. 12 (7), 0181192(2017).</li>
<li>Lind, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+the+alpha-subunit+of+Na%2B%2FK%2B+ATPase+from+the+euryhaline+barnacle+Balanus+improvisus+reveals+multiple+genes+and+differential+expression+of+alternative+splice+variants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of the alpha-subunit of Na+/K+ ATPase from the euryhaline barnacle Balanus improvisus reveals multiple genes and differential expression of alternative splice variants.</a> PLoS ONE. 8, 77069(2013).</li>
<li>Fyhn, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Holeuryhalinity+and+its+mechanisms+in+a+cirriped+crustacean%2C+Balanus+improvisus%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+-+Part+A%3A+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Holeuryhalinity and its mechanisms in a cirriped crustacean, Balanus improvisus.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part A: Comparative Physiology. 53 (1), 19-30 (1976).</li>
<li>Wrange, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+story+of+a+hitchhiker%3A+population+genetic+patterns+in+the+invasive+barnacle+Balanus+%28Amphibalanus%29+improvisus+Darwin+1854%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">The story of a hitchhiker: population genetic patterns in the invasive barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus Darwin 1854.</a> PLoS ONE. 11 (1), 0147082(2016).</li>
<li>Berntsson, K. M., Jonsson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+and+spatial+patterns+in+recruitment+and+succession+of+a+temperate+marine+fouling+assemblage%3A+a+comparison+of+static+panels+and+boat+hulls+during+the+boating+season%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Temporal and spatial patterns in recruitment and succession of a temperate marine fouling assemblage: a comparison of static panels and boat hulls during the boating season.</a> Biofouling. 19 (3), 187-195 (2003).</li>
<li>Lind, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Octopamine+receptors+from+the+barnacle+Balanus+improvisus.+are+activated+by+the+alpha2-adrenoceptor+agonist+medetomidine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Octopamine receptors from the barnacle Balanus improvisus. are activated by the alpha2-adrenoceptor agonist medetomidine.</a> Molecular Pharmacology. 78 (2), 237-248 (2010).</li>
<li>Semmler, H., Hoeg, J. T., Scholtz, G., Wanninger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+reconstruction+of+the+naupliar+musculature+and+a+scanning+electron+microscopy+atlas+of+nauplius+development+of+Balanus+improvisus+%28Crustacea%3A+Cirripedia%3A+Thoracica%29%5BTitle%5D)+AND+%22Arthropod+Structure+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional reconstruction of the naupliar musculature and a scanning electron microscopy atlas of nauplius development of Balanus improvisus (Crustacea: Cirripedia: Thoracica).</a> Arthropod Structure & Development. 38 (2), 135-145 (2009).</li>
<li>Anderson, D. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAnderson%2C+DT+%22Barnacles+-+structure%2C+function%2C+development+and+evolution%22">Barnacles - structure, function, development and evolution</a>. , Chapman & Hall. London, UK. (1994).</li>
<li>Kennedy, V. S., DiCosimo, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.2307/1351700">Subtidal distribution of barnacles in Chesapeake Bay, Maryland.</a> Estuaries. 6, 95-101 (1983).</li>
<li>Dreanno, C., Kirby, R. R., Clare, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locating+the+barnacle+settlement+pheromone%3A+spatial+and+ontogenetic+expression+of+the+settlement-inducing+protein+complex+of+Balanus+amphitrite%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Locating the barnacle settlement pheromone: spatial and ontogenetic expression of the settlement-inducing protein complex of Balanus amphitrite.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 273, 2721-2728 (2006).</li>
<li>Rittschoff, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/08927019809378344">Cues and context: larval responses to physical and chemical cues.</a> Biofouling. 12 (1-3), 31-44 (1998).</li>
<li>Berntsson, K. M., Jonsson, P. R., Lejhall, M., Gatenholm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+behavioural+rejection+of+micro-textured+surfaces+and+implications+for+recruitment+by+the+barnacle+Balanus+improvisus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Marine+BIology+and+Ecology%22%5BJournal%5D)">Analysis of behavioural rejection of micro-textured surfaces and implications for recruitment by the barnacle Balanus improvisus.</a> Journal of Experimental Marine BIology and Ecology. 251 (1), 59-83 (2000).</li>
<li>Gamfeldt, L., Wallén, J., Jonsson, P. R., Berntsson, K. M., Havenhand, J. N. <a target="_blank" href="https://esajournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1890/05-0377">Increasing intraspecific diversity enhances settling success in a marine invertebrate.</a> Ecology. 86, 3219-3224 (2005).</li>
<li>Rittschof, D., Clare, A. S., Gerhart, D. J., Sister Avelin, M., Bonaventura, J. Barnacle in vitro assays for biologically active substances: toxicity and settlement inhibition assays using mass cultured Balanus amphitrite amphitrite Darwin. Biofouling. 6 (2), 115-122 (1992).</li>
<li>Pansch, C., Schaub, I., Havenhand, J., Wahl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Habitat+traits+and+food+availability+determine+the+response+of+marine+invertebrates+to+ocean+acidification%5BTitle%5D)+AND+%22Global+Change+Biology%22%5BJournal%5D)">Habitat traits and food availability determine the response of marine invertebrates to ocean acidification.</a> Global Change Biology. 20 (3), 765-777 (2014).</li>
<li>Guillard, R. R. L. Culture of phytoplankton for feeding marine invertebrates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGuillard%2C+RRL+%22Culture+of+marine+invertebrate+animals%22">Culture of marine invertebrate animals</a>. Smith, W. L., Chanley, M. H. , Springer. Boston, MA. 22-60 (1975).</li>
<li>Wrange, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+plasticity+and+local+adaptation+for+coping+with+changing+salinity+in+coastal+areas%3A+a+test+case+with+barnacles+in+the+Baltic+Sea%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Importance of plasticity and local adaptation for coping with changing salinity in coastal areas: a test case with barnacles in the Baltic Sea.</a> BMC Evolutionary Biology. 14, 156(2014).</li>
<li>Bacchetti De Gregoris, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+an+adult+barnacle+%28Balanus+amphitrite%29+cDNA+library+and+selection+of+reference+genes+for+quantitative+RT-PCR+studies%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Construction of an adult barnacle (Balanus amphitrite) cDNA library and selection of reference genes for quantitative RT-PCR studies.</a> BMC Molecular Biology. 10, 62(2009).</li>
<li>Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+insect+RNA+look+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Why does insect RNA look degraded.</a> Journal of Insect Science. 10, 159(2010).</li>
<li>Panova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+extraction+protocols+for+whole-genome+sequencing+in+marine+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+BIology%22%5BJournal%5D)">DNA extraction protocols for whole-genome sequencing in marine organisms.</a> Methods in Molecular BIology. 1452, 13-44 (2016).</li>
<li>Berglin, M., Larsson, A., Jonsson, P., Paul Gatenholm, P. <a target="_blank" href="https://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1163/156856101753213321">The adhesion of the barnacle, Balanus improvisus, to poly(dimethylsiloxane) fouling-release coatings and poly(methyl methacrylate) panels: the effect of barnacle size on strength and failure mode.</a> Journal of Adhesion Science and Technology. 15, 1485-1502 (2001).</li>
<li>Larsson, A. I., Granhag, L. M., Jonsson, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instantaneous+flow+structures+and+opportunities+for+larval+settlement%3A+barnacle+larvae+swim+to+settle%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Instantaneous flow structures and opportunities for larval settlement: barnacle larvae swim to settle.</a> PLoS ONE. 11, 0158957(2016).</li>
<li>Toth, G. B., Lindeborg, M. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/237075903_Water-soluble_compounds_from_the_breadcrumb_sponge_Halichondria_panicea_deter_attachment_of_the_barnacle_Balanus_improvisus">Water-soluble compounds from the breadcrumb sponge Halichondria panicea. deter attachment of the barnacle Balanus improvisus.</a> Marine Ecology Progress Series. 354, 125-132 (2008).</li>
<li>Pansch, C., Jonsson, P. R., Berglin, M., Pinori, E., Wrange, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+flow-through+bioassay+for+testing+low-emission+antifouling+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">A new flow-through bioassay for testing low-emission antifouling coatings.</a> Biofouling. 33 (8), 613-623 (2017).</li>
<li>Walne, P. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/journal-of-the-marine-biological-association-of-the-united-kingdom/article/observations-on-the-food-value-of-seven-species-of-algae-to-the-larvae-of-ostrea-edulis-i-feeding-experiments/11A8912C69162E0203BFC4079CD28070">Observation of food value of 7 species of algae to larvae of Ostrea edulis 1. Feeding experiments.</a> Journal of the Marine Biological Associateion of the UK. 43, 767-784 (1963).</li>
<li>Sandnes, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+and+automatic+density+control+of+large-scale+microalgal+cultures+using+near+infrared+%28NIR%29+optical+density+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring and automatic density control of large-scale microalgal cultures using near infrared (NIR) optical density sensors.</a> Journal of Biotechnology. 122 (2), 209-215 (2006).</li>
<li>Neufeldt, C. J., Palmer, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precisely+proportioned%3A+intertidal+barnacles+alter+penis+form+to+suit+coastal+wave+action%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Precisely proportioned: intertidal barnacles alter penis form to suit coastal wave action.</a> Proceedings of the Royal Society B Biological Sciences. 275, 1081-1087 (2008).</li>
<li>Dunstan, G., Volkman, J., Barrett, S., Leroi, J., Jeffrey, S. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0031942200905259">Essential polyunsaturated fatty acids from 14 species of diatom (Bacillariophyceae).</a> Phytochemistry. 35, 155-161 (1994).</li>
<li>Jonsson, P. R., Berntsson, K., André, C., Wängberg, S. -Å <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s002270050571">Larval growth and settlement of the European oyster (Ostrea edulis) as a function of food quality measured as fatty acid composition.</a> Marine Biology. 134 (3), 559-570 (1999).</li>
<li>Comps, M., Bonami, J. R., Vago, C. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=FR19770139223">Virus-disease of Portuguese oyster (Crassostrea angulata. lmk).</a> Comptes rendus hebdomadaires des séances de l'Académie des Sciences. Série D, Sciences naturelles. 282, 1991-1993 (1976).</li>
<li>Segarra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+description+of+a+particular+Ostreid+herpesvirus.+1+genotype+associated+with+massive+mortality+outbreaks+of+Pacific+oysters%2C+Crassostrea+gigas%2C+in+France+in+2008%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Detection and description of a particular Ostreid herpesvirus. 1 genotype associated with massive mortality outbreaks of Pacific oysters, Crassostrea gigas, in France in 2008.</a> Virus Research. 153 (1), 92-99 (2010).</li>
<li>Suquet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival%2C+growth+and+reproduction+of+cryopreserved+larvae+from+a+marine+invertebrate%2C+the+Pacific+oyster+%28Crassostrea+gigas%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Survival, growth and reproduction of cryopreserved larvae from a marine invertebrate, the Pacific oyster (Crassostrea gigas).</a> PLoS ONE. 9 (4), 93486(2014).</li>
<li>Martínez-Páramo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryobanking+of+aquatic+species%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture%22%5BJournal%5D)">Cryobanking of aquatic species.</a> Aquaculture. 472, 156-177 (2017).</li>
<li>Anil, A. C., Tulaskar, A. S., Khandeparkar, D. C., Wagh, A. B. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0011224096919914">Cryopreservation of Balanus amphitrite nauplii.</a> Cryobiology. 34, 131-140 (1997).</li>
<li>Oo, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/288595251_Cryopreservation_of_Nauplius_Larvae_of_the_Barnacle_Balanus_amphitrite_Darwin">Cryopreservation of nauplius larvae of the barnacle, Balanus amphitrite Darwin.</a> Fisheries Science. 64, 857-860 (1998).</li>
<li>Lin, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+study+on+gene+expression+of+cement+proteins+and+potential+adhesion-related+genes+of+a+membranous-based+barnacle+as+revealed+from+next-generation+sequencing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">First study on gene expression of cement proteins and potential adhesion-related genes of a membranous-based barnacle as revealed from next-generation sequencing technology.</a> Biofouling. 30 (2), 169-181 (2014).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te verklaren.

De cultuur van de rankpootkreeften bij Tjärnö Marine Research Laboratory (Zweden) meer dan 20 jaar heeft gelopen en is gebruikt voor studies in vele verschillende onderzoeksgebieden. Meer dan 30 wetenschappelijke papers verschenen die het kweken systeem hebben gebruikt tijdens de afgelopen jaren, met inbegrip van studies in antifouling13,22, hydrodynamica23, chemische ecologie24, klimaatverandering16 , evolutionaire biologie5en moleculaire biologie2.
Om te voorkomen dat de selectie van bepaalde personen die meer aangepast zijn aan de labo-omgeving (personen die niet representatief voor de wilde populatie zijn mogelijk), is het aanbevolen om het verzamelen van een nieuwe broodstock uit het veld elk jaar. Bovendien, is het ook verstandig om te verjongen de cultuur jaarlijks, aangezien er ongeveer 50-80% van de sterfte bij volwassenen tijdens een normaal jaar. Echter als het doel is voor de productie van ingeteeldestammen of het opzetten van studies van experimentele evolutie, moeten alleen laboratorium-gefokt gezinnen worden gebruikt.
Een goed moment om het verzamelen van B. improvisus op panelen bij de Tjärnö Marine Research Laboratory is in juni – augustus omdat op dat moment er een goed aanbod van cyprid larven in de zee is. De panelen wekelijks te zien wanneer de rankpootkreeften nederzetting wordt gestart en handmatig verwijderen van andere soorten dan B. improvisus (b.v., mosselen, manteldieren, bryozoans, hydroïden, nemerteans/tubeworms en andere barnacle soorten) geregeld te controleren van de panelen (bijvoorbeeldmet een tandenborstel). Rond Tjärnö zijn er drie ondiep water rankpootkreeften soorten aanwezig (B. improvisus, Semibalanus balanoidesen Balanus crenatus). B. improvisus is echter de dominante fouler van gladde harde oppervlakken in juli-augustus. S. balanoides heeft de afrekeningstermijn in het vroege voorjaar en geeft de voorkeur aan hoofdzakelijk natuurlijke ondergronden (b.v., stenen). B. crenatus kan optreden bij lage aantallen op de panelen in de zomer.
Het is ook mogelijk om te starten nieuwe volwassen rankpootkreeften generaties van gekweekte cyprids, die zou zijn essentieel als bepaalde linages met specifieke kenmerken zijn vastgesteld, of in studies van experimentele ontwikkeling. De meest handige manier om te beginnen van nieuwe generaties van volwassenen is te vestigen cyprids op kunststof panelen in het laboratorium. Deze panelen met nieuw gevestigde cyprids kunnen ook worden gebruikt in experimentele behandelingen of voor blootstelling in het veld. In noodgevallen, kan men ook volwassenen gebruiken op keien uit een nabijgelegen site (bijvoorbeeldIdefjorden in het geval van het Tjärnö Marine Research Laboratory) waar B. improvisus gemeenschappelijk is. Deze reeds gevestigde volwassenen worden behandeld op dezelfde wijze als de volwassenen op de panelen, aldus gelegd in bakjes en gevoed via het flow-through systeem. Stroom cellen kunnen ook worden gebruikt om de panelen met zeepokken25. Dit zijn de doorstroom kamers met plankton net aan de zijkanten waarop de cyprids niet, met panelen als de enige nederzetting oppervlak voor de larven regelen doen.
Er zijn verschillende stappen die essentieel zijn voor het opzetten van een goed functionerende rankpootkreeften langetermijnkweek met inbegrip van alle levensfasen. De gebruikte methoden voor cultuur B. improvisus zijn waarschijnlijk voor een groot deel, ook van toepassing op de andere mariene ongewervelden met vrijzwemmende, planktotrophic larven. Kweken procedures voor sommige soorten al goed zijn beschreven (bijvoorbeeldvoor blauwe mosselen en verschillende soorten oesters)26, terwijl voor andere mariene ongewervelden, er zijn slechts een paar voorbeelden van lange termijn culturen verspreid over hun hele leven cyclus. Een van de eerste succesvolle pogingen om cultuur zeepokken (B. amphitrite) werd gedaan door Rittschof et al. 15. op de lange termijn financiële en persoonlijke middelen moeten zijn alvorens een barnacle culturing faciliteit opzetten. Het onderhoud van dit soort jaar-rond rankpootkreeften cultuur vereist ten minste één persoon half-arbeidstijd. Er kunnen enkele mogelijkheden voor de toekomstige automatisering van enkele stappen in de productielijn, vooral het kweken van microalgen27. Daarnaast, om te slagen, is het essentieel toegang hebben tot grote hoeveelheden hoogwaardige zeewater. Het kweken van microalgen, Artemia, en zeepokken gaat niet om een bepaalde veiligheidsprocedures. Nochtans, tests van sommige antifouling stoffen of giftige chemicaliën moeten speciale voorzorgsmaatregelen.
De panelen werden meerdere malen per week voor verontreinigingen gecontroleerd. Het zeewater in de cultuur gebruikt werd opgepompt uit een diepte van 40 m in de Koster Fjord buiten het Tjärnö Marine Research Laboratory en twee zandfilters alvorens het watersysteem lab was gepasseerd. Als geen filtering van het water had gedaan, zou er veel meer verontreiniging in de cultuur. Het is essentieel om het regelmatig schoonmaken van de panelen in de cultuur van detritus en andere ongewervelde dieren die gaan van het systeem via de levering van zeewater vanuit het veld (bijvoorbeeldstolonen-gebouw hydroïden en roofzuchtige nemerteans). Bijvoorbeeld, als geen larven worden geproduceerd, ondanks het feit dat de cultuur goed gevoed en anders is lijkt te zijn in goede staat, het probleem zou de aanwezigheid van nemerteans die worden weergegeven voor de remming van de paring. Natuurlijk, veel van de besmettende organismen in de cultuur in het Tjärnö Marine Research Laboratory waren specifiek voor de Zweedse westkust, en andere soorten verontreinigende organismen zullen overwegend en meer een uitdaging in andere geografische gebieden. Aan de westkust van Zweden is het ongebruikelijk om te vinden van verontreiniging door andere barnacle soorten op de panelen. Af en toe, is gebleken dat de oprichting van S. balanoides , maar dit is een zeer marginaal probleem (hooguit één S. balanoides verontreinigingen voor 10.000 B. improvisus monsters). Het ontbreken van contaminerende soorten was waarschijnlijk afhankelijk van het regime om nieuwe culturen in de zomer, wanneer larvaefrom B. improvisus waren zeer dominante. Daarnaast was er ook een duidelijke verrijking van B. improvisus op de panelen aangezien deze soort selectieve voor gladde oppervlakken13.
Het is essentieel om te verwijderen dode volwassen zeepokken. Als de lege hulzen op de panelen zitten, kunnen ze een schuilplaats voor Artemia naupliën en verschillende contaminerende diersoorten. Daarnaast is het geconstateerd dat dode individuen invloed hebben op het welzijn van de individuen, waarschijnlijk met de release van toxische verbindingen tijdens de decompositie naburige. Een extra gevolg van volwassen sterfte is dat sommige individuen wordt overgelaten alleen en ver van alle andere volwassenen toe paring (hoewel zeepokken de langste penis in de dierenwereld ten opzichte van de grootte)28. Deze individuen zullen overleven, maar zijn niet-productieve voor de larven. Echter deze eenzame volwassen individuen kunnen voorzichtig worden verwijderd zonder afbreuk te doen aan de base-plaat en horizontaal worden geplaatst dicht bij anderen om de paring. Zeepokken kunnen ook worden gedekt door het plaatsen van panelen met één volwassene op elk, maar dicht genoeg zodat kruisbestuiving kan plaatsvinden. Op deze manier kunnen genetische lijnen geproduceerde14.
Het is essentieel om een feed van hoge kwaliteit te produceren en te voeden culturen bijna elke dag. Zelfs een paar dagen zonder voedsel kunnen resulteren in een dalende release van larven. Eerdere tests van dieet samenstelling hebben aangetoond dat diatomeeën essentieel voor de groei en de overleving van de rankpootkreeften naupliën zijn. Verschillende Diatomee soorten lijken voldoende als voeden, hoewel kleine of eenzame cellen (minder dan 10 µm in diameter) nodig voor de naupliën van inname zijn kunnen. De soorten T. pseudonana , S. marinoien C. simplexgebleken al voldoende voer voor B. improvisus naupliën, alsmede gemakkelijk te cultiveren. Daarnaast is de feed kwaliteit is over het algemeen hoger voor exponentieel groeiende algen. Men heeft ook gerapporteerd dat diatomeeën essentieel zijn voor de totstandbrenging van productieve culturen van B. amphitrite15. Een theorie van het belang van diatomeeën is dat ze een uniek vetzuur profiel en bijzonder rijk aan het 20:5 zeer meervoudig onverzadigde vetzuur29 zijn. Het is aangetoond dat bepaalde vetzuren zijn belangrijk voor de succesvolle ontwikkeling van oester larven30.
Door de jaren heen, zijn er geen gevallen van schadelijke ziekten in de cultuur van de rankpootkreeften. In veel commerciële ongewervelde waterculturen, zoals oesters en mosselen, ziekten vrij gemeenschappelijk zijn en zeer schadelijk kunnen zijn. Nadelige effecten van virussen zijn ook gemeld uit wilde populaties. De inheemse oester in Frankrijk werd in 1925 vervangen door de Portugese oester Crassostrea angulata , maar deze soort werd weggevaagd door een iridovirus rond 197031. Meer recentelijk zijn er massale sterfte gebeurtenissen in de oester Crassostrea gigas in culturen wereldwijd, die lijkt te worden geassocieerd met de ostreid herpesvirus 132. Geen verslagen over ziekteverwekkers, bacteriën of virussen op zeepokken hebben tot nu toe verschenen. Echter, in de lopende-genoomproject op B. improvisus, virus sequenties bleken (Alm Rosenblad et al., niet-gepubliceerde gegevens), maar met geen zichtbare link naar symptomen van ziekten. Mengsels van antibiotica zijn eerder toegepast op de culturen om te minimaliseren van het risico van bacteriële infecties; echter, deze procedure is momenteel verlaten en tot nu toe, dit heeft niet geleid tot besmetting problemen.
Als zeewater wordt verwarmd (zoals hierboven beschreven), oververhitting mogelijk de ernstigste risico in de productielijn van cultuur. Het is natuurlijk moeilijk te beschermen tegen oververhitting, hoewel sensoren en passende waarschuwingssystemen gebruikte (b.v., e-mail of SMS-berichten verzenden naar verantwoordelijke personen) mogelijk. Weerslag van deze soort in het verleden hebben geresulteerd in het aanzienlijke doden van volwassenen in de cultuur. Dit kan, natuurlijk rampzalig zijn en ruïneren van investeringen op lange termijn van tijd en geld. Dit zou in het bijzonder rampzalig als genetische ingeteeldestammen zijn vastgesteld. Om te zorgen voor de levensduur van deze lijnen en hen veilig uit accidentele verlies, zou het wenselijk zijn om een cryopreservatie methodologie voor zeepokken te ontwikkelen. Er werd gemeld dat de larven van de oester kunnen worden bevroren neer en nieuw leven met gedeeltelijk succes33 ingeblazen. Cryobanking is ook een waardevol instrument voor het behoud van de genetische hulpbronnen van een breed scala van soorten34. Zelfs naupliën van B. amphitrite worden gemeld om te overleven bevriezing35, en het werd gevonden dat 20% van de bevroren-down individuen succesvol in cyprids36 gemetamorfoseerde. Toepassing van de bevriezing voor de houdbaarheid op lange termijn van culturen is tot nu toe niet goedgekeurd, maar dit inderdaad nodig zou zijn voor het onderhoud van de geselecteerde lijnen; Dit zou een essentiële stap om stevig B. improvisus in een krachtige mariene modelsystem.
Hier werd een protocol voor de dissectie van verschillende weefsels van volwassenen van B. improvisus (d.w.z., cirri, soma en mantel) uitgereikt. Echter op gewezen dat er ook andere weefsels kunnen worden geëxtraheerd. Bijvoorbeeld, is de weke delen tussen de buitenkant en interne mantel membraanachtig-base soorten Tetraclita japonica formosana goed geïsoleerd en gebruikt voor een RNA extractie en analyse van de RNA-seq van gen expressie37. Het overzicht geoptimaliseerd extractie protocol beschreven hier biedt voldoende hoeveelheden van hoogwaardige RNA voor het rangschikken van een minimale hoeveelheid grondstof. Eerst, de collectie van individuele larven direct in de homogenisering buizen minimaliseert enig verlies bij de overdracht van een buis naar de andere. Bovendien onder de verschillende methoden getest, de homogenisering met keramische kralen bleek te zijn het meest efficiënt in termen van RNA opleveren en integriteit, in vergelijking met ultrasoonapparaat of stamper homogenisering. Bij de planning voor de genexpressie of genomics experimenten, moet men in gedachten te houden de uitdaging van de hoge genetische variatie in zeepokken, ten minste voor B. improvisus. Rankpootkreeften heeft een genetische diversiteit in het assortiment 3 – 5%, zelfs in de codering van de regio's (Alm Rosenblad et al., niet-gepubliceerde gegevens). Dit, natuurlijk, brengt specifieke eisen op het ontwerpen van inleidingen voor qPCR analyse, waar meer geconserveerd regio's moeten worden opgespoord en worden gebruikt als sjablonen voor inleidingen om consistente expressie resultaten betweenbatches. Geconserveerde gebieden voor doelgenen, zoals Zweden en Na +/ K + ATPasen, kan worden geïdentificeerd door het bestuderen van de variabiliteit van de volgorde van deze genen bij RNA-seq gegevens verkregen uit populaties van cyprids met honderden personen. Voor een analyse van het genoom, zal DNA worden bemonsterd. Echter, het verkrijgen van kwalitatief hoogwaardige DNA van B. improvisus kan lastig21.
Kortom, is de gevestigde rankpootkreeften cultuur instrumentaal in verschillende soorten experimentele studies gebleken. In het bijzonder de larvale productie jaar-rondom stelt ons in staat om uit te voeren van de experimenten zonder wordt beperkt tot de natuurlijk voorkomende kuit periode (voor B. improvisus, dit is in de zomer). Verkregen larven kunnen worden gebruikt voor het uitvoeren van een brede reeks van experimentele studies, met inbegrip van de nederzetting testen, testen van gedrag, expressie studies over specifieke genen, evenals genoom-brede transcriptome studies.

Zeepokken zijn mariene kreeftachtigen met een sessiele volwassene en vrijzwemmende, planktonische larven. Allermeest naar de 1200 soorten zeepokken bewonen ondiep water en velen zijn vaak blootgesteld aan lage zoutgehalte. Één soort, de baai rankpootkreeften Balanus (Amphibalanus) improviseert (B. improvisus), kan bijna zoetwater tolereren en Charles Darwin dit soort uit een klein riviertje in het estuarium van Rio de la Plata in Uruguay1beschreven. Het zoutgehalte van de tolow extreme tolerantie maakt B. improvisus een bijzonder relevant model voor de studies van osmoregulatory mechanismen2,3. Deze rankpootkreeften verkiest brak voorwaarden maar is in staat van het leven in wateren met Zoutgehaltes van ongeveer 1.6 psu tot maar liefst 40 psu4. Het is de enige rankpootkreeften soort gevonden in de Brakke Oostzee. B. improvisus wordt verondersteld te zijn afkomstig uit de kust van het oosten van het Amerikaanse continent, maar vandaag is wereldwijd gevonden als gevolg van de versnippering door verzending van5. Het is een grote aangroei organisme wordt vaak gevonden op rotsen, steigers en boot vletten en daarom van algemeen belang voor het begrijpen van de mechanismen van antifouling op constructies in mariene en brakke wateren6,7.
B. improvisus -is vergelijkbaar met de meeste andere zeepokken, hermafrodiete met kruisbestuiving; Voortplanting gebeurt door de paring tussen naburige individuen met behulp van een verlengde penis en interne bevruchting. De reproductieve periode is voornamelijk van mei tot September. B. improvisus heeft zeven pelagische larvale stadia (zes naupliën gevolgd door een cyprid stadium8). De luiken van de bevruchte eicel in een nauplius larve die is vrijzwemmende en feeds in de waterkolom voor tot enkele weken vóór de Rui in een niet-voeding cyprid larve. De cyprid gebruikt meerdere aanwijzingen te vinden van een geschikte plaats om af te wikkelen en dan ondergaat metamorfose in een sessiele jonge rankpootkreeften9. De soorten kunnen worden gekweekt in het laboratorium en heeft een levensduur van 1 – 2 jaar in de zee (2 – 3 jaar in de laboratoriumcultuur). Gemiddeld, B. improvisus groeit tot 10 mm in doorsnede (met een maximum van ongeveer 20 mm) en bereikt een maximale hoogte van ongeveer 6 mm (hoewel het groter drukke omstandigheden groeien kan). De soort kan worden geïdentificeerd door zijn gladde kalkhoudende ook shell (wit of grijsachtig), de radiaal patroon kalkhoudende base van de shell-plaat en de vorm van de tergal platen1,10.
De rankpootkreeften B. improvisus heeft een aantal voordelige functies als een model voor studies van osmoregulatie, met een focus op moleculaire en fysiologische mechanismen, evenals de ecologische interacties en de evolutionaire gevolgen. Het wordt ook op grote schaal gebruikt als een model voor het onderzoek van de afwikkeling van de biologie, met name met betrekking tot onderzoek van de antifouling en de mechanismen betrokken7,11,12,13. Echter levert natuurlijke seizoensgebonden kuitschieten een onvoorspelbare aanbod van cyprid larven voor studies. De mogelijkheid om gedurende het hele jaar cultuur van deze rankpootkreeften door zijn hele levenscyclus is daarom een belangrijke troef om verschillende soorten moleculaire en mechanistische studies. Haar aanwezigheid in marine/brakke wateren wereldwijd voorziet bovendien in een combinatie van veld en experimentele studies. Gecontroleerde fokkerij kan ook produceren families van bekende stambomen voor lange termijn kweken14, en een tijd voor het genereren van een paar maanden kunnen op lange termijn experimentele evolutie. Er is ook een ontwerp-genoom en verschillende transcriptomes beschikbaar, en deze middelen zijn gebruikt voor het klonen van meerdere genen (bijvoorbeeld, genen van belang in osmoregulatie)2,3.
Het doel van dit protocol is te beschrijven hoe te stellen en onderhouden een cultuur van de rankpootkreeften B. improvisus gedurende het hele jaar teneinde gen expressie studies uitvoeren op volwassenen of larven van dit organisme. Rittschof et al. 15 in het kort beschreven een methode voor het kweken van zeepokken vanaf de release van naupliën aan de afhandeling van cyprids voor de soorten Balanus amphitrite. Het protocol is aangepast voor het hele jaar door kweken van B. improvisus bij Tjärnö Marine Research Laboratory (Zweden), en een gedetailleerde beschrijving van alle stappen in de productielijn is uiteengezet, met inbegrip van de productie en het grootbrengen van de rankpootkreeften larven, alsmede het beheer van diervoeders voor volwassenen en larven. Voor een overzicht van de volledige procedure, Zie Figuur 1. Het gebruik van het kweken systeem is geïllustreerd met enkele gemeenschappelijke experimentele opstellingen en geïllustreerd in functionele genomica studies van nb++ ATPase /K en Zweden, ophelderen van hun mogelijke functies in osmoregulatie2, 3. Soms is het essentieel om te onderzoeken van de genexpressie in specifieke weefsels, en enkele van de basisprincipes van rankpootkreeften dissectie zullen worden gedekt. Met een goed aanbod van kwalitatief hoogwaardige zeewater, moet het kweken van de rankpootkreeften B. improvisus, en mogelijk vele andere soorten, mogelijk in mariene laboratoria over de hele wereld.

<table><tbody><tr><td>Plexiglas (poly-methyl methacrylate) panelen</td><td>Kunststof producten, Bromma, Zweden</td><td></td><td>transparant glas</td></tr><tr><td>1.5 L PET-fles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Artemia</td><td>INVE Aquaculture, België</td><td></td><td>We hebben verschillende bedrijven getest; dit is echt de beste</td></tr><tr><td>Skeletonema marinoi (CCAP-stam 1077/5)</td><td>CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Schotland&nbsp;</td><td>stam 1077/5</td><td></td></tr><tr><td>Chaetoceros simplex var. gracilis (CCAP-stam 1085/3)</td><td>CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Schotland&nbsp;</td><td>stam 1085/3</td><td></td></tr><tr><td>Millipore cartridge filtersysteem</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cartridge met een nominale poriëngrootte van 0.2 &micro;m</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>cartridge CWSS01S03</td><td>Hoge capaciteit voor grote volumes</td></tr><tr><td>polycarbonaat fles</td><td>Nalgene</td><td></td><td>autoklaveerbaar</td></tr><tr><td>RNA later</td><td>Qiagen</td><td>76106</td><td>&nbsp;Fixeeroplossing om RNA te bewaren</td></tr><tr><td>TURBO DNA-vrij Kit</td><td>Invitrogen/Thermofisher Scientific&nbsp;&nbsp;</td><td>AM1907</td><td>DNAse kit om DNA uit bereide RNA te verwijderen</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthese Kit</td><td>Biorad</td><td>1708890</td><td>cDNA synthese kit</td></tr><tr><td>SYBR Green supermix</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td>Kleurstof voor QPCR</td></tr><tr><td>RNeasy minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>RNA-extractie van volwassenen of veel cyprids</td></tr><tr><td>Zacht weefsel homogeniserende CK 14, 2 ml buisjes</td><td>Precellys</td><td>KT03961-1-003.2</td><td>Keramische kralen voor homogenisatie</td></tr><tr><td>RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>RNA-extractie van enkele cyprids</td></tr></tbody></table>

de rankpootkreeften balanus improvisus als een marine model - kweken en genexpressie

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Zeepokken zijn mariene kreeftachtigen met een sessiele volwassene en vrijzwemmende, planktonische larven. De rankpootkreeften Balanus (Amphibalanus) improvisus is met name relevant als een model voor de studies van osmoregulatory mechanismen vanwege zijn extreme tolerantie te laag zoutgehalte. Het wordt ook op grote schaal gebruikt als een model voor de afwikkeling van de biologie, met name in verband met antifouling onderzoek. Echter levert natuurlijke seizoensgebonden kuitschieten een onvoorspelbare aanbod van cyprid larven voor studies. Een protocol voor het hele jaar door kweken van B. improvisus heeft ontwikkeld en een gedetailleerde beschrijving van alle in de productielijn stappen wordt beschreven (dat wil zeggen, de oprichting van volwassen culturen op panelen, de collectie en het grootbrengen van Rankpootkreeften larven en het beheer van diervoeders voor volwassenen en larven). De beschrijving ook geeft advies over het oplossen van problemen en bespreekt kritische parameters (bijvoorbeeld, de verwijdering van verontreiniging, de productie van hoogwaardige diervoeders, de mankracht nodig en het belang van kwalitatief hoogwaardige zeewater). Elke batch van het kweken systeem maximaal levert ongeveer 12.000 Nauplia en vier partijen kan leveren in een week, dus tot bijna 50.000 larven per week kan worden geproduceerd. De methode gebruikt om cultuur B. improvisus is, waarschijnlijk voor een groot deel ook van toepassing op de andere mariene ongewervelden met vrije-swimminglarvae. Protocollen worden uitgereikt aan de dissectie van verschillende weefsels van volwassenen, alsmede de productie van kwalitatief hoogwaardige RNA voor onderzoek naar genexpressie. Het is ook beschreven hoe gekweekte volwassenen en gefokte cyprids kan worden gebruikt in een breed scala aan experimentele designs voor de behandeling van genexpressie in verband met externe factoren. Het gebruik van gekweekte zeepokken in genexpressie is geïllustreerd met studies van mogelijke osmoregulatory rollen van nb++ ATPase /K en Zweden.

Met de beschreven procedure voor het kweken van volwassen zeepokken van B. improvisus, maximaal vier partijen nauplius kunnen larven geproduceerd worden per week. Het zou mogelijk zijn voor het verzamelen van nauplius-larven bijna elke nacht, maar dit vereist meer mensen en infrastructuur (met vele zeepokken in de broodstock, een cultuur zal vrijgeven larven voortdurend). Een extra beperkende factor voor de productie van larven lijkt te zijn van de beschikbaarheid van diervoeders van hoge kwaliteit, met name met betrekking tot de Diatomee Skeletonema. Maximaal, bestaat elke batch van het kweken systeem uit ongeveer 12.000 naupliën, dus tot 50.000 naupliën per week kan worden gekweekt. Nochtans, enkele weken kunnen er tot tienvoudige minder larven geproduceerd. Een enkele volwassene kan produceren tot 7.000 larven per dag14, hetgeen betekent dat 1-2 volwassenen zijn het vrijgeven van larven voor elke partij. Binnen een week zal ongeveer 70-90% van de verzamelde naupliën uitgroeien tot cyprids (opbrengst ongeveer 30.000 cyprids per week, maximaal) die kunnen worden gebruikt voor het testen van de nederzetting en moleculaire studies.
Het moet worden benadrukt dat er bestaan verschillen in cyprid functies tussen partijen, en in het algemeen, er zijn grotere variaties tussen partijen dan in batches. Bijvoorbeeld, varieert de beslechting succes in regeling testen tussen 30 en 70% voor verschillende batches instellen. Dit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door de individuele genetische variatie tussen de specifieke paren van volwassenen het vrijgeven van larven perioden verschillende bemonstering. Het is, natuurlijk, aanbevolen dat herhaalde experimenten (biologische wordt gerepliceerd) cyprids van een aantal partijen worden moeten als meer algemene uitspraken over de resultaten worden gemaakt. De variatie charges-legt eisen op de proefopzet, waar de juiste besturingselementen en belangrijk in gen expressie studies moeten worden toegepast. Echter, zelfs na verschillende statistische normalisatie procedures zijn doorgevoerd die aanzienlijk verminderen tussen-batch variatie, sommige effecten van de partij zijn meestal nog steeds herkenbaar (niet-gepubliceerde gegevens).
Na het geleverde protocol, is het mogelijk om te verkrijgen, gemiddeld 500 ng van kwalitatief hoogwaardige RNA uit zo weinig als 20 cyprids, ongeacht de fase van de rankpootkreeften nederzetting (tabel 1). De kwaliteit van het RNA wordt meestal gemeten als de verhouding tussen de pieken van het 18S en 28 (de verwachte positie van de twee bergtoppen zijn aangegeven in Figuur 4). Echter in het geval van zeepokken en vele andere geleedpotigen, de 28 rRNA breekt bij verhitting (als onderdeel van de analysemethode) en samen met de 18S piek20migreert. Dit is de reden waarom er, in beginsel, één enkele rRNA piek in dit type analyse voor zeepokken is. Het is duidelijk uit deze test (Figuur 4) dat een homogenisering door keramische kralen RNA voorziet van de hoogste integriteit en daarom is de methode van keuze. Het RNA volstaat in hoeveelheid en de kwaliteit te genereren van kwalitatief hoogwaardige sequencing bibliotheken voor het rangschikken, wat resulteert in een gemiddelde van 70 miljoen leest per monster (het aantal leest, natuurlijk, afhankelijk van het niveau van de tijdens de sequencing multiplexing). Het bedrag van RNA is ook voldoende voor analyse van de cDNA synthese en qPCR de expressie van een groot aantal genen.
Figuur 5 toont het resultaat van de analyses van de qPCR van Zweden en nb+/K+ ATPase (NAK1) splice varianten, waar expressie veranderingen werden onderzocht in reactie op veranderingen in milieu signalen2,3. Een vergelijking van de relatieve uitdrukking van de lange en korte splice varianten van NAK1 toont een tweeledig verhogen voor de lange NAK1 mRNA in lage zoutgehalte in verband met de korte NAK (Figuur 5A). Dus, uit de gegevens blijkt dat de lange vorm overheersende laag zoutgehalte voorwaarden alternatieve splicing maakt. In het geval van Zweden is het duidelijk dat de twee water-vervoer paralogs AQP1 en AQP2 differentiële expressie (Figuur 5B) weergeven. In het bijzonder in het weefsel van de mantel is het duidelijk dat het AQP1 aanzienlijk naar beneden-geregeld op lagere zoutgehaltes is, die is niet gezien voor AQP2. In plaats daarvan toont AQP2 een licht verhoogd expressie op lagere zoutgehaltes, maar in het soma. Deze resultaten vormen een basis voor onderzoek van de functionele rollen van de verschillende B. improvisus ion vervoerders en Zweden in rankpootkreeften osmoregulatie.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig1.jpg"> Figuur 1 : Overzicht van de gehele procedure en de RNA extractie voor gen expressie studies bij volwassenen culturing. Om te beginnen een nieuwe cultuur, zijn panelen aan een frame gekoppeld en ingezet in de zee op 1-3 m diepte. Na enkele weken, worden de panelen met volwassenen/jonge exemplaren verticaal geplaatst in rekken in bakjes in het laboratorium. Elke lade heeft ongeveer 40 panelen met volwassenen. Met ongeveer 100 volwassenen per paneel, in totale ≈ zijn 4.000 volwassen individuen gekweekte per lade. De volwassen zeepokken worden gevoed met Artemia en houdbaar jaar-rond. Nauplius-larven zijn verzamelde meerdere malen per week van de laden via een filtering door een zeef. De verzamelde naupliën worden overgebracht naar de emmers gehouden bij 26 ° C in een waterbad en gevoerd met microalgen. Naupliën worden gehouden totdat ze in niet-voeding cyprids, die worden verzameld molt door te filteren. Nieuwe panelen in het laboratorium kunnen worden vastgesteld door de bepaling van de cyprids op panelen, ofwel om nieuwe panelen voor het jaar-rond cultuur of om te worden gebruikt voor specifieke experimentele opstellingen met gewijzigde externe omstandigheden. RNA wordt vervolgens gewonnen uit jongeren/volwassenen aan het einde van het experiment of op specifieke tijdstippen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig2.jpg"> Figuur 2 : Beelden van enkele belangrijke stappen in de procedure voor kweken. (A) deze afbeelding ziet u de frames met panelen voor het verzamelen van nieuwe bevolkingsgroepen uit het veld. (B) dit beeld toont de panelen met volwassen zeepokken van B. improvisus in rekken die in lade worden geplaatst. De panelen zijn ongeveer 2 cm uit elkaar geplaatst. (C) dit beeld toont de schaaltjes met de rankpootkreeften panelen en de voeding tank naar links. Vanuit elke lade is er een outlet waar de zeven zijn geplaatst voor het verzamelen van nauplius-larven. (D) dit beeld toont dat de productie van Artemia feed voor de volwassen zeepokken. (E) dit beeld toont het fokken van naupliën in emmers geplaatst in een waterbad ingesteld op 26 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig3.jpg"> Figuur 3 : Beschrijving van de stappen van de initiële dissectie van volwassen zeepokken: het verwijderen van het lichaam uit zijn schelp. (A) pak een van de operculaire platen door het invoegen van pincet voorzichtig door het diafragma. Trek voorzichtig het blootstellen van het dier te verwijderen de plaat. (B) Trek het dier door het soma deel net onder de cirri grijpen. (C) dit paneel toont de algemene anatomie van acorn zeepokken. De mantel en potentieel bevruchte eieren (in de eierstok) verblijven in de holte van de shell, wanneer het lichaam wordt teruggetrokken. Een opmerking over de anatomie van de rankpootkreeften (Zie voor een meer diepgaande account, Anderson)9: de platen van de muur van een barnacle helling naar binnen, en samen vormen ze een kegel van vulkaan-achtige. Een opening, het diafragma, wordt bedekt door de twee operculaire platen, die vormen een deur of operculum, te sluiten het diafragma. Acorn zeepokken hebben over het algemeen een kalkhoudende basale plaat die stevig is vastgelijmd aan de ondergrond; echter een aantal soorten zeepokken gebrek aan deze kalkhoudende plaat (b.v. S. balanoides). Zeepokken afscheiden het exoskelet van de darkly gepigmenteerde mantel (het kopborststuk). Het buitenoppervlak van de dubbellaagse mantel is verkalkt om stijf, terwijl de binnenzijde van de mantel niet verkalkt is en daarom flexibel is. Binnen het diafragma zijn de cirri aanwezig in een teruggetrokken positie. Dit zijn de thoracale aanhangsels die zeepokken voor het voederen van de schorsing gebruiken. De eierstokken liggen vlakbij de voet van de rankpootkreeften, terwijl de teelballen in het soma liggen. Dit cijfer is vastgesteld van Panova et al. 21 en is gepubliceerd met toestemming van Springer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig4.jpg"> Figuur 4 : Bepaling van de integriteit van het rRNA door capillaire gelelektroforese. RNA werd voorbereid door twee verschillende homogenisering methoden: (A) ultrasoonapparaat en (B) keramische kralen. De eenheid op de y-as, FU, staat voor fluorescentie eenheden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig5.jpg"> Figuur 5 : Genexpressie voortvloeit uit twee verschillende studies van genen belangrijk voor osmoregulatie in B. improvisus. (A) dit paneel toont de differentiële expressie zoals gemeten door de qPCR van splice varianten van de nb+/K+ ATPase NAK1 reactie op verschillende zoutgehaltes en pCO2 3niveaus. Bij de behandeling van lage zoutgehalte, de uitdrukking van de lange isovorm (NAK1-L) is toegenomen ten opzichte van de korte (ANOVA, P < 0,001). (B) dit paneel toont de uitdrukking van Zweden bij volwassenen van B. improvisus tijdens hun blootstelling aan verschillende zoutgehaltes2. qPCR werd gebruikt om te bepalen van de aquaporin expressie niveaus ten opzichte van actine. Volwassen individuen werden bij 3 verschillende zoutgehaltes (3, 20 en 33 PSU) gedurende 14 dagen geïncubeerd. Voor de bereiding van RNA, werden de soma cirri en de mantel van de volwassenen gescheiden. Foutbalken geven in beide figuren, de standaarddeviatie. De ** en *** aangeven van het niveau van belang (ANOVA), 0.01 en 0.001, respectievelijk. Deze cijfers zijn gewijzigd van Lind et al. 2 , 3. beide cijfers zijn gepubliceerd met toestemming van PLoS ONE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Regeling fase</td>
			<td>Totale hoeveelheid RNA (ng)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gratis zwemmen</td>
			<td>512</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exploratie: Nauwe zoeken</td>
			<td>518</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aangesloten cyprid</td>
			<td>550</td>
		</tr>
<tr>
<td>Nieuw gemetamorfoseerde jonge</td>
			<td>832</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: opbrengsten van RNA. Deze tabel bevat het aantal van de RNA geëxtraheerd met een RNA voorbereiding kit uit pools van 20 cyprid personen verzameld in verschillende stadia tijdens het proces voor een regeling.

De rankpootkreeften improvisus Balanus (Amphibalanus) is een model voor het bestuderen van osmoregulatie en antifouling. Echter levert natuurlijke seizoensgebonden kuitschieten een onvoorspelbare aanbod van cyprid larven. Hier, wordt een protocol voor het hele jaar door kweken van B. improvisus beschreven, met inbegrip van de productie van larven. Het gebruik van gekweekte zeepokken gen expressie studies wordt geïllustreerd.

De rankpootkreeften Balanus improvisus als een Marine Model - kweken en genexpressie

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

De kweekfaciliteit kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen binnen de larvale ecologie, biofouling en evolutionaire biologie. Meer specifiek, het kan worden gebruikt in studies over receptor-ligand-interacties tijdens larvale vestiging, ontwikkeling van nieuwe antifoulingtechnologieën en de evolutie en functie van genen die betrokken zijn bij osmoregulatie. Het grote voordeel van deze modelorganisme is dat de zeepokken Balanus improvisus robuust is, zich het hele jaar door voortplant en een relatief korte generatietijd heeft.Hoewel deze methode inzicht kan geven in het kweken van zeepokken, kan het ook worden toegepast op het kweken van andere mariene organismen. Over het algemeen zullen personen die nieuw zijn met deze methode worstelen vanwege het grote aantal details dat belangrijk is voor succes, zoals de aanvoer van goed zeewater, robuuste productie van hoogwaardig voer en een constante aandacht voor het schoonmaken en voeren van de culturen. Het demonstreren van de procedure zullen Martin Ogemark en Anna-Lisa Wrange zijn, technici en onderzoekers die met zeepokken werken.Om te beginnen, stel frames op die meerdere transparante thermoplastische panelen kunnen vasthouden. Boor twee gaten in de bovenhoeken van elk paneel en gebruik kabelbinders om de panelen aan de frames te bevestigen. Om volwassen zeepokken te verzamelen, zet de panelen verticaal uit op een diepte van één tot drie meter in kalm water.Nadat de zeepokken zich hebben gevestigd en zijn uitgegroeid tot een diameter van vijf millimeter, brengt u de panelen naar het laboratorium. Plaats vervolgens de panelen verticaal in een standaard met gemalen groeven in een polyethyleenlade. Plak eerst met niet-toxisch, waterafstotend plakband vijf panelen samen om een kubus te vormen die aan de bovenkant open is.Plaats de kubus in een kleine bak en vul deze met zeewater. Voeg vervolgens ongeveer 200 cyprids toe aan de bovenkant van de kubus. Voer de juveniele zeepokken om de dag met 100 milliliter Skeletonema marinoi.Na twee tot drie weken zouden de panelen van de kubus gevestigde juvenielen moeten bevatten die minimaal vijf millimeter in diameter zijn. Haal de kubus uit elkaar en verplaats de panelen naar bakken met doorstromend zeewater. Om Artemia nauplii te oogsten, zet eerst de beluchtingspomp uit en verduister de fles, belicht vervolgens het onderste deel van de fles gedurende 10 minuten.De uitgekomen Artemia nauplii zullen naar het licht zwemmen. De niet-uitgekomen cysten zullen naar de bodem zinken, terwijl cystenschalen naar boven drijven. Open de klem aan de onderkant en verzamel de intermediaire fractie als een dichte populatie van de zwemmende Artemia nauplii.Om de panelen met volwassen zeepokken te reinigen, spuit ze voorzichtig met zoet water en verwijder eventuele verontreiniging met een zachte tandenborstel. Reinig de bakken zonder zeepokken en de buizen met heet zoet water. Plaats vervolgens een zeef in de polyethyleenlade met een overlooppoort.Verzamel de zeepokkenlarven die zich in de zeef nestelen overnacht. Vul vervolgens een emmer met 20 liter gefilterd zeewater en een liter van een diatomeeënmicroalgenmengsel om een dichtheid van 50.000 diatomeeën per milliliter te creëren. Breng de eerder verzamelde zeepokken nauplii over naar een kristalliserende schaal en verlicht de schaal van de zijkant.Gebruik vervolgens een pipet om de nauplii te verzamelen die naar het licht zwemmen en breng ze over naar een andere schaal. Breng de nauplii over naar een beker met één liter gefilterd zeewater om te tellen. Voeg vervolgens één liter nauplii toe aan de eerder voorbereide emmer.Na drie dagen gebruikt u een 90-micrometer zeef om de zeepokken nauplii te verzamelen, reinig vervolgens de emmer, vul deze met gefilterd zeewater en voeg nieuw diatomeeënvoer en de zeepokken nauplii toe. Na nog twee tot drie dagen incubatie, gebruikt u een 320-micrometer zeef bovenop een 160-micrometer zeef om de niet-gemolde zeepokken nauplii te scheiden van de cyprids. Nadat u vier vierliterflessen hebt opgezet voor microalgencultuur, plaatst u de flessen in licht met een intensiteit van 50 tot 100 micromol per vierkante meter.Oogst de culturen wanneer ze voldoende dicht zijn om voor voeding te worden gebruikt. Selecteer eerst grote individuen en houd voedsel twee dagen voorafgaand aan de dissectie terug. Reinig vervolgens de schelpen van de zeepokken met een tandenborstel en spoel ze af met water om besmetting door andere soorten in het milieu te minimaliseren.Plaats een individuele zeepokken op een gelijkmatige oppervlakte voor dissectie, steek vervolgens de punt van een tang tussen de tergale en scutale platen. Pak een plaat vast en trek er zachtjes aan om deze te verwijderen. Gebruik vervolgens een tang om de cirri vast te pakken en trek de zeepokken er recht uit.Plaats de gedissecteerde zeepokken direct in 96% ethanol of RNA-stabiliserende oplossing voor fixatie. Met het hier beschreven protocol kunnen tot vier batches van zeepokken naupliuslarven in één week worden geproduceerd. Maximaal bestaat elke batch uit het kweeksysteem uit ongeveer 12.000 nauplii, wat betekent dat er tot 50.000 nauplii per week kunnen worden gekweekt.Binnen een week zal 70 tot 90%van de verzamelde nauplii zich ontwikkelen tot cyprids, wat ongeveer 30.000 cyprids per week oplevert. Er werd gemiddeld 500 nanogram hoogwaardig RNA verkregen van slechts 20 individuele cyprids, ongeacht de vestigingsfase. In zeepokken breekt 28S rRNA af wanneer het wordt verwarmd.Homogenisatie door keramische kralen biedt RNA de hoogste integriteit en is daarom de voorkeursmethode voor het hanteren van zeepokken en geleedpotige weefsels. Met behulp van qPCR-analyse werd een tweevoudige toename waargenomen voor de lange varianten van NAK1 mRNA en lage zoutgehalten in vergelijking met de korte NAK. Dit gaf aan dat de lange vorm overheerst onder omstandigheden met een laag zoutgehalte.

the-barnacle-balanus-improvisus-as-marine-model-culturing-gene

Research

JoVE Journal

Environment

Milieu

De amphipod Parhyale hawaiensis is een veelbelovend model organisme voor studies van schaaldieren embryologie en vergelijkende geleedpotigen ontwikkeling en evolutie. Dit protocol beschrijft een methode voor het handmatig verwijderen van enkele blastomeren van vroeg decollete stadium embryo's van Parhyale.

Ablatie van een enkele cel van acht-cel embryo&#39;s van Amphipod Crustacean<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Methoden die morphant embryo's zijn essentieel voor ontwikkelingsstoornissen mechanismen en gen-regulatorische netwerken te bestuderen. De zee ster Patiria miniata is een opkomende modelsysteem voor deze studies. Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van gameten, producerende culturen van embryo's, en snelle micro-injectie van zygoten van deze soort.

Een methode voor micro-injectie van Patiria Minata Zygotes

Wij rapporteren hier de robuuste en efficiënte expressie van fluorescerende eiwitten na mRNA injectie in onbevruchte eicellen van Branchiostoma lanceolatum. De ontwikkeling van de micro-injectie techniek in deze basale chordate zal de weg voor vergaande technische innovaties in deze opkomende model systeem, met inbegrip van in vivo beeldvorming en gen-specifieke manipulaties effenen.

Expressie van fluorescerende eiwitten in Branchiostoma lanceolatum Door mRNA Injectie in onbevruchte eicellen

In vivo ruimte-tijdelijke interacties van pathogeen en immuunafweer op het mucosale niveau zijn niet gemakkelijk in beeld te brengen in bestaande gewervelde gastheren. De hier gepresenteerde methode beschrijft een veelzijdig platform om mucosale candidiasis bij levende gewervelden te bestuderen door gebruik te maken van de zwemblaas van de juveniele zebravis als een infectieplaats.

Modelleren candidiasis van de slijmvliezen in larvale zebravis door zwemblaas Injection

Het doel van dit protocol is om gebruikers een reeks methoden te bieden voor de hoogwaardige decapsulatie van Lymnaea stagnalis embryo's en larven ter voorbereiding op gehele berging in situ  hybridisatie, en voor daaropvolgende pre- en post-hybridisatie behandelingen.

Een hele berg<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie Methode voor de slak,<em&gt; Poelslak</em

Hier demonstreren we hoe we regeneratie kunnen induceren en monitoren in de Starlet Zeeanemoon Nematostella vectensis, een model cnidarian anthozoan.  We laten zien hoe we kunnen amputeren en regeneratie categoriseren met behulp van een morfologisch stadiasysteem, en we gebruiken dit systeem om een vereiste voor autofagie in regenererende poliepstructuren te onthullen.

Inducerende Compleet Poliep Regeneration van de aboral Physa van de Starlet Zeeanemoon Nematostella vectensis

Het doel van dit protocol is het genotype van de zeeanemonen Nematostella vectensis tijdens de gastrulatie zonder het embryo op te offeren.

Genotypering van zeeanemonen tijdens de vroege ontwikkeling

Dolioliden, met inbegrip van de soort Dolioletta gegenbauri, zijn kleine gelatineuze mariene zoöplankton van ecologische betekenis gevonden op productieve Subcontinentale plank systemen wereldwijd. De moeilijkheid van het kweken van deze delicate organismen beperkt hun onderzoek. In deze studie beschrijven we de teelt benaderingen voor het verzamelen, fokken en onderhouden van de doliolid Dolioletta gegenbauri.

Teelt van de mariene pelagische Tunicate Dolioletta gegenbauri (uljanin 1884) voor experimentele studies

Het artikel presenteert methoden voor larvale cultuur van de gastropode Crepidula fornicata in een klein-volume laboratoriumschaal systeem en in een ambient-zeewater mesokosmos systeem dat in het veld kan worden ingezet.

Laboratorium- en veldcultuur van larven van de pantoffellimpet, Crepidula fornicata

Deze studie schetst een raamwerk voor het ontwikkelen van een geaggregeerde polymicrobiële biofilmmodel en het optimaliseren van een RNA-extractieprotocol om de Pseudomonas aeruginosa genexpressie te beoordelen die representatief is voor de longomgeving bij cystische fibrose. Toepassingen omvatten het evalueren van antimicrobiële effecten en het bestuderen van alternatieve antibiotica onder omstandigheden die relevant zijn voor cystische fibrose.

Aggregaatbiofilmmodel van cystische fibrose om infectie-relevante genexpressie te bestuderen

Deze studie ontwikkelde een workflow voor het genereren en onderhouden van stabiele mutantlijnen voor de zoetwaterappelslak, Pomacea canaliculata. De protocollen omvatten het verzamelen van zygoten, hun micro-injectie met de CRISPR/Cas9-systeemcomponenten om genoombewerking te induceren, ex ovo-kweek van embryo's en genotypering na gecontroleerde kruisingen.

De gouden appelslak Pomacea canaliculata: Van zygoten tot stabiele mutantlijnen

Leer het kweken van de rankpootkreeft Balanus improvisus voor marien onderzoek naar osmoregulatie en antifouling. Deze methode levert tot 50.000 larven per week op voor genexpressiestudies.

De rankpootkreeften Balanus improvisus als een Marine Model - kweken en genexpressie

Meer video's verkennen