Een combinatorische eencellige aanpak te karakteriseren de moleculaire en Immunophenotypic heterogeniteit van menselijke stamcellen en voorlopercellen populaties

Deze methode kan antwoord geven op belangrijke vragen in de stamcel- en kankervelden, zoals hoe stamcelheterogeniteit eruit ziet en hoe therapie in gevoelige kankercellen kan worden geïsoleerd. Het belangrijkste voordeel van deze studie is dat het technisch robuuste eencellige genexpressieanalyse combineert met vaccinose voor verdere downstream karakterisering van doelsubpopulaties. Hoewel deze methode kan worden gebruikt om de kanker en de stamcel heterogeniteit te onderzoeken, kan het ook inzicht geven in gen priming en afstamming potentieel.

Om te beginnen met het protocol, op een RNA / DNA-vrije bank, bereid voldoende lyse buffer voor 96 putten met 10% extra door het mengen van 390 microliters nuclease gratis water, 17 microliters van 10%NP-40, 2,8 microliters 10 millimolar dNTP, 10 microliter 0,1 molaire DTT, en 5,3 microliter RNAse remmer. Vortex en draai de buis af. Verdeel vervolgens vier microliters lysebuffer naar elke put van een 96-put PCR-plaat en verzegel de platen met plakfolie.

Draai de platen naar beneden om de vloeistof aan de onderkant te verzamelen. Houd de platen maximaal 24 uur in ijs tot de cel sorteert. Zodra de FACS-machine goed is ingesteld, voert u een heranalyse van de doelpopulatie uit door ten minste 100 doelcellen te sorteren in een nieuwe microcentrifugebuis met 100 microliter vlekbuffer.

FACS analyseert de gesorteerde cellen door het gesorteerde monster op te nemen en ervoor te zorgen dat ze in de sorteerpoort terechtkomen. Dan het opzetten van eencellige plaat sorteren door het centreren van de daling in goed A1 in de 96-put plaat. Wanneer het gecentreerd is, sorteer 50 tot 106 micrometer deeltjes in alle putten rond de rand van een lege 96-put plaat om ervoor te zorgen dat alle putten een cel in het midden van elke put te krijgen.

Verwijder de kleeffolie van de platen. Sorteer een enkele cel lin-CD34 plus CD38 minus cellen in 92 van de 96 putten. Activeer indexsoring in de FACS sorteersoftware om het immunofenotypische profiel voor CD45RA, CD49F en CD90 voor elke enkele cel op te slaan.

Sorteer twee putten met respectievelijk 10 en 20 cellen voor lineariteitsregelaars in de PCR-versterking. Putten H1 en H2 worden meestal gebruikt. Houd twee putten zonder cellen als geen sjabloon besturingselementen, meestal putten H3 en H4. Verzegel de platen met een heldere kleeffolie en draai de platen op 300 keer zwaartekracht gedurende een minuut.

Vries de borden vast op droogijs. Bewaar ze dan bij min 80 graden Celsius. Maak omgekeerde transcriptie en specifieke doelversterking mix door het toevoegen van 632,5 microliter van twee keer reactie mix, 101,2 microliters Taq / SuperscriptIII, 151,8 microliter primer mix, en 0,7 microliters spiked in controle RNA.

Vortex de oplossing en draai het naar beneden om de vloeistof te verzamelen aan de onderkant van de buis. Houd het mengsel op ijs totdat het klaar is om te worden toegevoegd aan het monster. Ontdooi vervolgens de lysate platen op ijs.

Voeg 8,75 microliters van de eerder voorbereide reverse transcriptie en specifieke doelversterkingsmix toe aan 92 putten, inclusief de lineariteit en geen sjabloonbesturingselementen. Voeg 8,75 microliter van geen omgekeerde transcriptiecontrolemix toe aan de vier resterende putten. Sluit vervolgens de platen af met een heldere kleeffolie en draai de platen om vloeistof aan de onderkant te verzamelen.

Voer omgekeerde transcriptie en specifieke doelversterking uit door de plaat in een PCR-machine te laten draaien volgens het voorversterkerprogramma. Bereid de test laadplaat door pipetting drie microliters van test laden reagens aan elke put van een 96-put plaat. Voeg drie microliter van elke primer toe aan individuele putten in de laadplaat van de test.

Sluit de plaat af met plakfolie en draai deze naar beneden. Bereid na het draaien van de plaat de verdunningsplaat door acht microliter nucleasevrij water in alle putten van een 96-putplaat te spuiten. Voeg twee microliters van versterkt monster toe aan de verdunningsplaat.

Verzegel de plaat met plakfolie. Meng door de plaat gedurende 10 seconden te laten vallen. Draai dan de plaat naar beneden.

Bereid vervolgens het monsterbeladingsmengsel door zorgvuldig 352 microliter van mastermix te mengen met 35,2 microliter monsterbeladingsreagens. Bereid de monsterlaadplaat door 3,3 microliter laadmix te citeren tot elke put van een 96-putplaat. Voeg 2,7 microliter uit het verdunde monster toe aan elke put van de laadplaat van het monster.

Sluit de plaat af met plakfolie en draai deze naar beneden. Neem een nieuwe 96 bij 96 microfluïde chip. Bereid inhammen door ze te porren met een spuit met een pet op om ervoor te zorgen dat ze kunnen worden verplaatst.

Voeg het volledige volume van de spuiten toe aan elke klep terwijl u de chip naar 45 graden kantelt en de klep ingedrukt houdt. Prime de chip met de IFC-controller. Laad elke testinlaat met 4,25 microliter uit elk van de putten in de testlaadplaat en vermijd bellen.

Als er bellen in de put verschijnen, verwijder ze dan met een pipetpunt. Blijf elke monsterinlaat laden met 4,25 microliter uit elk van de putten in de laadplaat van het monster, het vermijden van bellen en als er bellen verschijnen om ze te verwijderen met een pipetpunt. Laad de chip met de Integrated Fluidics Circuit controller of IFC controller.

Controleer of de chip er gelijkmatig uitziet en of alle kamers geladen zijn. Verwijder stof van het oppervlak van de chip door het aan te raken met tape. Voer ten slotte de chip uit in het multiplex microfluïde genexpressieplatform.

Een heat map van een succesvolle run toont de gelijkmatig verspreide expressie over monsters met een sterk signaal van ongeveer zeven tot 25 CT's. Deze versterkingscurve van spiked in controle RNA controleert dat alle putten duidelijke expressie van rond 10 CT met weinig tot geen variatie hebben, validerend dat de pre-versterking en qPCR reacties voor alle cellen succesvol waren geweest. Principe Component Analyse of PCA die de overeenkomsten tussen celgroepen visualiseert met behulp van dimensiereductie kan nuttig zijn om clusters van moleculair verschillende cellen van elkaar te onderscheiden hier identificeren vier subgroepen.

Als u het immunophenotype van cellen uit verschillende moleculaire clusters wilt identificeren, laadt u het FCS-indexbestand in FlowJo. Open de scripteditor en plak het indexscript en druk op Uitvoeren. Elke cel zal nu in een aparte poort zijn.

Voeg elke cel toe aan de lay-outeditor en kleur ze volgens de moleculair gedefinieerde groepering van SCXV die beschikbaar is in het bestand sample_complete_data.xls. FACS-percelen tonen de expressie van het celoppervlak voor de hematopoietische stamcelmarkers CD90 en CD45RA die kunnen worden gebruikt om onderscheid te maken tussen de clusters en ze te isoleren voor functionele analyse. Na deze procedure kunnen andere technieken zoals RNA-sequencing van nieuw ontdekte subpopulaties of in vitro- en in vivo-experimenten worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals wat moleculair mechanisme deze heterogeniteit veroorzaakt en hoe de subpopulatie functioneel verschilt.

Deze strategie maakte de weg vrij voor onderzoekers om niet alleen heterogeniteit te onderzoeken bij normale en kwaadaardige hematopoiesis, maar kan ook worden gebruikt om de ontdekte subpopulaties prospectief te isoleren om ze verder te bestuderen.