Co-immunoprecipitation Assay met behulp van endogene nucleaire eiwitten uit cellen gekweekt onder hypoxische voorwaarden

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het hypoxische veld, zoals endogene en inheemse interacties tussen transcriptiefactoren en hun transcriptionele coregulators onder hypoxische omstandigheden. Het grote voordeel van deze techniek is dat de hypoxische cellen worden geoogst onder hypoxische omstandigheden en dat de nucleaire fracties worden gebruikt voor de co-immunoprecipitatie. Dit protocol gebruikt menselijke embryonale nier 293A-cellen die zijn gekweekt in vier 10-centimeter schotels.

Zaai drie tot vijf keer 10 tot de zesde cellen per schotel in 10 milliliter Dulbeco's gemodificeerd Eagle's medium aangevuld met 10%FBS, L-glutamine, natriumpyruvaat, penicilline en streptomycine. Kweek de cellen in een 37 graden Celsius 5% koolstofdioxide-incubator. Vierentwintig uur na het zaaien, wanneer de cellen 80 tot 90% confluentie hebben bereikt, plaatst u twee schotels in de hypoxiesubkamer in de handschoenkast van de incubator met 1% zuurstof en 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius gedurende vier uur.

Houd de andere twee schotels bij normboxia. Op de dag voor het oogsten van de hypoxie-behandelde cellen, voorverwarm DPBS naar hypoxische omstandigheden door een onbedekte 100 milliliter experimentele glazen reagentieverpakking gevuld met DPBS in de hypoxiesubkamer te plaatsen gedurende 24 uur. Ongeveer een uur voordat de cellen worden geoogst, plaatst u een ijsbox met ijs in de verwerkingskamer van de handschoenkast, die is geëquilibreerd tot 1% zuurstof en 5% koolstofdioxide.

Breng de fles met de voorverwarmde hypoxische DPBS van de hypoxiesubkamer naar de verwerkingskamer en plaats deze op ijs. Vier uur na de hypoxiebehandeling, brengt u de cellen van de hypoxiesubkamer over naar de verwerkingskamer die is voorverwarmd naar 1% zuurstof en 5% koolstofdioxide. Verwijder het kweekmedium door aspiratie en spoel de cellen eenmaal af met een 10 milliliter pipette, 10 milliliter ijskoud voorverwarmde hypoxische DPBS.

Gebruik een vijf milliliter pipette om 5 milliliter ijskoud voorverwarmde DPBS toe te voegen en los de cellen op door met een celschraper te schrapen. Kantel de celkweekplaat, verzamel de losgemaakte cellen met een 10 milliliter pipette en breng de celsuspensie over in een 15 milliliter conische buis. Houd de buis met cellen op ijs.

Open de deur tussen de verwerkings- en bufferkamers in de handschoenkast, die beide zijn voorverwarmd naar 1% zuurstof en 5% koolstofdioxide. Breng de 15 milliliter conische buizen op ijs die hypoxie-behandelde cellen bevatten van de verwerkingskamer naar de bufferkamer. Open de deur van de bufferkamer en verwijder de cellen volledig uit de handschoenkast.

Pellet zowel de hypoxische cellen als de normoxische cellen door centrifugatie bij 1000 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Voor deze procedure wordt een nucleaire extractiekit gebruikt. Begin met het voorzichtig resuspenderen van elke celpellet in 500 microliter lyseerbuffer NL, aangevuld met 1X proteaseremmercocktail in 0,1 molair DTT door meerdere keren op en neer te pipetteren.

Voeg 25 microliter detergentoplossing NP toe aan de celsuspensie en vortex gedurende 10 seconden op maximale snelheid. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1000 keer 10 g bij vier graden Celsius. Bewaar zowel de supernatant als de nucleaire pellet.

Na het verzamelen en opslaan van de supernatant zoals beschreven in het tekstprotocol, resuspendeert u de pellet-bevattende celkernen in 500 microliter lyseerbuffer NL, aangevuld met 1X proteaseremmercocktail en 0,1 molair DTT door vijf seconden op maximale snelheid te vortexen. Resuspendeer de nucleaire pellet in 50 microliter extractiebuffer NX1, aangevuld met 1X proteaseremmercocktail door de pellet meerdere keren op en neer te pipetteren. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs.

Elke vijf minuten, vortex gedurende 10 seconden op maximale snelheid. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij vier graden Celsius. Verzamel de supernatant en breng deze over in mini dialyseapparaten met een maximaal volume van 100 microliter per eenheid voor ontzouting.

Sluit de mini dialyseapparaten en plaats ze in een drijfmiddel. Plaats het drijfmiddel in een beker met 500 milliliter voorgekoelde dialysebuffer. Wees voorzichtig om direct contact met de huid of inademing van de dialysebuffer te vermijden, omdat deze PMSF bevat.

Incubeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met zacht roeren. Na 30 minuten, verzamelt u de monsters vanuit de hoek van de mini dialyseapparaten en brengt u ze over in nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuizen. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12 duizend keer g bij vier graden Celsius.

Pipet 25 microliter van elke supernatant in een 1,5 microliter centrifugebuis en bewaar bij min 80 graden Celsius. Bereid de eiwit AG sefarosebeads voor die worden gebruikt in de immunopreciptatie. Pipet 50 microlitera beads in elk van de vier 1,5 milliliter microcentrifugebuizen en voeg 500 microliters DPBS buffer per buis toe.

Pellet de beads door centrifugatie. Gooi de supernatant weg en resuspendeer de beads in 100 microliter TBS buffer. Voeg twee microliter muis monoklonaal anti-ARNT antilichaam of muis immunoglobuline G toe dat werd bereid door 0,7 milligram muis IgG op te lossen in 500 microliter TBS buffer.

Neem de microcentrifugebuizen met de beads mee naar een koude ruimte. Plaats ze in een buisrotor en incubeer bij 10 tpm gedurende twee uur. Na twee uur, pellet de beads door centrifugatie en gooi de supernatanten weg.

Verdun 200 microgram van het eerder bereide nucleaire eiwitlysaat in 800 microliter immunoprecipitatiebuffer. Incubeer het lysaat met de antilichaam-gekoppelde beads bij vier graden Celsius gedurende de nacht. Op de volgende dag, pellet de beads door centrifugatie bij 3000 keer g gedurende twee minuten bij vier graden Celsius.

Gooi de supernatant weg. Voeg een milliliter ijskoud TBS met 0,2% NP-40 toe aan elke buis en centrifug