Name: Co-immunoprecipitation Assay met behulp van endogene nucleaire eiwitten uit cellen gekweekt onder hypoxische voorwaarden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Leer co-immunoprecipitatie van endogene nucleaire eiwitten onder hypoxische omstandigheden met HEK293A-cellen. Deze methode onderzoekt eiwit-eiwitinteracties tussen transcriptiefactoren en co-regulatoren.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wij danken Assoc. Prof. Sin Tiong Ong voor het gebruik van het werkstation van hypoxie. Dit werk werd ondersteund door de volgende: Singapore ministerie van onderwijs, MOE 1T1-02/04 en MOE2015-T2-2-087 (naar Y.A.), Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University start-up subsidie M4230003 (P.O.B.), de Zweedse Raad voor onderzoek, de Familie Erling Persson Stichting, de Novo Nordisk Stichting, de Stichting af Jochnick Foundation, de Zweedse vereniging van de Diabetes, de verzekeringsmaatschappij Scandia, het onderzoek naar Diabetes en Wellness Foundation, ligplaats von Kantzow van de Stichting, de Strategische onderzoeksprogramma in Diabetes op Karolinska Institutet, de ERC ERC-2013-AdG-338936-Betalmage, en de Knut en Alice Wallenberg Foundation.

Dit gedeelte van het protocol, die gebruik maakt van menselijke embryonale nier 293A (HEK293A) de cel, s volgt de richtsnoeren van de Commissie van de ethiek van de menselijke onderzoek in Nanyang Technological University, Singapore.
1. de inductie van hypoxie in HEK293A cellen
<ol><li>Bereiden vier 10 cm schotels en zaad 3 – 5 x 106 HEK293A cellen per schotel in 10 mL Dulbecco van Eagle's medium (DMEM, 4.5 g/L glucose bewerkt) aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 110 mg/L natrium pyruvaat, 100 U/mL penicilline en 100 mg / mL streptomycine. Cultuur van de cellen in een 37 ° C, 5% CO2 incubator. Opmerking: Cel zaaien moet worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast (BSC). De oppervlakken van alle materialen worden geplaatst in de BSC moeten worden afgeveegd met 70% ethanol.</li>
	<li>24 h na het zaaien, wanneer de cellen 80 – 90% confluentie gekomen, twee gerechten in gezet de hypoxie-subchamber in de incubator ' glovebox ' (Zie Tabel van materialen) met 1% O2 en 5% CO2 bij 37 ° C, en houd de andere twee gerechten op normoxia (21% O 2, 5% CO2 bij 37 ° C) voor 4 h. één set normoxic en hypoxische cellen te gebruiken om te evalueren van de behandeling van hypoxie door westelijke vlek en gebruik maken van de andere set cellen voor de co-immunoprecipitation experimenten. Opmerking: De zuurstofniveaus kunnen worden ingesteld op 0 – 5%, en de duur van de behandeling van hypoxie kan gevarieerd worden afhankelijk van het celtype en studeren doelstelling.</li>
</ol>2. de hele cel en nucleaire extractie
Opmerking: Zie tabel 1 voor meer informatie over buffers gebruikt in dit protocol.
<ol><li>
Oogst de normoxia cellen.
	<ol>
<li>Verwijderen van de voedingsbodems door aspiratie en spoel de cellen met 10 mL DPBS (PH 7.0-7.2) met behulp van een precisiepipet 10 mL. Opmerking: Raak de enkelgelaagde van de cel met het pipet. Tijdens het wassen, Pipetteer zachtjes de DPBS onderaan de muur van de cel cultuur plaat om te voorkomen dat het verlies van de cel.</li>
		<li>Pipetteer 5 mL ijskoud DPBS in de plaat en de cellen uit het oppervlak van de plaat in ijskoude PBS met een cel schraper Schraap.</li>
		<li>Spoel de celsuspensie in 15 mL conische buizen en houd op ijs.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Het oogsten van de cellen gekweekt hypoxische omstandigheden.
	<ol>
<li>Vooraf equilibreer de DPBS hypoxische voorwaarden door het plaatsen van een ongedekte 100 mL experiment glazen reagens fles gevuld met DPBS in de subchamber van hypoxie (1% O2 en 5% CO2 bij 37 ° C) gedurende 24 uur op voorhand.</li>
		<li>Ongeveer 1 uur vóór het oogsten van de cellen van hypoxie behandeld, plaats een koelbox met ijs in de kamer van de verwerking van de ' glovebox ', die heeft zijn geëquilibreerd 1% O2 en 5% CO2. Overdracht van de fles met de vooraf equilibrated hypoxische DPBS van de subchamber van hypoxie in de zaal van de verwerking en plaats deze op het ijs.</li>
		<li>4 uur na de behandeling van hypoxie, overbrengen in de cellen van de hypoxie-subchamber de verwerking kamer die al vooraf equilibrated 1% O2 en 5% CO2.</li>
		<li>Verwijderen van de voedingsbodems door aspiratie en spoel de cellen zodra met 10 mL Pipetteer ijskoude vooraf zijn geëquilibreerd hypoxische DPBS met een 10 mL.</li>
		<li>Voeg 5 mL ijskoud vooraf zijn geëquilibreerd DPBS met 5 mL Pipetteer en verjagen de cellen door schrapen met een cel schraper.</li>
		<li>Kantelen van de cel cultuur plaat en het verzamelen van de vrijstaande cellen met behulp van een precisiepipet 10 mL. Spoel de celsuspensie in DPBS in 15 mL conische buizen en houd op ijs.</li>
		<li>Open de deur tussen de verwerking en buffer kamers van de ' glovebox ', die beide vooraf equilibrated naar 1% O2 en 5% CO2 zijn. Overdracht van de conische buisjes van 15 mL op ijs met hypoxie behandeld cellen uit de zaal van de verwerking naar de kamer van de buffer. Open de deur van de kamer van de buffer en de cellen volledig te verwijderen uit de ' glovebox '.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zowel de cellen van de normoxic van 2.1 en de hypoxische cellen van 2.2 pellet door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
	<li>
Bereid de hele cel extracten.
	<ol>
<li>Resuspendeer de cel pellets in 500 µL van ijskoude radio immunoprecipitation assay (RIPA) lysis buffer met 50 mM Trisaminomethane Hydrochloride (Tris-HCl) pH 8.0, 150 mM natriumchloride (NaCl), 1% tergitol-type NP-40 (NP-40), 0,5% natrium deoxycholate, en 0,1% natrium dodecyl sulfaat (SDS), aangevuld met 1 x proteaseinhibitor cocktail (Zie Tabel van materialen) waarbij de cel pellets op en neer meerdere malen.</li>
		<li>Breng de cel lysates in nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buizen en houd op ijs voor 30 min met de occasionele vortexing.</li>
		<li>Centrifugeer de cel lysates bij 13.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.</li>
		<li>Het supernatant, aliquoot 50 µL van het supernatant in 1,5 mL microcentrifuge buizen verzamelen en opslaan bij-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Voorbereiden van de nucleaire extracten met behulp van een nucleaire extractie kit (zie tabel van materialen).
	<ol>
<li>Zachtjes resuspendeer de cel pellets in 500 µL van lysis buffer NL aangevuld met 1 x proteaseinhibitor cocktail en 0,1 M dithiothreitol (DTT) waarbij de cel pellets op en neer meerdere malen.</li>
		<li>25 µL van schoonmaakmiddel NP toevoegen aan de celsuspensie en vortex voor 10 s op maximale snelheid.</li>
		<li>Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C.</li>
		<li>Het supernatant (cytoplasmatische extracten), aliquoot 50 µL van het supernatant in 1,5 mL microcentrifuge buizen, verzamelen en opslaan bij-80 ° C.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet met celkernen in 500 µL van lysis buffer NL aangevuld met 1 x proteaseinhibitor cocktail en 0,1 M DTT met vortexing voor 5 s op maximale snelheid.</li>
		<li>Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C en sla de nucleaire pellet.</li>
		<li>Resuspendeer de pellet van nucleaire in 50 µL van extractie Buffer NX1 aangevuld met 1 x proteaseinhibitor cocktail met pipetteren de pellet op en neer meerdere malen.</li>
		<li>Incubeer gedurende 30 min op ijs, vortexing voor 10 s elke 5 minuten op maximale snelheid.</li>
		<li>Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Desalt de nucleaire extracten.
	<ol>
<li>Het supernatant van stap 2.5.9 en overdracht in de mini dialyse-apparaten met een maximumvolume van 100 µL per eenheid verzamelen.</li>
		<li>Cap de mini dialyse-apparaten en plaats ze in een flotatie-apparaat.</li>
		<li>De flotatie-apparaat te zetten in een bekerglas van 500 mL pre gekoeld dialyse buffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 20% glycerol, 100 mM kaliumchloride (KCl), 0,2 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA), 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) en 0,5 mM DTT) en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C met zachte roeren. Let op: PMSF is gevaarlijk. Vermijd direct contact met de huid of bij inademing.</li>
		<li>Verzamelen van de monsters van de hoek van de mini dialyse-apparaten en breng in nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buizen.</li>
		<li>Centrifugeer bij 12.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C, aliquoot 25 µL van elke bovendrijvende substantie in een 1,5 mL microcentrifuge buis, en opslaan bij-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. evaluatie van de behandeling van hypoxie door detectie van het eiwit expressie en Subcellular Localisatie van HIF-1α
<ol><li>Bepaal de concentratie van de eiwitten van de hele cel of nucleaire/cytoplasmatische extracten met behulp van de microplate-bepaling van een bicinchoninic zuur (BCA) eiwit assay kit volgens fabrikant instructies18.</li>
	<li>Verdun de cel lysates in 1 x Laemmli monster buffer met 5% 2-Mercaptoethanol en kook bij 95 ° C gedurende 5 min. Let op: Raak het oppervlak van het blok van de verwarming, niet omdat het kan brandwonden veroorzaken.</li>
	<li>
Scheid de eiwitten door elektroforese natrium dodecyl sulfaat polyacrylamidegel (SDS-pagina).
	<ol>
<li>Gelijke hoeveelheden eiwit (25 µg) in elk putje van een SDS-pagina voorgegoten kleurovergang gelen (4-20%), samen met 3 µL van het molecuulgewicht markering laden.</li>
		<li>Stel de gel in het runnen van de buffer met 2.5 mM Tris, 19,2 mM glycine, 0,01% SDS, PH8.3 gedurende 30 minuten bij 200 V.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
De eiwitten aan uit de gel overbrengen in het membraan van het nitrocellulose.
	<ol>
<li>Voeg de overdracht sandwich (filtreerpapier-gel-membraan-filtreerpapier) met de gel op de kant van de anode en de membraan op de kathode-kant van de cassette.</li>
		<li>Plaats de cassette in de overdracht tank gevuld met overdracht buffer met 2.5 mM trisaminomethane (Tris), 19,2 mM glycine en 20% methanol. Let op: Methanol is brandbaar en binnen het kabinet ontvlambare vloeibare opslag moet worden opgeslagen.</li>
		<li>Verrichten de overdracht gedurende 1 uur bij 100 V in de koelruimte.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Het blokkeren van de vlek in 10 mL blokkeerbuffer met 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0.1 Tween-20 en 5% non-fat melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een shaker.</li>
	<li>Incubeer de vlek met anti-HIF-1α antilichaam (1/500 verdunning) in de dezelfde blokkeerbuffer 's nachts bij 4 ° C.</li>
	<li>Wassen van de vlek 3 keer voor 5 min telkens met 50 mL TBS-T.</li>
	<li>Incubeer de vlek met horseradish peroxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam (1/1000 verdunning) in 10 mL TBS-T met 5% vetvrije droge melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.</li>
	<li>Wassen van de vlek 3 keer voor 5 min telkens met 50 mL TBS-T.</li>
	<li>Mix 500 µL, elk voor verbeterde chemilumescent (ECL) reagens A en B in een tube van 1,5 mL microcentrifuge en vortex kort.</li>
	<li>Het ECL substraat van toepassing op de vlek en laat 1 minuut bij kamertemperatuur inwerken.</li>
	<li>
Vangen de chemiluminescentie signalen met behulp van een charge - coupled apparaat (CCD) camera gebaseerde imaging systeem.
	<ol>
<li>Afvoer van overtollige ECL substraat door het aanraken van de rand van het membraan met een papieren zakdoekje en plaats het membraan in een beschermer van het blad.</li>
		<li>Plaats het membraan op de monster-lade van de CCD camera gebaseerde imaging systeem.</li>
		<li>Lanceren van beeld processing software (Zie Tabel van materialen) en vastleggen van de beelden met de volgende instellingen: bestand → nieuw protocol → enkellijns → Protocol Setup → Gel imaging (toepassing: Chemi; Imaging gebied: Bio-Rad klaar gel; Imaging blootstelling: De software zal automatisch optimaliseren de belichtingstijd voor intense bands) → Run protocol Opmerking: De belichtingstijd kan handmatig worden ingesteld om de optimale beelden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Immunoprecipitation en detectie van de Immunoprecipitated eiwitten
<ol><li>Wassen van 50 µL van eiwit A/G sepharose kralen in 500 µL van TBS buffer in 1,5 mL microcentrifuge buizen- and -pellet de kralen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 2 min bij 4 ° C.</li>
	<li>Verwijder het supernatant en resuspendeer de kralen in 100 µL van TBS buffer.</li>
	<li>Voeg 2 µL van muis monoklonaal anti-ARNT antilichaam (1,4 mg/mL) of muis immunoglobuline G (IgG) (1,4 mg/mL), dat werd opgesteld door de bijenpopulatie 0.7 mg muis IgG in 500 µL TBS buffer.</li>
	<li>Plaats van de 1,5 mL microcentrifuge buizen met de kralen in een buis rotator en incubeer gedurende 2 h 10 rpm op de koude kamer. Opmerking: De buizen voorzichtig omgaan en houden de schorsing bevattende de bolletjes onderin de buis.</li>
	<li>Pellet de kralen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 2 min bij 4 ° C en gooi het supernatant.</li>
	<li>Verdun 200 µg van het nucleaire eiwit lysate verkregen in stap 2.6.5 in 800 µL van de IP-buffer bestaande uit 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 180 mM NaCl, 20% glycerol, 0,2% NP-40 en 1 x proteaseinhibitor cocktail. Incubeer de lysate met de antilichaam-coupled kralen verkregen in stap 4.5 's nachts bij 4 ° C.</li>
	<li>Pellet de kralen door centrifugeren bij 3000 x g gedurende 2 min bij 4 ° C, gooi het supernatant en wassen van de parels 3 keer met 1 mL ijskoud TBS met 0,2% NP-40.</li>
	<li>Kook de kralen in 50 µL Laemmli monster buffer bij 95 ° C gedurende 5 min.</li>
	<li>Centrifugeer de kralen bij 10.000 x g gedurende 5 min bij 4 ° C, verzamelen het supernatant en negeren van de kralen. Opmerking: Het supernatant kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor de korte termijn of -20 ° C voor de lange termijn.</li>
	<li>Detecteren van de aanwezigheid van HIF-1α van de immunoprecipitated-eiwitcomplexen door westelijke vlek zoals hiervoor is beschreven in stap 3.3 vanaf. Opmerking: Eiwit kwantificering is niet vereist voor deze stap. Laden van hele volume (50 µL) van het supernatans van elk monster in elk putje van een SDS-pagina voorgegoten kleurovergang gelen (4-20%)</li>
</ol>

<ol><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factors+in+physiology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factors in physiology and medicine.</a> Cell. 148 (3), 399-408 (2012).</li>
<li>Bartels, K., Grenz, A., Eltzschig, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+inflammation+are+two+sides+of+the+same+coin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and inflammation are two sides of the same coin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18351-18352 (2013).</li>
<li>Jiang, B. H., Rue, E., Wang, G. L., Roe, R., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimerization%2C+DNA+binding%2C+and+transactivation+properties+of+hypoxia-inducible+factor+1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dimerization, DNA binding, and transactivation properties of hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 271 (30), 17771-17778 (1996).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIF-1%3A+mediator+of+physiological+and+pathophysiological+responses+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">HIF-1: mediator of physiological and pathophysiological responses to hypoxia.</a> J Appl Physiol. 88 (4), 1474-1480 (2000).</li>
<li>Kallio, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+in+hypoxic+cells%3A+Inducible+nuclear+translocation+and+recruitment+of+the+CBP%2Fp300+coactivator+by+the+hypoxia-inducible+factor-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Signal transduction in hypoxic cells: Inducible nuclear translocation and recruitment of the CBP/p300 coactivator by the hypoxia-inducible factor-1alpha.</a> EMBO J. 17 (22), 6573-6586 (1998).</li>
<li>Ke, Q., Costa, M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16887934">Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1).</a> Mol Pharmacol. 70 (5), 1469-1480 (2006).</li>
<li>Gustafsson, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+requires+notch+signaling+to+maintain+the+undifferentiated+cell+state%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Hypoxia requires notch signaling to maintain the undifferentiated cell state.</a> Dev Cell. 9 (5), 617-628 (2005).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+with+factor+inhibiting+HIF-1+defines+an+additional+mode+of+cross-coupling+between+the+Notch+and+hypoxia+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Interaction with factor inhibiting HIF-1 defines an additional mode of cross-coupling between the Notch and hypoxia signaling pathways.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3368-3373 (2008).</li>
<li>D'Ignazio, L., Bandarra, D., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-kappaB+and+HIF+crosstalk+in+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">NF-kappaB and HIF crosstalk in immune responses.</a> FEBS J. 283 (3), 413-424 (2016).</li>
<li>Wang, G. L., Jiang, B. H., Rue, E. A., Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-inducible+factor+1+is+a+basic-helix-loop-helix-PAS+heterodimer+regulated+by+cellular+O2+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hypoxia-inducible factor 1 is a basic-helix-loop-helix-PAS heterodimer regulated by cellular O2 tension.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (12), 5510-5514 (1995).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-type-specific+regulation+of+degradation+of+hypoxia-inducible+factor+1+alpha%3A+Role+of+subcellular+compartmentalization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-type-specific regulation of degradation of hypoxia-inducible factor 1 alpha: Role of subcellular compartmentalization.</a> Mol Cell Biol. 26 (12), 4628-4641 (2006).</li>
<li>Depping, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+translocation+of+hypoxia-inducible+factors+%28HIFs%29%3A+involvement+of+the+classical+importin+alpha%2Fbeta+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Nuclear translocation of hypoxia-inducible factors (HIFs): involvement of the classical importin alpha/beta pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1783 (3), 394-404 (2008).</li>
<li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+induces+oncogene+yes-associated+protein+1+nuclear+translocation+to+promote+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+invasion+via+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypoxia induces oncogene yes-associated protein 1 nuclear translocation to promote pancreatic ductal adenocarcinoma invasion via epithelial-mesenchymal transition.</a> Tumour Biol. 39 (5), (2017).</li>
<li>Chang, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+promotes+nuclear+translocation+and+transcriptional+function+in+the+oncogenic+tyrosine+kinase+RON%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxia promotes nuclear translocation and transcriptional function in the oncogenic tyrosine kinase RON.</a> Cancer Res. 74 (16), 4549-4562 (2014).</li>
<li>Moriya, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+nature+of+overexpression+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Quantitative nature of overexpression experiments.</a> Mol Biol Cell. 26 (22), 3932-3939 (2015).</li>
<li>Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+overexpression%3A+Uses%2C+mechanisms%2C+and+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Gene overexpression: Uses, mechanisms, and interpretation.</a> Genetics. 190 (3), 841-854 (2012).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Notch-independent+mechanism+contributes+to+the+induction+of+Hes1+gene+expression+in+response+to+hypoxia+in+P19+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A Notch-independent mechanism contributes to the induction of Hes1 gene expression in response to hypoxia in P19 cells.</a> Exp Cell Res. 358 (2), 129-139 (2017).</li>
<li>Farris, M. H., Ford, K. A., Doyle, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Qualitative+and+quantitative+assays+for+detection+and+characterization+of+protein+antimicrobials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Qualitative and quantitative assays for detection and characterization of protein antimicrobials.</a> J Vis Exp. (110), e53819(2016).</li>
<li>Chilov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+nuclear+translocation+of+hypoxia-inducible+factor-1+%28HIF-1%29%3A+heterodimerization+with+ARNT+is+not+necessary+for+nuclear+accumulation+of+HIF-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Induction and nuclear translocation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1): heterodimerization with ARNT is not necessary for nuclear accumulation of HIF-1alpha.</a> J Cell Sci. 112 (Pt 8), 1203-1212 (1999).</li>
<li>Yin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arylsulfonamide+KCN1+inhibits+in+vivo+glioma+growth+and+interferes+with+HIF+signaling+by+disrupting+HIF-1alpha+interaction+with+cofactors+p300%2FCBP%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Arylsulfonamide KCN1 inhibits in vivo glioma growth and interferes with HIF signaling by disrupting HIF-1alpha interaction with cofactors p300/CBP.</a> Clin Cancer Res. 18 (24), 6623-6633 (2012).</li>
<li>Holmquist-Mengelbier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+HIF-1alpha+and+HIF-2alpha+to+common+target+genes+is+differentially+regulated+in+neuroblastoma%3A+HIF-2alpha+promotes+an+aggressive+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype.</a> Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).</li>
<li>Koh, M. Y., Powis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Passing+the+baton%3A+The+HIF+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Passing the baton: The HIF switch.</a> Trends Biochem Sci. 37 (9), 364-372 (2012).</li>
<li>Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+protein+protein+interactions+in+salt+solutions+and+implications+for+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization.</a> Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).</li>
<li>Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endothelial+cell+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+expression+by+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia.</a> J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).</li>
<li>Caradec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperate+house+genes%27%3A+The+dramatic+example+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia.</a> Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

De HIF-1-complex is een meester regulator van cellulaire zuurstof homeostase en regelt een overvloed van genen die betrokken zijn bij verschillende cellulaire adaptieve reacties op hypoxie. Identificatie van nieuwe HIF-1 interacterende eiwitten is belangrijk voor het begrijpen van hypoxische signaaltransductie. Co-immunoprecipitation experimenten worden vaak gebruikt voor PPIs studies af te bakenen Cellulaire signaaltransductie trajecten. Echter, eiwit overexpressie is nog steeds veel gebruikt en dit kan leiden tot exper...

Hypoxie treedt op wanneer onvoldoende zuurstof aan de cellen en weefsels van het lichaam wordt geleverd. Het speelt een cruciale rol in verschillende fysiologische en pathologische processen zoals stamcel differentiatie, ontsteking en kanker1,2. Hypoxie-afleidbare factoren (HIFs) fungeren als heterodimers samengesteld uit een zuurstof-gereglementeerde α subeenheid en een constitutively uitgedrukt β-subunit ook bekend als ARNT3. Drie isoforms van de HIF-α-subunits (HIF-1α, HIF-2α en HIF-3α) en drie HIF-β-subunits (ARNT/HIF-1β, ARNT2 en ARNT3) zijn tot nu toe geïdentificeerd. HIF-1α en ARNT worden overal uitgedrukt, overwegende dat de HIF-2α HIF-3α, ARNT2 en ARNT3 hebben meer expressie patronen4beperkt. De HIF-1 eiwit complex is de belangrijke regulator van de reactie van hypoxie. Hypoxische omstandigheden HIF-1α wordt gestabiliseerd, vervolgens translocates op de nucleus en dimerizes met ARNT5. Vervolgens dit complex wordt gebonden aan bepaalde nucleotiden hypoxie responsieve elementen (HREs) genoemd en regelt de uitdrukking van de doelgenen die betrokken zijn bij verschillende processen, met inbegrip van angiogenese, Erytropoëse en glycolyse6. Naast deze "canonieke" reactie, de signalering traject van hypoxie is ook bekend Overspraak met meerdere cellulaire respons op de signalering van studierichtingen zoals de Inkeping en Nuclear Factor-kappa B (NF-recombination)7,8,9.
De identificatie van roman HIF-1 interacterende eiwitten is belangrijk voor een beter begrip van de signalering traject hypoxie. In tegenstelling tot ARNT, die ongevoelig voor zuurstofniveaus en constitutively uitgedrukt is, worden de HIF-1α eiwitniveaus strak gereguleerd door cellulaire zuurstofniveaus. Normoxia (21% zuurstof) zijn HIF-1α proteïnen snel aangetaste10,11. De korte halfwaardetijd van HIF-1α op normoxia biedt specifieke technische uitdagingen voor de detectie van het eiwit uit cel extracten, alsook voor de identificatie van eiwitten HIF-1α-interactie. Bovendien translocate verschillende transcriptiefactoren met inbegrip van die van het complex HIF-1 in de kern onder hypoxische voorwaarden12,13,14. De meeste van de huidige methoden voor PPI studies worden uitgevoerd met behulp van niet-fysiologische overexpressie van eiwitten. De overexpressie van dergelijke eiwitten is gemeld aan de verschillende cellulaire defecten veroorzaken door meerdere mechanismen, met inbegrip van resource overbelasting, stoichiometrische onbalans, promiscue interacties en traject modulatie15,16. In termen van PPI studies, kan eiwit overexpressie leiden tot valse positieve, of zelfs valse negatief, resultaten, afhankelijk van de eigenschappen van de eiwitten en de functies van de overexpressie eiwitten. Daarom moeten de huidige methoden voor PPI studies worden gewijzigd om te onthullen het fysiologisch relevante PPIs onder hypoxische voorwaarden. Wij hebben eerder aangetoond dat de interactie tussen HIF-1 en de familie transcriptiefactor Ets GA-bindend-proteïne (GABP) in hypoxische P19 cellen, die tot de reactie van de Hes1 -promotor op hypoxie17 bijdraagt. Hier beschrijven we een co-immunoprecipitation protocol om te studeren van PPIs tussen endogene nucleaire eiwitten hypoxische omstandigheden. De interactie tussen HIF-1α en ARNT wordt weergegeven als een proof of concept. Dit protocol is geschikt voor het aantonen van de interacties tussen transcriptiefactoren en transcriptionele co regelgevers hypoxische voorwaarden, met inbegrip van maar niet beperkt tot de identificatie van HIF-1 interacterende eiwitten.

<table><tbody><tr><td>Materiaal</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tris-HCl Buffer, pH 7.4&nbsp;</td><td>1st BASE</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Protein A/G Sepharose kralen</td><td>Abcam</td><td>ab193262</td><td></td></tr><tr><td>Natuurlijk muis IgG-eiwit</td><td>Abcam</td><td>ab198772</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>1610729</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli-steekproefbuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulosemembraan &nbsp;&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Blotting-Grade Blocker</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404</td><td>Voor vetvrije gedroogde melk voor western blotting-toepassingen</td></tr><tr><td>10x Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine-buffer&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610771</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Anti-konijn IgG, HRP-gekoppeld antilichaam</td><td>Cell Signaling</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>Anti-muis IgG, HRP-gekoppeld antilichaam&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>SignalFire ECL-reagens</td><td>Cell Signaling</td><td>6883</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF)</td><td>Merck Millipore</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>ARNT/HIF-1 bèta-antilichaam&nbsp;</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-124&nbsp;</td><td>Concentratie: 1,4 mg/mL</td></tr><tr><td>HIF-1 alfa-antilichaam</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-479</td><td>Concentratie: 1,0 mg/mL</td></tr><tr><td>YY1-antilichaam</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP1-46218</td><td>Concentratie: 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Qproteome Nucleair Eiwit Kit</td><td>Qiagen</td><td>37582</td><td>Lysis buffer NL en extractiebuffer NX1 zijn aanwezig in de kit</td></tr><tr><td>GAPDH-antilichaam</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47724</td><td>Concentratie: 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Glycerol (&ge;99%)</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchloride</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>RIPA-buffer</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchloride (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>127087-87-0</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo;s aangepast Eagle&rsquo;s medium (DMEM, 4,5 g/L glucose)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>Fetaal runder serum</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A-cellijn</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>Methanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilline-streptomycine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protease Inhibitor Tablets&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88660</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA-eiwitbepalingskit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>QSP gel-loadingtip&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>QSP#010-R204-Q-PK</td><td>1-200 uL</td></tr><tr><td>Apparatuur/instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dikt Blot Filter Paper, voorgesneden, 7,5 x 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp;Tetra Vertical Electrophoresis Cell voor mini-precastgels, met Mini Trans-Blot&nbsp;Module en PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>1658034</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash;15% Mini-PROTEAN TGX precast eiwitgels</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+ System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>I-Glove</td><td>BioSpherix</td><td>I-Glove</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HTX Multi-Mode Microplate Reader&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>BTS1LFTA</td><td></td></tr><tr><td>Costar 5mL Stripette serologische pipetten</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Costar 10mL Stripette serologische pipetten</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar 25mL Stripette serologische pipetten</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-Well Clear Bottom Black Polystyrene Microplates</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>15mL High Clarity PP conische centrifugeerbuisjes</td><td>Corning</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Kleine Cell Scraper</td><td>Corning</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Gilson&nbsp;Pipetman L 4-pijpjeskit&nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>P2, P20, P200, P1000 en accessoires</td></tr><tr><td>1,5mL Polypropyleen Microcentrifugebuisjes</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td>616201</td><td></td></tr><tr><td>PIPETBOY acu 2 Pipettor</td><td>INTEGRA Biosciences</td><td>155 000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Justrite Vlambare vloeibare opslagkasten</td><td>Justrite Manufacturing Co.</td><td>896000</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-mixer</td><td>Labnet</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>CO2-incubator</td><td>NuAire</td><td>NU-5820</td><td></td></tr><tr><td>Orbitale shakers</td><td>Stuart</td><td>SSL1</td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator SB3</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 21R Microcentrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002470</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16 Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>Weefselkweekschalen (100 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI dialyseapparaat</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69580</td><td>10K MWCO, 0,1 mL</td></tr>

co-immunoprecipitation assay met behulp van endogene nucleaire eiwitten uit cellen gekweekt onder hypoxische voorwaarden

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Lage zuurstofniveaus (hypoxie) leiden tot een verscheidenheid van adaptieve reacties met de hypoxie-afleidbare factor 1 (HIF-1) complexe fungeert als een meester regulator. HIF-1 bestaat uit een heterodimeric zuurstof-gereglementeerde α subeenheid (HIF-1α) en constitutively uitgedrukt β subeenheid (HIF-1β) ook bekend als aryl koolwaterstof receptor nucleaire translocator (ARNT), regulering van de genen die betrokken zijn bij verschillende processen, met inbegrip van angiogenese , Erytropoëse en glycolyse. De identificatie van HIF-1 interacterende eiwitten is de sleutel tot het begrip van de signalering traject hypoxie. Naast de regulering van de HIF-1α stabiliteit leidt hypoxie ook tot de nucleaire translocatie van vele transcriptiefactoren waaronder HIF-1α en ARNT. Met name, zijn de meeste van de huidige methoden gebruikt bij het bestuderen van deze eiwit-eiwitinteractie (PPIs) gebaseerd op systemen waar eiwitniveaus kunstmatig worden verlengd door middel van eiwit overexpressie. Eiwit overexpressie vaak leidt tot niet-fysiologische resultaten die voortvloeien uit de temporele en ruimtelijke artefacten. Hier beschrijven we een gemodificeerde co-immunoprecipitation protocol na hypoxie behandeling met behulp van endogene nucleaire eiwitten, en als een proof of concept, om te laten zien van de interactie tussen HIF-1α en ARNT. In dit protocol, de hypoxische cellen zijn geoogst hypoxische omstandigheden en van de Dulbecco zoute Phosphate-Buffered (DPBS) was buffer was ook vooraf equilibrated hypoxische voorwaarden vóór gebruik ter vermindering van de aantasting van het proteïne of eiwit complex Dissociatie tijdens heroxygenatie. Daarnaast werden de nucleaire breuken vervolgens gehaald om te concentreren en het stabiliseren van de endogene nucleaire eiwitten en het voorkomen van mogelijke valse resultaten vaak gezien tijdens eiwit overexpressie. Dit protocol kan worden gebruikt om aan te tonen van endogene en inheemse interacties tussen transcriptiefactoren en transcriptionele co regelgevers hypoxische omstandigheden.

Om te evalueren van de cellulaire reactie op hypoxie, de expressie niveaus en subcellular localisatie van de componenten van de HIF-1 complexe volgende hypoxie behandeling werden onderzocht. HEK293A cellen werden gekweekte hypoxische voorwaarden voor 4 uur of als besturingselementen op normoxia gehouden. HIF-1α en ARNT eiwitniveaus werden onderzocht in hele cel of nucleaire/cytoplasmatische uittreksels door westelijke vlek. Zoals verwachte, totale HIF-1α niveaus upregulated door hypoxie, ...

Hier beschrijven we een co-immunoprecipitation protocol om te bestuderen van de eiwit-eiwit interactie tussen endogene nucleaire eiwitten hypoxische omstandigheden. Deze methode is geschikt voor de demonstratie van de interacties tussen transcriptiefactoren en transcriptionele co regelgevers op hypoxie.

Co-immunoprecipitation Assay met behulp van endogene nucleaire eiwitten uit cellen gekweekt onder hypoxische voorwaarden

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het hypoxische veld, zoals endogene en inheemse interacties tussen transcriptiefactoren en hun transcriptionele coregulators onder hypoxische omstandigheden. Het grote voordeel van deze techniek is dat de hypoxische cellen worden geoogst onder hypoxische omstandigheden en dat de nucleaire fracties worden gebruikt voor de co-immunoprecipitatie. Dit protocol gebruikt menselijke embryonale nier 293A-cellen die zijn gekweekt in vier 10-centimeter schotels.Zaai drie tot vijf keer 10 tot de zesde cellen per schotel in 10 milliliter Dulbeco's gemodificeerd Eagle's medium aangevuld met 10%FBS, L-glutamine, natriumpyruvaat, penicilline en streptomycine. Kweek de cellen in een 37 graden Celsius 5% koolstofdioxide-incubator. Vierentwintig uur na het zaaien, wanneer de cellen 80 tot 90% confluentie hebben bereikt, plaatst u twee schotels in de hypoxiesubkamer in de handschoenkast van de incubator met 1% zuurstof en 5% koolstofdioxide bij 37 graden Celsius gedurende vier uur.Houd de andere twee schotels bij normboxia. Op de dag voor het oogsten van de hypoxie-behandelde cellen, voorverwarm DPBS naar hypoxische omstandigheden door een onbedekte 100 milliliter experimentele glazen reagentieverpakking gevuld met DPBS in de hypoxiesubkamer te plaatsen gedurende 24 uur. Ongeveer een uur voordat de cellen worden geoogst, plaatst u een ijsbox met ijs in de verwerkingskamer van de handschoenkast, die is geëquilibreerd tot 1% zuurstof en 5% koolstofdioxide.Breng de fles met de voorverwarmde hypoxische DPBS van de hypoxiesubkamer naar de verwerkingskamer en plaats deze op ijs. Vier uur na de hypoxiebehandeling, brengt u de cellen van de hypoxiesubkamer over naar de verwerkingskamer die is voorverwarmd naar 1% zuurstof en 5% koolstofdioxide. Verwijder het kweekmedium door aspiratie en spoel de cellen eenmaal af met een 10 milliliter pipette, 10 milliliter ijskoud voorverwarmde hypoxische DPBS.Gebruik een vijf milliliter pipette om 5 milliliter ijskoud voorverwarmde DPBS toe te voegen en los de cellen op door met een celschraper te schrapen. Kantel de celkweekplaat, verzamel de losgemaakte cellen met een 10 milliliter pipette en breng de celsuspensie over in een 15 milliliter conische buis. Houd de buis met cellen op ijs.Open de deur tussen de verwerkings- en bufferkamers in de handschoenkast, die beide zijn voorverwarmd naar 1% zuurstof en 5% koolstofdioxide. Breng de 15 milliliter conische buizen op ijs die hypoxie-behandelde cellen bevatten van de verwerkingskamer naar de bufferkamer. Open de deur van de bufferkamer en verwijder de cellen volledig uit de handschoenkast.Pellet zowel de hypoxische cellen als de normoxische cellen door centrifugatie bij 1000 keer g gedurende vijf minuten bij vier graden Celsius. Voor deze procedure wordt een nucleaire extractiekit gebruikt. Begin met het voorzichtig resuspenderen van elke celpellet in 500 microliter lyseerbuffer NL, aangevuld met 1X proteaseremmercocktail in 0,1 molair DTT door meerdere keren op en neer te pipetteren.Voeg 25 microliter detergentoplossing NP toe aan de celsuspensie en vortex gedurende 10 seconden op maximale snelheid. Centrifugeer gedurende vijf minuten bij 1000 keer 10 g bij vier graden Celsius. Bewaar zowel de supernatant als de nucleaire pellet.Na het verzamelen en opslaan van de supernatant zoals beschreven in het tekstprotocol, resuspendeert u de pellet-bevattende celkernen in 500 microliter lyseerbuffer NL, aangevuld met 1X proteaseremmercocktail en 0,1 molair DTT door vijf seconden op maximale snelheid te vortexen. Resuspendeer de nucleaire pellet in 50 microliter extractiebuffer NX1, aangevuld met 1X proteaseremmercocktail door de pellet meerdere keren op en neer te pipetteren. Incubeer gedurende 30 minuten op ijs.Elke vijf minuten, vortex gedurende 10 seconden op maximale snelheid. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12.000 x g bij vier graden Celsius. Verzamel de supernatant en breng deze over in mini dialyseapparaten met een maximaal volume van 100 microliter per eenheid voor ontzouting.Sluit de mini dialyseapparaten en plaats ze in een drijfmiddel. Plaats het drijfmiddel in een beker met 500 milliliter voorgekoelde dialysebuffer. Wees voorzichtig om direct contact met de huid of inademing van de dialysebuffer te vermijden, omdat deze PMSF bevat.Incubeer gedurende 30 minuten bij vier graden Celsius met zacht roeren. Na 30 minuten, verzamelt u de monsters vanuit de hoek van de mini dialyseapparaten en brengt u ze over in nieuwe 1,5 milliliter microcentrifugebuizen. Centrifugeer gedurende 10 minuten bij 12 duizend keer g bij vier graden Celsius.Pipet 25 microliter van elke supernatant in een 1,5 microliter centrifugebuis en bewaar bij min 80 graden Celsius. Bereid de eiwit AG sefarosebeads voor die worden gebruikt in de immunopreciptatie. Pipet 50 microlitera beads in elk van de vier 1,5 milliliter microcentrifugebuizen en voeg 500 microliters DPBS buffer per buis toe.Pellet de beads door centrifugatie. Gooi de supernatant weg en resuspendeer de beads in 100 microliter TBS buffer. Voeg twee microliter muis monoklonaal anti-ARNT antilichaam of muis immunoglobuline G toe dat werd bereid door 0,7 milligram muis IgG op te lossen in 500 microliter TBS buffer.Neem de microcentrifugebuizen met de beads mee naar een koude ruimte. Plaats ze in een buisrotor en incubeer bij 10 tpm gedurende twee uur. Na twee uur, pellet de beads door centrifugatie en gooi de supernatanten weg.Verdun 200 microgram van het eerder bereide nucleaire eiwitlysaat in 800 microliter immunoprecipitatiebuffer. Incubeer het lysaat met de antilichaam-gekoppelde beads bij vier graden Celsius gedurende de nacht. Op de volgende dag, pellet de beads door centrifugatie bij 3000 keer g gedurende twee minuten bij vier graden Celsius.Gooi de supernatant weg. Voeg een milliliter ijskoud TBS met 0,2% NP-40 toe aan elke buis en centrifug

co-immunoprecipitation-assay-using-endogenous-nuclear-proteins-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hier hebben we voorstellen eenvoudige methoden om hypoxie te induceren in celkweken en eenvoudige tests om de hypoxische status van de culturen te evalueren.

Inductie en testen van Hypoxie in celkweek

This video describes protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay, which is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions.This technique is used to identify target genes in human chronic lymphocytic leukemia cells.

Chromatin Immunoprecipitation Assay: A Technique to Study Protein-DNA Interactions in Cells

We beschrijven een robuuste methode voor het chromatine immunoprecipitatie met primaire T-cellen. De methode is gebaseerd op standaard methoden, maar gebruikt een specifieke set van omstandigheden en reagentia die de efficiëntie van een beperkte hoeveelheid cellen verbeteren. Belangrijk is een gedetailleerde beschrijving van de data analysefase gepresenteerd.

Efficiënte Chromatine immunoprecipitatie behulp Beperking hoeveelheden biomassa

We geven een gedetailleerd protocol voor inductie van lange termijn potentiëring van de CA1 regio van de hippocampus en de daaropvolgende isolatie van nucleaire verrijkte fracties uit de tetanized gebied van het segment. Deze benadering kan worden gebruikt om activiteit te bepalen afhankelijk kerneiwit invoer cellulaire modellen van leren en geheugen.

Isolatie van CA1 Nuclear verrijkte fracties van hippocampus Slices om te studeren activiteit-afhankelijke nucleaire import van Synapto-nucleaire Messenger Eiwitten

We beschrijven een techniek voor de analyse van globale RNA synthese in hypoxie met beeldvorming. Instructies-chemische kenmerken van RNA niet eerder is uitgevoerd onder hypoxie en maakt visualisatie van globale RNA veranderingen op enkele cel. Deze aanpak vormt een aanvulling op de bestaande gemiddelde RNA-technieken, waardoor directe visualisatie van cel-naar-cel veranderingen in de wereldwijde RNA synthese.

Analyse van Global RNA synthese in de Single Cell Level volgende Hypoxie

Dit manuscript beschrijft een aanpak om selectieve cognate RNP's te isoleren die in eukaryote cellen worden gevormd via een specifieke oligonucleotide-gestuurde verrijking. We tonen de toepasbaarheid van deze aanpak door een cognate RNP te isoleren die gebonden is aan het retrovirale 5' niet-vertaalde gebied dat is samengesteld uit DHX9/RNA-helicase A.

Isolatie van Cognate RNA-eiwitcomplexen van cellen met behulp van oligonucleotide-gerichte Elution

Eiwit-eiwit interacties kunnen zowel in de kern als in het cytoplasma van een cel optreden. Om deze interacties te onderzoeken, worden traditionele co-immunoprecipitatie en moderne proximity ligatie-assay toegepast. In deze studie vergelijken we deze twee methoden om de verdeling van NF90-RBM3 interacties in de kern en het cytoplasma te visualiseren.

Visualisatie van eiwit-eiwit interacties in nucleaire en cytoplasmatische fracties door Co-immunoprecipitatie en<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Ligatie Assay

Het onderzoeken van meerdere, kunnen endogene posttranslationele modificaties voor een eiwit-doelstelling zeer uitdagend. De hier beschreven technieken gebruiken een geoptimaliseerde lysis buffer en filter systeem ontwikkeld met specifieke PTM-targeting, affiniteit matrices te sporen van de acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3 en tyrosine fosforylering wijzigingen voor een doel eiwit met behulp van een enkele, gestroomlijnde systeem.

Met behulp van een uitgebreide Immunoprecipitation verrijking systeem ter identificatie van het profiel van een endogene posttranslationele wijziging voor Target eiwitten

Beschreven is een proteomica-workflow voor het identificeren van eiwit interactie partners uit een nucleaire subcellulaire fractie met behulp van immunoaffinity verrijking van een gegeven proteïne van belang en label-vrije massaspectrometrie. De workflow omvat subcellulaire fractionering, immunoprecipitatie, filter aided monstervoorbereiding, offline opruimen, massaspectrometrie, en een downstream bioinformatica pijpleiding.

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Hier beschrijven we een in vitro protocol om hypoxie/reoxygenatieschade te modelleren in de sterk metabole proximale tububulaire epitheelcellen. Dit model is ontworpen om schade veroorzaakt door metabole stress te induceren, die kan worden gemeten door de expressie van proximale tubuli-schademarkers en de beoordeling van de mitochondriale ademhalingsfunctie.

Modellering van hypoxie/reoxygenatieschade in proximale tubulära epitheelcellen

Leer co-immunoprecipitatie van endogene nucleaire eiwitten onder hypoxische omstandigheden met HEK293A-cellen. Deze methode onderzoekt eiwit-eiwitinteracties tussen transcriptiefactoren en co-regulatoren.

Co-immunoprecipitation Assay met behulp van endogene nucleaire eiwitten uit cellen gekweekt onder hypoxische voorwaarden

Meer video's verkennen