Methoden voor de ontdekking van nieuwe verbindingen moduleren van een Receptor Gamma - aminoboterzuur Typ een transmissie

Het algemene doel van deze video is om een screeningcascade te illustreren die de ontdekking van nieuwe GABA-A receptor-liganden mogelijk maakt. Het voordeel van het gebruik van radioligandbinding, elektrofysiologisch opnemen in xenopus-eicellen en in knaagdierhersenslices op een literaire manier is dat het profiel van de verbinding kan worden verbeterd. Uiteindelijk worden krachtige subtype-, selectieve en effectieve verbindingen geïdentificeerd.

Deze demonstratie zal worden uitgevoerd door Kumico Kambara en Jenna Tognaccini, evenals Sonia en Daniel Bertrand van HiQScreen en Marie Claire Pflimlin van Roche. Injecteer 10 tot 50 nanoliters van de oplossing die het plasmide bevat, met behulp van een glazen micro-injectienaald met een tipdiameter tot 100 micrometer gemonteerd op een micromanipulator uitgerust met een drukuitstotingssysteem of met een geautomatiseerd injectiesysteem. Om deze procedure te beginnen, bewaar de eicellen op 17 graden Celsius om de expressie van hitteshock-eiwitten te voorkomen.

Bewaar de microplaat in een thermisch gecontroleerde opslagruimte. Los vervolgens de testverbindingen, die positief getest zijn in de bindingstest in OR2, op in 0,1 en 1000 micromolar voor elektrofysiologische opnamen en plaats ze in een 96-well vlakbodempolypropyleenplaat. Om twee-elektrode spanningsklemopname uit te voeren, plaats een plaat met de eicellen op het geautomatiseerde systeem.

Programmeer het geautomatiseerde opnamesysteem met behulp van de op pictogrammen gebaseerde interface met dit schema voor de juiste bepaling van de concentratie-activiteitsrelatie. Voor curvefitting, gebruik de geïllustreerde concentratie-activatiecurve, plot de stroomamplitude als functie van het logaritme van de concentratie van de agonist. Voor elektrofysiologisch opnemen, bewaar de hersenen in dACSF-oplossing geblazen met carbogen op kamertemperatuur.

Vervolgens, dissecteer de linkerhippocampusformatie met een fijne spatel. Snijd vervolgens transversale plakken van 400 micrometer dikte van het middelste deel van de hippocampus met een weefselsnijder. Gebruik een schilderskwast om de plakken naar de opnamekamer over te brengen en houd ze 45 minuten op kamertemperatuur.

Daarna, perfuseer de plakken met rACSF geblazen met carbogen bij 35 graden Celsius en met een snelheid van 1,5 milliliter per minuut. Om een enkele populatie spike op te nemen, plaats een hersensnede in de op de microscoop gemonteerde kamer. Perfuseer de snede met rACSF met een snelheid van drie milliliter per minuut.

Gebruik de pijpjestrekker om een borosilicaatglas micropijpje te trekken met een weerstand van ongeveer twee megaohm. Vul het micropijpje met een oplossing die twee molaire natriumchloride bevat en plaats het in de pijpjeshouder. Positioneer het opnamemicropijpje in het stratum pyramidale in de CA1-regio van de hippocampussnede met behulp van de rechter micromanipulator.

Plaats vervolgens een geïsoleerde bipolaire platina-iridiumelektrode in de houder op de linker micromanipulator. Positioneer de stimulatie-elektrode in de Schaffer-collateralen in de CA1-regio van de hippocampussnede met behulp van de linker micromanipulator. Gebruik de stimulator om elke 30 seconden een stroompuls aan de stimulatie-elektrode te leveren en verhoog geleidelijk de stimulatiesterkte tot een populatie spike verschijnt.

Stel de stimulatiesterkte aan om een populatie spike te veroorzaken die overeenkomt met 45%van de maximale amplitude die kan worden verkregen. Om gepaarde pulsremming uit te voeren, lever twee stroompulsen aan de stimulatie-elektrode elke 30 seconden met behulp van de stimulator. Stel de stimulatiesterkte in om een populatie spike te veroorzaken die overeenkomt met 45%van de maximale amplitude.

Om de verbindingen te testen, maak verdunningen van de te testen verbindingen in ACSF zodat de uiteindelijke concentratie van DMSO niet hoger is dan 0,1%Voeg DMSO toe aan de controle-oplossing in dezelfde concentratie als die in de verbindingsoplossing. Neem een enkele of een gepaarde puls populatie spike op die wordt opgewekt door Schaffer-collaterale stimulaties elke 30 seconden gedurende ten minste 30 minuten. De populatie spike-vorm moet stabiel zijn tijdens deze basisperiode.

Bereidt vervolgens een beker met carbogenaat rACSF voor die een vaste concentratie van de te testen verbinding bevat en perfuseer de hippocampussnede met de oplossing tijdens het opnemen van enkele of gepaarde puls populatie spikes. Evalueer ook het herstel van het effect van de verbinding door de snede te perfuseren met carbogenaat rACSF zonder de verbinding. Hier is een schematische weergave van een rattenhippocampussnede, de Schaffer-collateralen die ontspringen aan de CA3-piramidecel-axonen die op de dendritische arborisatie van de CA1-piramideneuronen worden geprojecteerd.

Micropijpjes werden geplaatst in het stratum pyramidale om populatie spikes op te nemen en in het stratum radiatum voor dendritische opnamen van veld-excitatorische postsynaptische potentialen. De stimulatie-elektrode werd geplaatst binnen de Schaffer-collateralen. Deze figuur toont populatie spikes opgewekt door de gepaarde stimuli die met een interval van 20 milliseconden via dezelfde stimulerende elektrode worden toegepast.

De populatierespons op de tweede stimulus is van kleinere amplitude dan die van de respons op de eerste stimulus. Populatie spikes werden opgenomen in de afwezigheid en aanwezigheid van bèta CCM, een niet-selectieve GABA A receptor NAM. Bèta CCM verhoogde de amplitude van de tweede populatie spike door enige feed-forward gabaerge remming gedeeltelijk te blokkeren.

Na deze procedure kunnen andere methoden zoals farmacokinetiek, receptorbezetting en werkzaamheid in vivo en veiligheidsfarmacologie worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals het potentieel voor klinische ontwikkeling van de geïdentificeerde verbindingen.