Name: Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Leer hoe u T-afhankelijke en T-onafhankelijke immunoglobuline-isotype-responsen in muizen karakteriseert met ELISA. Deze methode biedt betrouwbare kwantitatieve metingen van B-celactivatie en humorale immuniteit.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Deze studie werd ondersteund door de National Institutes of Health grants R01 CA158402 (P. Xie) en R21 AI128264 (P. Xie), het ministerie van defensie verlenen W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), een piloot-Award van de kanker instituut voor New Jersey door Grant nummer P30CA072720 van het National Cancer Institute (P. Xie), een Busch biomedische Grant (P. Xie), een Victor Stollar Fellowship (A. Lalani), en een Anne B. en James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).

Dit protocol volgt de richtsnoeren van de ethische commissie van de institutionele dierlijke onderzoek van Rutgers University. Alle muizen worden gebruikt overeenkomstig de richtsnoeren van de NIH en onder een dierlijke protocol goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité.
1. bereiding van muizen en verzameling van naïeve muis Sera
<ol><li>Houd alle muizen voor immunisatie experimenten in een specifieke pathogenen vrije dier faciliteit.</li>
	<li>Gebruik gender-matched, jonge volwassene (8-12 weken oud) van het knock-out en littermate controle muizen die dezelfde ouders en kooien voor immunisatie studies delen.</li>
	<li>Plan de immunisatie en serum collectie schema's zoals afgebeeld in Figuur 1.</li>
	<li>Oogst naïef serum van elke muis op 7 dagen (-7 dagen) vóór immunisatie. Volg de procedures van de retro-orbitaal bloeden en serum de voorbereiding zoals hieronder beschreven in stap 4.</li>
</ol>2. voorbereiding van TNP-polysaccharide (een TI-antigeen) en TNP-HC (een TD-antigeen)
<ol><li>Los de antigeen-poeders in steriele PBS (pH 7.4) grondig te maken van 0,5 mg/mL van TNP-polysaccharide materieel en 1 mg/mL TNP-HC stamoplossingen. Aliquoot elk antigeen stockoplossing in steriele microfuge buizen op 0,5 mL/buis, en houd de aliquots bij-80 ° C voor langdurige opslag. Vermijd meerdere bevriezen en ontdooien van het antigeen aliquots.</li>
	<li>Op de dag van de injectie, het berekenen van het volume van TNP-polysaccharide (50 µg/100 µL/muis) of TNP-HC (100 µg/100 µL/muis) moest volgens het aantal muizen worden geïnjecteerd. Ontdooi de juiste aantal TNP-polysaccharide of TNP-HC aliquots bij kamertemperatuur (RT).</li>
	<li>Voor TNP-HC injectie, eerst de aluin adjuvans (40 mg/mL) met 3 delen steriel PBS tot een eindconcentratie van 10 mg/mL verdund. Zorg ervoor dat de aluin adjuvans mengsel goed geschorste vóór verdunning.</li>
	<li>Combineren van gelijk volume van 10 mg/mL aluin adjuvans drijfmest uit stap 2.3 en de ontdooide TNP-HC-oplossing (1 mg/mL) in een polypropyleen tube van 5 mL, meng goed en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten voorbereiden deze TNP-HC/aluin Meng vers vóór de injectie.</li>
</ol>3. de immunisatie van muizen
<ol><li>Uitvoeren intraperitoneaal (i.p.) injectie van TNP-polysaccharide of TNP-HC/aluin te immuniseren van de muizen met 1 mL insuline spuiten in een kast van de bioveiligheid. Plaats de naald op ongeveer 30° hoek bij voorkeur in de lagere juiste kwadrant van elke muis om te voorkomen dat de injectie in de inwendige organen.</li>
	<li>Injecteren i.p. 100 µL van TNP-polysaccharide per muis op dag 0 voor TI Ag immunisatie(Figuur 1).</li>
	<li>Injecteren i.p. 200 µL van het mengsel van de TNP-HC/aluin (vers bereid in stap 2.4) per muis op dag 0 voor TD Ag immunisatie. Herhaal de zelfde injectie op dag 21 als een booster vaccinatie voor geheugen studies (Figuur 1B).</li>
	<li>Na de injectie, elke muis terug te keren naar zijn kooi en bewaar alle de ingespoten muizen op voorwaarde van specifieke pathogenen vrije.</li>
</ol>4. retro-orbitaal bloeden en Serum voorbereiding
<ol><li>Muis sera op verschillende tijdstippen van de oogst: voor TNP-polysaccharide immunisatie, muis sera te verzamelen op dag -7 en 7 (Figuur 1A); verzamelen voor TNP-HC/aluin immunisatie, muis sera op dag -7, 7, 14 en 28 (Figuur 1B).</li>
	<li>Anesthetize voor Retro-orbitaal bloeden, elke muis met 5% Isofluraan gedurende 1-2 min. in een kabinet van bioveiligheid25. Pedaal reflex om ervoor te zorgen voldoende verdoving van elke muis uitvoeren.</li>
	<li>Houd de narcose muis in een hand met de wijsvinger en de duim trekken van de huid rond de oogbol terug, zodat de oogbol uit de socket-25 steekt. Plaats een niet-EDTA Pasteur pipet of capillaire buis onder een hoek van 45° in de binnenste hoek van de oogkas onder de oogbol25.</li>
	<li>Zachte neerwaartse druk uitoefenen en draai de pipet of buis zachtjes te breken in de ader en verzamelen van 150-200 µL bloed in de pipet of buis. Onmiddellijk het bloed overbrengen in een steriele 1,5 mL microfuge buis en de muis terug te keren naar zijn kooi te herstellen.</li>
	<li>Laat het bloed monsters op RT voor 1-2 h zitten te coaguleren.</li>
	<li>Centrifugeer het gestolde bloedmonsters bij 13.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. De duidelijke serum bovenop de bloedklonter overbrengen in een nieuwe steriele 1,5 mL microfuge buis.</li>
	<li>Herhaal stap 4.6 nog een keer te verwijderen van de resterende bloedstolsel en verzamelen de duidelijke serum.</li>
	<li>Aliquot het serum in steriele 1,5 mL microfuge buizen op 50 µL/buis, en op te slaan van de sera bij-80 ° C.</li>
	<li>Het oog voor bloeden op verschillende tijdstippen, zodat elk van beide ogen is bloedde hooguit twee keer voor de hele experiment worden afgewisseld. Bij de terminal bloeden, maximaal 1 mL bloed van elke muis voor euthanasie te verzamelen. De muis met 5% CO2 gevolgd door cervicale dislocatie euthanaseren. Opmerking: Milt B cellen kunnen worden geoogst voor stroom cytometrische analyses en in vitro cultuur studies. Wij bereiden ook genomic DNA van splenocytes om te controleren of het genotype van elke muis.</li>
</ol>5. muis Ig Isotype-specifieke ELISA
<ol><li>
Bereiden de buffers en oplossingen voor ELISA.
	<ol>
<li>Het bereiden van 500 mL koppeling Buffer (PBS, pH 7.4).</li>
		<li>Bereiden van Wash 500 mL (PBS-T (0,05% Tween-20), pH 7.4).</li>
		<li>Bereiden van 100 mL Buffer blokkeren (1% BSA in PBS, pH 7.4, opgeslagen bij 4 ° C).</li>
		<li>Bereiden 1 L voor substraat Buffer (1 M diethanolamine, pH 9,8 (97 milliliters diethanolamine in 1 L H2O, pH aangepast met behulp van 10 M HCl) en 0,5 mM MgCl2). De Buffer substraat beschermen tegen licht door inwikkeling van de fles met aluminiumfolie. Bewaren bij 4 ° C.</li>
		<li>100 mL eindeoplossing (3 M NaOH) voor te bereiden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Coat de ELISA-plaatjes:
	<ol>
<li>Voor de totale serum Ig isotype ELISA, jas 96-Wells immuno platen met 10 µg/mL isotype-specifieke polyklonale geit-antimuis Ig vastleggen (M, G1, G2a, G2b, G3, A of E) Abs in koppeling Buffer (PBS) op 100 µL per putje.</li>
		<li>Jas voor TNP-specifieke Ig isotype ELISA, immuno 96-wells-platen met 10 µg/mL TNP(38)-BSA in PBS op 100 µL per putje.</li>
		<li>Jas voor hoge affiniteit TNP-specifieke Ig isotype ELISA, immuno 96-wells-platen met 10 µg/mL TNP(3)-BSA in PBS op 100 µL per putje26. Incubeer de platen bij 4 ° C's nachts.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na een incubatieperiode van de coating, het wassen van de platen 2 keer met 200 µL per putje van PBS-T. Negeren van de Wash-Buffer en de vlek de platen (tik elke plaat ondersteboven op een stapel papieren handdoeken) droog na elke wasbeurt.</li>
	<li>Blokkeren van de platen: toevoegen van 200 µL per putje van blokkeren (1% BSA in PBS) Buffer in de gecoate platen en Incubeer de platen gedurende 1 uur op RT.</li>
	<li>
Terwijl de platen blokkeren, maak verdunningen van Ig isotype normen en serummonsters in Buffer blokkeren in een aparte, onbehandelde 96-wells-plaat duikt met 150 µL per putje.
	<ol>
<li>Bereiden van 250 ng/mL Ig isotype normen als de standaard beginconcentratie (St01) en 7 tot en met 10 van de seriële verdunningen 1:2 van de Ig-normen (St02 St07 of St10, Figuur 2).</li>
		<li>Bereiden muis serum monsters bij een verdunning 1:100 of 1:500 factor als de startende verdunning en 3 of 4 van 1:10 seriële verdunningen voor totale Ig isotype of 1:5 seriële verdunningen voor TNP-specifieke Ig isotype van elk serummonster(Figuur 2). IgE ELISA, bereiden serummonsters van de muis op een 1:2 verdunningsfactor als de startende verdunning en 3 1:5 seriële verdunningen voor elk serummonster maken.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Na het blokkeren, was de platen uit stap 5.4 driemaal met 200 µL per putje van PBS-T en vlek droog de platen na elke wasbeurt.</li>
	<li>100 µL per putje van verdunde Ig isotype normen (geschikt voor het vastleggen en detectie Abs) en verdund serummonsters van stap 5.5 overbrengen aan de platen bereid in stap 5.6. Incubeer de platen aan de normen en de monsters bij 4 ° C's nachts.</li>
	<li>Spoel de platen 3 keer met 200 µL per putje van PBS-T en vlek droog de platen na elke wasbeurt.</li>
	<li>In elke plaat, voeg 100 µL per putje van 10 µg/mL van een geschikte alkalisch fosfatase (AP)-geconjugeerd isotype-specifieke geit-antimuis Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A of E) Abs verdund in Buffer blokkeren.</li>
	<li>Incubeer de platen met AP-geconjugeerde Abs voor 1-2 h op RT. Voor de detectie van de IgE, Incubeer de platen gedurende 1-2 uur bij 37 ° C.</li>
	<li>1 mg/mL substraat oplossing voor te bereiden door het oplossen van twee tabletten van 5 mg fosfatase substraat in 10 mL substraat Buffer.</li>
	<li>Wassen van elke plaat 5 keer met 200 µL per putje van PBS-T en vlek drogen de platen na elke wasbeurt.</li>
	<li>Voeg 100 µL per putje van substraat oplossing in elke plaat. Laat de reactie te ontwikkelen op RT, wat gewoonlijk slechts een paar minuten duurt.</li>
	<li>
Lees elke plaat op 405 nm met behulp van een microplate-lezer met de bijbehorende software.
	<ol>
<li>Klik op "instellingen" om de golflengten "Lm1" op "405 nm" en klik "OK".</li>
		<li>Klik op 'sjabloon' om 'leeg' wells, "normen" wells en "onbekend" putten volgens de 96-wells-plaat setup te wijzen.</li>
		<li>"Normen" de wells, klikt u op "serie" om de "Eerste steekproef"als"St01", selecteer "Beginnen bij" aan "Top", en "repliceert" als "2". Controleren"Monster Descriptor", en invoergegevens naar "Standaardwaarde": Selecteer "eenheden"als"ng/mL", "Starting waarde" als "250", "Step by" als "2" ingesteld. Klik op "OK".</li>
		<li>Klik op "Lezen" om te lezen van de plaat als de meest standaard bereikt geconcentreerde een optische dichtheid (OD) van ~ 1.</li>
		<li>Klik op het menu "bestand" en klik op "Opslaan" om het bestand te slaan.</li>
		<li>Klik op "Lees" om te lezen van de plaat weer als de meest geconcentreerde standaard OD405 ~ 1,5, of 2, 2.5, respectievelijk overbelast.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zet de reactie stop door 25 µL per putje van 3 M NaOH toe te voegen. Voer stappen 5.12 tot 5.15 voor een plaat op een moment.</li>
	<li>
ELISA gegevens met behulp van de software gekoppeld aan de lezer microplate analyseren:
	<ol>
<li>Controleer de waarden van de OD405 van de Ig isotype normen voor lees-bestanden en selecteer een passende lezing met goede lineaire spreiding van de normen voor gedetailleerde gegevensanalyse.</li>
		<li>Selecteer het programma van de 4-Parameter montage standaard curven uitzetten. Controleer het co-efficiënt van de standaard curve (R2), die vereist is om te worden > 0.98 om van goede gegevenskwaliteit te waarborgen.</li>
		<li>Controleer of de OD405-waarden van elk monster afnemen met toenemende verdunningsfactoren. De concentratie van alle putjes van de verdunde monster ophalen door te klikken op "Onbekenden".</li>
		<li>Selecteer een passende waterput van elk monster met OD405 in het lineaire bereik van de Ig isotype standaard curve voor de berekening van de concentratie.</li>
		<li>Berekenen van het serum Ig isotype concentratie van elk monster met behulp van de formule: serum Ig concentratie = geselecteerde goed concentratie x verdunningsfactor.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plot de grafieken en het uitvoeren van statistische analyses met behulp van een geschikte software9,10,11. Maak verticale scatter percelen van serum Ig isotype niveaus te vergelijken van de Ig-reacties in de hetzelfde tijdstip. Zorg voor TD geheugen reactie studies, de tijdsverloop respons curves te onderzoeken van de Ig isotype reacties vóór en na de booster immunisatie. Gebruik foutbalken wilt weergeven van de standaarddeviatie (SD) van elke groep van monsters. Om te vergelijken Ig isotype reacties tussen twee genotypen van muizen, gebruiken de ongepaarde t -test voor tweezijdige gegevens om te bepalen van de statistische significantie. De p waarde < 0.05 als aanzienlijk verschillende instellen</li>
</ol>

De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.

Hier beschrijven we het protocol voor de karakterisatie van TD en TI Ig isotype reacties in muizen met behulp van ELISA. Succesvolle uitvoering van dit protocol vereist het gebruik van stoffen genoemd in tabel 1, waaronder assay ELISA-plaatjes, immunisatie Ags, muis Ig isotype-specifieke antilichamen en normen. Zorg moet worden genomen om te voorkomen met behulp van weefselkweek behandeld platen voor ELISA. Verdunningen van de normen en serummonsters moeten worden gedaan in afzonderlijke onbehandelde pla...

B-lymfocyten zijn de belangrijkste speler in de Humorale immuniteit en het enige celtype in zoogdieren die produceren antilichamen kunnen, ook aangeduid als immunoglobulinen (Ig)1,2. Antilichamen uitgescheiden door B-cellen zorgen voor een formidabele verdediging tegen invasie ziekteverwekkers via diverse mechanismen, met inbegrip van neutralisatie, opsonization en activering van de aanvulling, wat leidt tot protectieve immuniteit3. Secretie van antilichamen door B-cellen wordt alleen bereikt na volledige activering van bepaalde B-cellen, die normaal gesproken vereist dat twee verschillende signalen3. Signaal 1 doorgegeven door directe binding van het antigeen (Ag) naar de B-cel receptor (BHG) uitgedrukt op het oppervlak van specifieke naïef B cellen3. Afhankelijk van de bron van signaal 2, kan B-cel-activatie worden onderverdeeld in zwezerik-afhankelijke (TD) of zwezerik-onafhankelijke (TI)3,4. In een reactie TD antigeen wordt signaal 2 verzorgd door geactiveerde cognaat CD4 T helper (TH) cellen, die express CD154, de ligand voor de co-stimulatory receptor interactie CD40 uitgedrukt op B cellen1,2,3. In een reactie TI antigeen signaal 2 komt uit beide betrokkenheid van Toll-like receptoren (TLRs in het geval van type 1 TI Ag) of uitgebreide cross-linking van de BCRs (in het geval van type 2 TI Ag) op de B cellen3,4. Type 1 TI (TI-1) antigenen zijn microbiële liganden van TLRs, met inbegrip van bacteriële lipopolysacchariden (LPS), virale RNAs, en microbiële CpG DNA4,5. Type 2 TI (TI-2) antigenen zeer repetitieve structuur hebben, en zijn in staat om langdurige en voortdurende signalering naar de B-cel door meerdere cross-linking van de BCRs4,6. Typische voorbeelden van TI-2 antigenen zijn pneumokokken polysacchariden en hapten-geconjugeerde polysaccharide6,7. Zowel TD en TI antigenen robuuste antigeen-specifiek IgM reacties kunnen uitlokken en kunnen ook leiden tot de productie van isotype-switched antilichamen (IgG, IgA en IgE) met de hulp die geboden door antigeen presentatie van cellen (APCs) zoals dendritische cellen (DC's)1 ,2,3. Bovendien zowel TD en TI antigenen kunnen ertoe geheugen reacties met behulp van APCs, maar TD antigenen zijn efficiënter in inducerende geheugen B-cel generatie3,8.
In dit protocol zijn TD en TI Ig reacties ontlokte bij muizen door intraperitoneaal (i.p.) immunisatie met hapten-geconjugeerde model antigenen 2,4,6-trinitrophenyl-sleutelgat limpet hemocyanine (TNP-HC) en TNP-polysaccharide (neutraal, sterk vertakt en hoge-massa), respectievelijk9,10,11. TD-antigenen zijn het meestal gebruikt met adjuvans ter verbetering van de productie van antilichamen12. Hier in ons protocol, wordt TNP-HC geïnjecteerd met aluin, een veelgebruikte adjuvans in immunisatie studies12. Andere voorbeelden van hulpstoffen die kunnen worden gebruikt zijn volledig of onvolledig Freund van adjuvans (CFA- of IFA), monophosphoryl-lipide-A / trehalose dicorynomycolate ("Ribi" adjuvans), en apr oligodeoxynucleotides, etc.13, 14. na immunisatie, muis sera op verschillende tijdstippen worden geoogst en TNP-specifieke antistoffen in sera worden gekwantificeerd aan de hand van Ig isotype-specifieke enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)9,10, 11.
ELISA is een plaat gebaseerde test die wijd is gebruikt als kenmerkend hulpmiddel in geneeskunde en ook als een analytisch hulpmiddel in biomedisch onderzoek15,16. Het wordt gebruikt voor het detecteren en kwantificeren van de analyten met inbegrip van antilichamen, hormonen, cytokinen, chemokines, en verschillende antigenen, enz. ELISA kan worden uitgevoerd in verschillende indelingen, met inbegrip van directe, indirecte, sandwich en competitieve ELISA15,16. In het algemeen, het gaat om de immobilisatie van het antigeen op een effen oppervlak, meestal een 96-wells microtiterplaat plaat, die is geïncubeerd met een primair antilichaam. Na incubatie is het unbound antilichaam weggewassen. In een directe ELISA, is het primaire antilichaam direct geconjugeerd met een enzym (meestal mierikswortelperoxidase of alkalische fosfatase), die een chromogenic substraat klieven kan om de opbrengst van een zichtbare kleurverandering gedetecteerd door een signaal-detectie-instrument, zoals een spectrofotometer15,16. Daarentegen als een enzym-verbonden secundair antilichaam wordt gebruikt voor het binden van het primaire antilichaam, wordt dan dit beschouwd als een indirecte ELISA15,16. Directe ELISA is sneller terwijl indirecte ELISA gevoeliger15,16 is. De platen zijn bekleed met een "capture" antilichaam gebruikt om te immobiliseren van het antigeen van belang in de monsters in een sandwich-ELISA, en vervolgens het vastgelegde antigeen kan worden opgespoord door een andere "" detectieantilichaam in een directe of indirecte wijze15, 16. Sandwich-ELISA biedt hoge specificiteit aangezien het antigeen wordt gedetecteerd door twee verschillende antilichamen van het antigeen. De competitie is gevestigd tussen de monster-antigeen en het plaat-gebonden antigeen voor de binding met het primaire antilichaam in een competitieve ELISA, en vervolgens de concentratie van antigeen in de steekproef wordt gekwantificeerd door het meten van de afname van het signaal van het substraat 15 , 16. competitieve ELISA kan worden uitgevoerd met behulp van de hierboven genoemde directe of indirecte indeling en is nuttig voor het opsporen van kleine antigenen met slechts één epitoop15,16.
Alternatieve technieken voor het meten van antilichamen omvatten radio-immunoassay (RIA), electrochemiluminescence (ECL) assay en oppervlak plasmon resonantie (SPR) assay17. RIA was de eerste immunoassay ontwikkeld dat maatregelen de aanwezigheid van een antigeen (of antilichaam) met hoge specificiteit en de gevoeligheid met behulp van radiolabeled reagentia18,19. Echter, als gevolg van de bezorgdheid van radioactieve toxiciteit, verwijderingskosten, houdbaarheid en speciale licenties te werken met radioactieve materialen, ELISA is een betere en meer handige techniek voor common gebruikt20,21. ECL is een hooggevoelige test waarin chemiluminescentie reacties worden gestart met behulp van elektriciteit te genereren zeer reactieve soorten uit stabiele precursoren op het oppervlak van een elektrode, en kunnen worden gebruikt voor het meten van de hoeveelheid analyten (zoals antigenen of antilichamen)22. Echter, ECL vereist een speciaal instrument en dus is niet zo breed gebruikt als ELISA23. SPR is een directe test die kan worden gebruikt voor het meten van de binding van liganden (bv., antilichamen) aan geïmmobiliseerd moleculen (bv., antigenen) op een sensor chip oppervlakte24. SPR detecteert de interacties in real-time heel concreet en vereist niet het gebruik van gelabelde reagentia zoals in ELISA. Echter, SPR ook vereist dat een speciale apparatuur en lagere gevoeligheid dan ELISA17heeft. Gezien de beperkingen van de alternatieve methoden, is ELISA de meest geschikte en handige techniek voor ons doel in dit protocol. Hier beschrijven we het gebruik van sandwich-ELISA voor de analyse van de totale Ig isotype-niveaus en de procedures van indirecte ELISA voor de analyse van antigeen-specifieke Ig isotypes.

<table><tbody><tr><td>VersaMax Tunable Microplate Reader</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>VERSAMAX</td><td>Equipment om de platen te lezen</td></tr><tr><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>Software voor de platenlezer</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>Software voor grafieken en statistieken</td></tr><tr><td>TNP-AECM-polysaccharide (FICOLL)</td><td>Biosearch Technologies</td><td>F-1300-10</td><td>Een TI Ag voor immunisatie</td></tr><tr><td>TNP-KLH</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5060-5</td><td>Een TD Ag voor immunisatie</td></tr><tr><td>TNP(38)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10 (conjugatieratio: 38)</td><td>Coating Ag voor TNP-specifieke ELISA</td></tr><tr><td>TNP(3)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10 (conjugatieratio: 3)</td><td>Coating Ag voor hoog affiniteit TNP-specifieke Ig</td></tr><tr><td>Imject Alum</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>PI-77161</td><td>Alum adjuvant voor immunisatie</td></tr><tr><td>Falcon Polypropylene tubes</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-959-11A</td><td>Voor incubatie van TNP-KLH/alum</td></tr><tr><td>BD Insulin Syringe</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-829-1B</td><td>Voor i.p. injectie van muizen</td></tr><tr><td>Immuno 96-Well Plates, Flat-Bottom</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-245-61</td><td>Voor ELISA</td></tr><tr><td>Untreated 96-Well Microplates, Round-Bottom</td><td>VWR</td><td>82050-622</td><td>Voor seriële verdunningen van standaarden en monsters</td></tr><tr><td>Phosphatase substrate, 5 mg Tablets</td><td>Sigma</td><td>S0942-200TAB</td><td>AP substraat</td></tr><tr><td>Diethanolamine</td><td>VWR</td><td>IC15251690</td><td>Een component van AP substraatbuffer</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-01</td><td>Capture Ab voor muis IgM</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-01</td><td>Capture Ab voor muis IgG1</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-01</td><td>Capture Ab voor muis IgG2a</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-01</td><td>Capture Ab voor muis IgG2b</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-01</td><td>Capture Ab voor muis IgG3</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-01</td><td>Capture Ab voor muis IgA</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-01</td><td>Capture Ab voor muis IgE</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-04</td><td>Detectie Ab voor muis IgM</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-04</td><td>Detectie Ab voor muis IgG1</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-04</td><td>Detectie Ab voor muis IgG2a</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-04</td><td>Detectie Ab voor muis IgG2b</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-04</td><td>Detectie Ab voor muis IgG3</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-04</td><td>Detectie Ab voor muis IgA</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-04</td><td>Detectie Ab voor muis IgE</td></tr><tr><td>Mouse IgM standard</td><td>BD Biosciences</td><td>553472</td><td>TNP-specifiek IgM, Clone&nbsp; G155-228</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 standard</td><td>BD Biosciences</td><td>554054</td><td>TNP-specifiek IgG1, Clone&nbsp; 107.3</td></tr><tr><td>Mouse IgG2a standard</td><td>BD Biosciences</td><td>556651</td><td>TNP-specifiek IgG2a, Clone&nbsp; G155-178</td></tr><tr><td>Mouse IgG2b standard</td><td>BD Biosciences</td><td>554055</td><td>TNP-specifiek IgG2b, Clone&nbsp; 49.2</td></tr><tr><td>Mouse IgG3 standard</td><td>BD Biosciences</td><td>553486</td><td>KLH-specifiek IgG3, Clone&nbsp; A112-3</td></tr><tr><td>Mouse IgA standard</td><td>BD Biosciences</td><td>550924</td><td>Mineralolie-geïnduceerde IgA, Clone&nbsp; MOPC-320</td></tr><tr><td>Mouse IgE standard</td><td>BD Biosciences</td><td>557079</td><td>TNP-specifiek IgE, Clone&nbsp; C38-2</td></tr></tbody></table>

karakterisering van zwezerik-afhankelijke en thymus-onafhankelijke immunoglobulin isotype reacties in muizen met behulp van enzyme-linked immunosorbent assay

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antilichamen, ook wel genoemd zoals immunoglobulinen (Ig), uitgescheiden door B-lymfocyten, plasmablasts/plasmacellen, Humorale immuniteit gedifferentieerde bieden een formidabele verdediging tegen invasie ziekteverwekkers via diverse mechanismen. Een belangrijk doel van vaccinatie is voor het opwekken van beschermende antigeen-specifieke antilichamen om levensbedreigende infecties te voorkomen. Zowel zwezerik-afhankelijke (TD) en zwezerik-onafhankelijke (TI) antigenen robuuste antigeen-specifiek IgM reacties kunnen uitlokken en ook de productie van isotype-switched antilichamen (IgG, IgA en IgE) kunnen veroorzaken evenals de generatie van geheugencellen B met behulp geboden door antigeen presentatie van cellen (APCs). Hier beschrijven we een protocol karakteriseren TD en TI Ig isotype reacties in muizen met behulp van de enzym-verbonden immunosorbent analyse (ELISA). In dit protocol, zijn TD en TI Ig reacties ontlokte bij muizen door intraperitoneaal (i.p.) immunisatie met hapten-geconjugeerde model antigenen TNP-HC (in aluin) en TNP-polysaccharide (in PBS), respectievelijk. Om te induceren TD geheugen reactie, wordt een booster immunisatie van TNP-HC in aluin gegeven op 3 weken na de eerste immunisatie met de dezelfde antigen/adjuvant. Muis sera worden geoogst op verschillende tijdstippen vóór en na immunisatie. Totaal serum Ig niveaus en TNP-specifieke antilichamen zijn vervolgens gekwantificeerd aan de hand van Ig isotype-specifieke Sandwich en indirecte ELISA, respectievelijk. Om correct kwantificeren de serumconcentratie van elke Ig isotype, moeten de monsters op passende wijze te passen binnen het lineaire bereik van de standaard curven worden verdund. Met behulp van dit protocol, hebben wij consequent betrouwbare resultaten verkregen met hoge specificiteit en de gevoeligheid. Wanneer gebruikt in combinatie met andere aanvullende methoden, zoals de stroom cytometry, in vitro cultuur van milt B-cellen en immunohistochemische zal kleuring (IHC), dit protocol toestaan onderzoekers een uitgebreide inzicht van antilichaam Reacties in een bepaalde experimentele setting.

Dit protocol hebben we gebruikt om te onderzoeken van de rollen van een kritische regulator van het immuunsysteem, de TRAF3, in TI en TD Ig isotype reacties9,10,11. TRAF3 direct of indirect regelt de signaaltransductie van een aantal aangeboren en adaptieve immuun receptoren, met inbegrip van de TNF receptor superfamilie, Toll-like receptoren en T cel receptor/CD28, o.a.27...

In deze paper beschrijven we een protocol karakteriseren T-afhankelijke en T-onafhankelijke immunoglobulin (Ig) isotype reacties in muizen met behulp van ELISA. Deze methode gebruikt alleen of in combinatie met stroom cytometry onderzoekers te identificeren van verschillen in de B-cel-gemedieerde Ig isotype reacties in muizen na T-afhankelijke en T-onafhankelijke antigeen immunisatie zal toestaan.

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van immunologie over door antigeen geïnduceerde afhankelijke en onafhankelijke antilichaamreacties, evenals B-cel activering en germinatieve centrumreacties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het betrouwbare en kwantitatieve Ig isotyperesponsmetingen biedt met een directe vergelijking van B-cel activering en humorale immuniteit bij muizen. Voor TNP-polysaccharid-immunisatie, belad een milliliter insulinesyringe per muis met 100 microliter vers bereide antigeenoplossing en steek de naald in de onderste rechterkwadrant van elk dier onder een hoek van ongeveer 30 graden om injectie in de onderste organen te voorkomen.Wanneer alle muizen zijn geïnjecteerd, breng de dieren terug naar hun kooien voor huisvesting in een specifiek ziektevrij centrum. Verzamel op de juiste experimentele tijdstippen 150 tot 200 microliter bloed van elk geïmmuniseerd dier door retro-orbitale bloeding en laat de monsters één tot twee uur bij kamertemperatuur stollen. Aan het einde van de incubatie, centrifugeer de gestolde bloedmonsters en breng het heldere serum vanaf de bovenkant van elk bloedstolsel over in een st

characterization-thymus-dependent-thymus-independent-immunoglobulin

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

This video demonstrates a method for assessing the antibody immune response to a novel nanoemulsion adjuvant vaccine in pre-immunized mice. Immunization enhances antibody response as confirmed by determining the IgG antibody titers.

Measuring Immunoglobulin G Levels Against a Test Vaccine in a Mouse Serum

Met effector functies te onderscheiden van andere T-cel subsets, zijn Th17 cellen centraal zijn betrokken bij inflammatoire auto-immuniteit. Deze in vitro Th17 differentiatie protocol verschaft een middel om te bepalen of naïeve CD4 + T-lymfocyten kunnen differentiëren in Th17 cellen en hun rol bij auto-immuniteit en gastheerrespons verder te onderzoeken.

Isolatie en Th17 Differentiatie van naïeve CD4 T-lymfocyten

Hier beschrijven we een efficiënte methode voor isolatie, identificatie en zuivering van muizen thymus epitheelcellen (TEC). Het protocol kan worden gebruikt voor studies van thymus functie voor normale T-cel ontwikkeling, thymus en T cel reconstitutie.

Isolatie, identificatie en zuivering van Muriene thymus epitheelcellen

In vitro analyse van klasse-switch recombinatie bij muizen is uitdagend vanwege cytofiele IgE-moleculen die gebonden zijn aan Fc-receptoren op het oppervlak van B-cellen.  We beschrijven een methode voor IgE-detectie door middel van trypsine-gemedieerde splitsing van oppervlakte-gebonden IgE vóór fixatie en permeabilisatie voor cytoplasmatische fluorescentiekleuring.

Detectie van True IgE-expressie muis B Lineage Cellen

Dit rapport geeft een gedetailleerde beschrijving van het verplanten van murine thymussen van donormuizen van verschillende leeftijden onder de niercapsule van immuungecompromitteerde muizen als ontvangers. Het doel van deze aanpak is om T-celontwikkeling en thymische selectiegebeurtenissen in vivo te modelleren.

Isolatie en Transplantatie van verschillende Aged Muriene Thymic Enten.

Naïve CD4+ T-cellen polariseren naar verschillende subsets, afhankelijk van de omgeving op het moment van activering.  De differentiatie van naïve CD4+ T-cellen naar verschillende effector-subsets kan in vitro worden bereikt door de toevoeging van T-celreceptor-stimuli en specifieke cytokine-signalen.

Muis Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; T Cell Isolatie en<em&gt; In vitro</em&gt; Differentiatie in T cel subsets

Dit artikel beschrijft in vivo en in vitro methodologie om de thymische vestigingsprogenitors te karakteriseren door de analyse van de kinetiek van generatie, fenotype en aantallen van hun T-cel nakomelingen.

Karakterisering van Thymic Settling voorouders in de Mouse Embryo behulp<em&gt; In Vivo</em&gt; En<em&gt; In Vitro</em&gt; Testen

Een geoptimaliseerd protocol wordt gepresenteerd voor de generatie van monoklonale antilichamen op basis van de hybridoma-technologie. Muizen werden geïmmuniseerd met een immunoconjugaat. Miltcellen werden gefuseerd door PEG en een elektrische impuls met onsterfelijke myeloomcellen. Antilichaam-producerende hybridoma-cellen werden geselecteerd door HAT en antigeen-specifiek ELISA-screening.

Genereren van monoklonale muizenantilichamen door Hybridoma Technology

In deze studie presenteren we een roman en effectieve protocol voor de isolatie van lymfocyten van Peyer van Patches (PPs), die vervolgens kunnen worden gebruikt voor in vivo en in vitro Functionele assays evenals stroom cytometrische studies van folliculaire T helper en germinal center B cellen.

Ontrafeling van de hoofdrolspelers van de Humorale immuniteit: geavanceerde en geoptimaliseerd lymfocyt isolatie Protocol van RattenUitrustingen Peyer van Patches

We beschrijven hierin een eenvoudige analyse van de heterogeniteit van het muriene immuun B-celcompartiment in het peritoneum, milt en beenmergweefsel door middel van flowcytometrie. Het protocol kan worden aangepast en uitgebreid naar andere muizenweefsels.

Flowcytometrische karakterisering van de ontwikkeling van murine B-cellen

We bieden een gedetailleerd protocol voor het isoleren en identificeren van zeldzame antigeenspecifieke T-celpopulaties in muizenlongen door middel van T-celverrijking op basis van magnetische kralen en peptide:major histocompatibility complex (MHC)-tetrameren.

Identificatie van zeldzame antigeenspecifieke T-cellen uit muizenlongen met peptide: belangrijke histocompatibiliteitscomplextetrameren

Leer hoe u T-afhankelijke en T-onafhankelijke immunoglobuline-isotype-responsen in muizen karakteriseert met ELISA. Deze methode biedt betrouwbare kwantitatieve metingen van B-celactivatie en humorale immuniteit.

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay (Video) | JoVE Journal

Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Meer video's verkennen