Karakterisering van zwezerik-afhankelijke en Thymus-onafhankelijke Immunoglobulin Isotype reacties in muizen met behulp van Enzyme-linked Immunosorbent Assay
7 september 2018
In deze paper beschrijven we een protocol karakteriseren T-afhankelijke en T-onafhankelijke immunoglobulin (Ig) isotype reacties in muizen met behulp van ELISA. Deze methode gebruikt alleen of in combinatie met stroom cytometry onderzoekers te identificeren van verschillen in de B-cel-gemedieerde Ig isotype reacties in muizen na T-afhankelijke en T-onafhankelijke antigeen immunisatie zal toestaan.
Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvragen op het gebied van immunologie over door antigeen geïnduceerde afhankelijke en onafhankelijke antilichaamreacties, evenals B-cel activering en germinatieve centrumreacties. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het betrouwbare en kwantitatieve Ig isotyperesponsmetingen biedt met een directe vergelijking van B-cel activering en humorale immuniteit bij muizen. Voor TNP-polysaccharid-immunisatie, belad een milliliter insulinesyringe per muis met 100 microliter vers bereide antigeenoplossing en steek de naald in de onderste rechterkwadrant van elk dier onder een hoek van ongeveer 30 graden om injectie in de onderste organen te voorkomen.
Wanneer alle muizen zijn geïnjecteerd, breng de dieren terug naar hun kooien voor huisvesting in een specifiek ziektevrij centrum. Verzamel op de juiste experimentele tijdstippen 150 tot 200 microliter bloed van elk geïmmuniseerd dier door retro-orbitale bloeding en laat de monsters één tot twee uur bij kamertemperatuur stollen. Aan het einde van de incubatie, centrifugeer de gestolde bloedmonsters en breng het heldere serum vanaf de bovenkant van elk bloedstolsel over in een steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuis.
Na een tweede centrifugatie om eventueel restant bloedstolsel te verwijderen, breng 50 microliter serum over in afzonderlijke steriele 1,5 milliliter microcentrifugebuizen voor opslag bij min 80 graden Celsius. Voor het plateren, coat individuele 96-well immunoplates met de juiste concentratie van muis Ig isotype specifieke capturende antilichamen voor totaal serum Ig isotype TNP-38BSA antigeen voor TNP-specifiek Ig isotype of TNP-3BSA antigeen voor hoog affiniteit TNP-specifiek Ig isotype en incubeer de gecoate platen een nacht bij vier graden Celsius. De volgende ochtend was de platen twee keer met 200 microliter wasbuffer per putje.
Gooi de wasbuffer weg en droog de platen af op een stapel papieren handdoeken na elke wasbeurt. Blokkeer vervolgens de platen met 200 microliter blokkeerbuffer per putje voor een incubatie van een uur bij kamertemperatuur. Terwijl de platen worden geblokkeerd, bereid de juiste standaard- en serumverdunningen en blokkeerbuffer voor in een aparte onbehandelde 96-well plaat bij 150 microliter per putje zoals aangegeven.
Was vervolgens de ELISA-plaat met wasbuffer zoals gedemonstreerd en voeg 100 microliter van elke verdunde Ig isotype standaard en serummonster toe aan de juiste putjes van de ELISA-plaat. Na een overnachtelijke incubatie bij vier graden Celsius, was de platen zoals gedemonstreerd en voeg 100 microliter van een geschikte alkalische fosfatase geconjugeerde isotype-specifieke antilichaam verdund in blokkeerbuffer toe aan elke put voor een incubatie van een tot twee uur bij kamertemperatuur. Aan het einde van de incubatie, was de platen en voeg 100 microliter vers bereide substraatoplossing toe aan elke put.
Bewaak de reactie terwijl deze zich ontwikkelt over de volgende paar minuten bij kamertemperatuur. Wanneer de reactie robuust genoeg is om te analyseren, plaats de plaat in een microplaatlezer en klik op instellingen om de golflengte in te stellen op 405 nanometer. Klik op ok en klik vervolgens op sjabloon om de juiste lege, standaard en onbekende putjes toe te wijzen volgens de indeling van de 96-well plaat.
Vervolgens, wanneer de meest geconcentreerde standaard een optische dichtheid van ongeveer één, 1,5, twee en 2,5 bereikt, klik op lezen om de plaat te lezen en sla het resulterende databestand op na elke analyse. Bij afwezigheid van immunisatie, wordt een toename in basale serumniveaus van IgM, IgG2a, IgG2b, IgG3 en IgA waargenomen bij B-cel specifiek TNF receptor geassocieerd factor drie of B-TRAF3 knockout muizen, vergeleken met geslacht en leeftijd gematchte B-TRAF3 voldoende nestgenoot controledieren. Zeven dagen na immunisatie met TNP-polysaccharid of TNP-KLH, zoals zojuist gedemonstreerd, toont analyse van de thymus-onafhankelijke Ig isotyperespons op immunisatie significant hogere thymus-onafhankelijke TNP-specifieke IgG3 niveaus evenals verhoogde thymus-afhankelijke TNP-specifieke IgG2b niveaus in myeloide cel-specifieke TRAF3 knockout muizen vergeleken met nestgenoten controles.
Bovendien, evaluatie van thymus-afhankelijke muis primaire en geheugenrespons op TNP-KLH immunisatie geeft de aanwezigheid aan van gedeeltelijk verminderde thymus-afhankelijke IgM primaire respons en defecte IgG1 primaire en geheugenrespons in T-cel specifiek TRAF3 knockout muizen. Bij het uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om te onthouden dat ELISA detectielimieten heeft die meestal worden gedefinieerd door het lineaire bereik van de standaardcurven en daarom kunnen meerdere verdunningen van uw monster vereist zijn. Na het volgen van deze procedure kunnen andere complementaire methoden zoals flowcytometrie of L spot worden uitgevoerd om een uitgebreid begrip te krijgen van antilichaamreacties in een bepaalde experimentele setting.
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Dit artikel beschrijft een protocol om T-afhankelijke en T-onafhankelijke immunoglobuline (Ig) isotype-responsen bij muizen te karakteriseren met behulp van ELISA. De methode stelt onderzoekers in staat om verschillen in B-cel-gemedieerde Ig isotype-responsen na antigeen-immunisatie te identificeren.
Belangrijkste studiecomponenten
Wetenschappelijk gebied
- Immunologie
- Antilichaamresponsen
- B-celactivatie
Achtergrond
- Het begrijpen van T-afhankelijke en T-onafhankelijke antilichaamresponsen is cruciaal in de immunologie.
- Het karakteriseren van Ig-isotype-responsen helpt bij het bestuderen van de humorale immuniteit.
- Flowcytometrie kan ELISA aanvullen voor gedetailleerde analyse.
- Betrouwbare metingen van Ig-isotype-responsen zijn essentieel voor onderzoek.
Doel van de studie
- Om een protocol te bieden voor het meten van Ig-isotype-responsen bij muizen.
- Om de B-celactivatie als reactie op verschillende antigenen te vergelijken.
- Om het begrip van immuunresponsen in diverse contexten te verbeteren.
Gebruikte methoden
- ELISA voor het kwantificeren van Ig-isotype-responsen.
- Flowcytometrie voor het analyseren van B-celactivatie.
- Injectie van antigeenoplossing in muizen voor immunisatie.
- Afname van bloedmonsters voor serumanalyse.
Belangrijkste resultaten
- Kwantitatieve metingen van Ig-isotype-responsen zijn uitgevoerd.
- Verschillen in B-celactivatie werden waargenomen op basis van het type antigeen.
- De methode bleek betrouwbaar voor het bestuderen van de humorale immuniteit.
- Heldere serummonsters zijn verkregen voor verdere analyse.
Conclusies
- Het protocol is effectief voor het karakteriseren van antilichaamresponsen.
- Het biedt inzicht in B-cel-gemedieerde immuniteit.
- Deze methode kan worden toegepast in diverse immunologische studies.
Veelgestelde vragen
Relevantie voor de Industrie
Dit protocol stelt biofarmaceutische onderzoekers in staat om thymus-afhankelijke en thymus-onafhankelijke immunoglobuline-isotype-responsen in muismodellen kwantitatief te analyseren, wat mechanisch inzicht biedt in B-celactivatie en humorale immuniteit. Door betrouwbare, isotype-specifieke ELISA-metingen te leveren, ondersteunt het de validatie van targets en voorspellende risicoreductie bij de ontwikkeling van vaccins en immunomodulatoren. De methode verbetert de translationele continuïteit wanneer deze wordt gecombineerd met complementaire assays, zoals flowcytometrie, wat bijdraagt aan go/no-go-beslissingen in vroege discovery-pipelines.
Strategische toepassingen in biofarmaceutisch R&D
Vroege ontdekking & targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Maakt het toetsen van therapeutische hypothesen mogelijk door de kwantificering van antigeenspecifieke IgM- en isotype-gewisselde IgG/IgA/IgE-responsen op thymus-afhankelijke en thymus-onafhankelijke stimuli.
- Operationele waarde: Biedt gestandaardiseerde, reproduceerbare serumantilichaammetingen die de functionele target-engagement en biologische activiteit van immunomodulerende kandidaten verduidelijken.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt portfolio-triage door mechanistische klassen van immunogenen te onderscheiden op basis van isotype-switchingpatronen en de kinetiek van de geheugenrespons.
Screening & Assay-ontwikkeling
- Klaarheid van de assay: Genereert gevalideerde biologische systemen (muissera) met kwantitatieve Ig-isotype-outputs die geschikt zijn voor downstream screeningsworkflows.
- Reproduceerbaarheid: Levert gestandaardiseerde ELISA-procedures met gedefinieerde verdunningsvereisten en controles voor het lineaire bereik, waardoor de consistentie van de assay over verschillende experimenten wordt gewaarborgd.
- Schaalbaarheid: Ondersteunt het hergebruik van het platform voor vergelijkende analyse van antigeenformuleringen, adjuvantia of genetische modellen in immunogeniciteitsscreeningscampagnes.
Translationeel & preklinisch onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Maakt evaluatie van antigeenspecifieke responsen mogelijk in modellen die de menselijke humorale immuniteit weerspiegelen, wat de afstemming van translationele biomarkers ondersteunt.
- Preklinische continuïteit: Verbindt Ig-isotypeprofilering uit de vroege ontdekkingsfase met preklinische validatie via longitudinale serumafname vóór en na immunisatie.
- Risico-gecorrigeerde beslissingen: Informeert de criteria voor verdere ontwikkeling door defecten in isotype-switching (bijv. IgG1) of geheugenresponsen gekoppeld aan specifieke cellulaire pathways (bijv. T-cel TRAF3) te identificeren.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van vroege targetvalidatie via leadidentificatie tot preklinische beoordeling, in het bijzonder voor immunomodulatoren en vaccins waarbij isotype-profilering functionele uitkomsten voorspelt.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothesetoetsing en de verduidelijking van pathways door antigeenblootstelling te koppelen aan gedefinieerde Ig-isotype-signaturen (bijv. TI IgG3 vs. TD IgG2b).
- Screening: Levert assay-klare, kwantitatieve resultaten met een hoge specificiteit en gevoeligheid, waardoor een betrouwbare vergelijking van het immunogene potentieel tussen kandidaten mogelijk is.
- Analytica: Biedt op optische dichtheid gebaseerde metingen bij 405 nm die zijn geïnterpoleerd vanuit standaardcurves, wat statistische vergelijking van antilichaamtiters tussen groepen mogelijk maakt.
- Translationeel onderzoek: Sluit aan bij preklinische continuïteit door longitudinale tracking van primaire responsen en geheugenresponsen mogelijk te maken, wat cruciaal is voor de evaluatie van vaccinkandidaten.
- Hergebruik binnen de organisatie: Vestigt een herbruikbare tool voor immunologische profilering die toepasbaar is op meerdere projecten waarbij B-cel-gemedieerde responsen betrokken zijn.
Operationele impact & impact op de organisatie
- Wetenschappelijke waarde: Verhoogt het voorspellend vertrouwen in targetvalidatie door mechanistische ambiguïteit in B-cel-activatiepaden te verminderen.
- Operationele waarde: Waarborgt standaardisatie en reproduceerbaarheid via gedefinieerde serumverdunningsprotocollen en ELISA-optimalisatiestappen.
- Strategische waarde: Verbetert de go/no-go-besluitvorming door isotypeprofielen te koppelen aan functionele immuunuitkomsten, waardoor biologische risico's in een laat stadium worden verminderd.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van kandidaten mogelijk op basis van hun vermogen om de gewenste isotype-switched en geheugenresponsen op te wekken.
Overwegingen bij de implementatie
- Vereist expertise in murine immunologie, de verwerking van serum en de optimalisatie van ELISA om nauwkeurige kwantificering binnen het lineaire bereik van standaardcurven te waarborgen.
- Afhankelijk van toegang tot microplaatlezers, incubatoren, centrifuges en steriele weefselkweekfaciliteiten voor de verwerking van serum en de uitvoering van de assay.
- Vereist cross-team standaardisatie van het tijdstip van monstername, bloedafnametechnieken (bijv. retro-orbitaal) en bewaarcondities (−80 °C) om de data-integriteit te behouden.
- Vereist aanpassingen bij uitbreiding naar verschillende muisstammen, antigenen (bijv. TNP-KLH vs. TNP-polysacharide) of adjuvant-systemen (alum vs. PBS).
- Praktische beperking: Seriële verdunning van monsters is vaak noodzakelijk om verzadiging van het signaal te voorkomen en nauwkeurige interpolatie uit standaardcurven te garanderen, wat de benodigde handmatige tijd verhoogt.
Veelgestelde vragen over biopharma
Chapters in this video
0:04
Title
0:43
2,4,6-Trinitrophenyl (TNP)-polysaccharide and TNP-keyhole Limpet Hemocyanin (KLH) Immunization and Serum Preparation
1:54
Enzyme-linked Immunosorbent Analysis (ELISA)
4:17
Results: Representative Thymus-independent (TI) and Thymus-dependent (TD) Ig Isotype responses to TNP-polysaccharide and TNP-KLH Immunization
5:36
Conclusion
