Een snelle beeld-gebaseerde bacteriële virulentie Assay met behulp van Amoeba

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van sleutelvraagstukken in het veld van bacteriële pathogenese, zoals wanneer gastheer-dodende virulentie-effectoren worden uitgedrukt in bacteriële cellen, en wat zijn de virulentietoestanden van aan het oppervlak gehechte implantonische cellen? Het grote voordeel van deze techniek is dat het snel, kwantitatief is en dat de gastheercellen relatief gemakkelijk te hanteren zijn. We kregen het idee voor deze methode toen we merkten dat aan het oppervlak gehechte implantonische subpopulaties van Pseudomonas verschillende gastheer-dodende fenotypes hebben.

Om te beginnen groeit u de E.coli-stam BR een nacht lang volgens de aangegeven protocol in de tekst. Breng vervolgens de E.coli-cultuur op kamertemperatuur. Gebruik een houten stok om amoeben in 750 l van de cultuur te inoculeren.

Voeg onmiddellijk 700 l van het amoebe E.coli-mengsel toe aan een GYP-plaat. Kantel de plaat om de cultuur gelijkmatig over het oppervlak van de plaat te verspreiden. Plaats vervolgens de plaat in een doos die een hoge luchtvochtigheid handhaaft.

Incubeer de plaat binnenin de doos bij 22 °C gedurende vier tot vijf dagen. Nadat de incubatieperiode voorbij is, gebruikt u een steriele pipettentip om amoebesporen te verzamelen van de helft van de plaat. Pipetteer vervolgens op en neer om de amoebe op de pipettentip in 1 mL PS-medium te hersuspenderen.

Breng het inoculatiemengsel over in een 250 mL-fles met 25 mL PS-medium aangevuld met een antibiotische antimicotische oplossing. Laat de amoebe groeien bij 22 °C in een roterende shaker op 100 tpm. Na het kweken van Pseudomonas aeruginosa gedurende een nacht, verdunt u de cultuur met PSB-media in een 6 cm petrischaal.

Schud vervolgens de cultuur op een tafelrotator ingesteld op 100 tpm bij 37 °C. Verwarm eerst 50 mL van 1% agar in DB-buffer in een 250 mL-fles in de magnetron. Voeg 15 µL calcium AM toe aan de 15 mL van de gesmolten agar en meng voorzichtig. Giet het mengsel van gesmolten agar in een glazen plaat van 12 bij 10 cm en laat de agar tien minuten op kamertemperatuur stollen.

Gebruik vervolgens een metalen liniaal en een gedrukte grid om de gestolde agarpad in kleinere secties van 1,5 bij 1,5 cm te snijden. Zorg ervoor dat de gel gehydrateerd blijft totdat deze klaar is voor gebruik. Vervolgens, om de aan het oppervlak gehechte cellen te isoleren, verwijdert u het vloeibare medium uit de petrischaal.

Was vervolgens de schaal met 1 mL ontwikkelingsbuffer om de planktonische cellen te verwijderen. Om de virulentie van aan het oppervlak gehechte bacteriecellen te meten, voegt u 10 µL amoebecellen toe van de eerder verkregen aan het oppervlak gehechte bacteriële cellen. Om de planktonische cellen te isoleren, brengt u 10 µL van de cultuur over naar een nieuwe petrischaal.

Vervolgens wordt de virulentie van planktonische cellen getest door 10 µL amoebecellen te mengen met de eerder verkregen planktonische bacteriën. Plaats onmiddellijk de kleine agarpad bovenop het geschikte bacterie-amoebemengsel op het oppervlak van de petrischaal. Verwijder vervolgens overtollig vocht door voorzichtig te pipetten en laat de schaal 20 minuten drogen.

Bedek de schaal met het deksel en incubeer deze gedurende nog eens 40 minuten op kamertemperatuur. Gebruik ten slotte een fluorescentiemicroscoop om afbeeldingen te maken van ten minste 100 amoebecellen. In dit protocol werd de virulentie van planktonische en aan het oppervlak gehechte Pseudomonas aeruginosa-cellen getest.

Aan het oppervlak gehechte wild-type Pseudomonas aeruginosa doodde amoebe, wat aangegeven wordt door een ronde amoebecellenvorm en de aanwezigheid van calceïne-fluorescentie. In vergelijking met planktonische cellen had aan het oppervlak gehechte wild-type Pseudomonas aeruginosa een hoge gastheer-dodende index. Planktonische cellen werden door de amoebe geconsumeerd, wat aangegeven wordt door de amorfe vormen van amoebecellen en relatief weinig calceïne-fluorescentie.

Wanneer u deze procedure uitvoert, is het belangrijk om een verse voorraad calceïne AM en amoebecellen te gebruiken en de optische dichtheid van amoebe nauwlettend in de gaten te houden. Na het volgen van deze procedure kunnen andere methoden, zoals transcriptieprofilering, worden uitgevoerd om aanvullende vragen te beantwoorden, zoals: welke genen worden geactiveerd in planktonische en aan het oppervlak gehechte subpopulaties? Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe u de snelle beeldgebaseerde virulentietest uitvoert.