Een pipet-Tip gebaseerde methode voor Seeding cellen Droplet Microfluidic Platforms

De integratie van deze methodologie met druppelvormige microfluidics helpt bij het beantwoorden van belangrijke vragen met betrekking tot het gebied van systemen immunologie om cellulaire heterogeniteit en communicatie tussen enkele cellen of pathogenen te coderen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek die we ontwikkelden is, dat deze tip belastingprocedure het mogelijk maakt de inkapseling van zeldzame cellen in druppels nauw overeenkomen met de voorspelde procent verdeling. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang voor het begrijpen hoe pipet tips gebruiken om cellen te laden naar geslachte druppels en om cellen te halen uit de druppels.

Voor het laden van de tip voor het genereren van waterdruppels voegt u eerst drie milliliter oppervlakteactieve stoffen toe aan twee milliliter bloemhoudende olie en trek het oliefasemengsel in een spuit van 2,5 milliliter. Verwijder eventuele luchtbellen uit de spuit en sluit de spuit aan op een stuk Teflon-buizen met een geschikte lengte. Laad twee monsterspuiten met een geschikte bi-compatibele minerale olie en sluit de spuit aan op een tweede stuk Teflon-buizen met een juiste lengte.

Vervolgens, punch een vijf millimeter diameter Polydimethylsiloxane of PDMS plug uit een uitgeharde EDMS plaat, en punch een een millimeter gat door het midden van de stekker. Steek de stekker stevig in de bovenkant van een 200 microliter pipette-tip en steek de slang bevestigd aan de bi-compatibele minerale olie spuit in de stekker. Druk de spuitzuiger langzaam in om de pipet-tip te vullen met minerale olie die alle restlucht eruit duwt.

Plaats zowel monsterspuiten als de bloemhoudende oliespuit voorzichtig op een spuitpomp. Wanneer alle lucht is verwijderd, laat u elke pipet-tip in de monsteroplossing zakken en haalt u ongeveer 100 microliter celmonsters in de uiteinden. Steek vervolgens beide monster-bevattende pipette-tips in de twee binneninlaten van de PDMS-chip en steek de buis met het oliefasemengsel in de buitenste inlaat.

Stel de stroomsnelheden op de spuitpomp in zoals aangegeven En voer en stel de afmetingen van elke spuit in. Start de pomp om de monsteroplossing door de binnenkanalen van het apparaat en de oliefase door het buitenste kanaal van het apparaat te spoelen. Sluit vervolgens een stuk buizen van een geschikte lengte aan in de uitlaat om te beginnen met het verzamelen van de druppels wanneer de druppelvorming stabiel is, waardoor de druppels in een sluisbuis worden verzameld.

Wanneer alle druppels zijn verzameld, voeg 200 microliter rpmi-medium, zonder serum, bovenop de druppels en incubeer het monster met het gat op het deksel van de sluisbuis voor de juiste experimentele periode. Voor emulsie breken, eerst twee milliliter PFO toe te voegen aan acht milliliter flouinated olie en gebruik een spuit om de overtollige olie te verwijderen uit de bodem van de druppelverzameling buis. Voeg vervolgens 100 microliters van 20%PFO-oplossing toe aan de emulsie om de ingekapselde cellen in de waterige fase vrij te geven en tik kort op de buis om te mengen.

Vergeet niet dat PFO schadelijk kan zijn voor de cellen. En daarom het contact met PFO tot een minimum beperken. Na één tot twee minuten draait u de oplossing gedurende 30 seconden met de laagst mogelijke relatieve middelpuntvliedende kracht en breng onmiddellijk 550 microliter van de waterige fractie over in een nieuwe vergrendelde buis met 500 microliters koude PBS, aangevuld met 2%Foetaal Kalfserrum of FCS.

Laat alle resterende olie zinken naar de bodem van de nieuwe sluisbuis en breng voorzichtig 950 microliter van de cel met waterige fase over naar een nieuwe sluisbuis. Zorg ervoor dat de olie niet samen met de waterige fase in de nieuwe sluisbuis wordt overgebracht. Verzamel vervolgens de cellen door centrifugatie en schort de pellet opnieuw op in 300 microliters van verse koude PBS aangevuld met 2%FCS.

Met behulp van de tip loading aanpak zoals net aangetoond, Jurkat T cel inkapseling tarieven samenvallen met de statistisch voorspelde waarden kunnen worden verkregen. Opmerkelijk, zelfs met aanhangende cellen zoals tumorcellen, die de neiging hebben om samenklonteren, of zeldzame cellen zoals plasmacytoïde dendritische cellen, een verbeterde inkapseling efficiëntie wordt waargenomen. Tijdens deze representatieve inkapseling regenereerden de druppels met behulp van ultralage geleertemperatuur en gelled na de productie om agarose hydrogel kralen te vormen die latere downstream-analyse via microscopie en stroomcytometrie mogelijk maakten.

Microscopische analyse bleek dat cel pairing werd bereikt bij verschillende combinaties indicatieve hoge doorvoer cel pairing en analyse van dezelfde populatie van hydrogel kralen door flow cytometrie, bleek dat kralen zonder cellen kunnen worden gescheiden van de kralen met cellen op basis van hun verschillende voorwaartse en zijwaartse scatter patronen. Inderdaad, gating op de populatie van kralen zonder cellen bevestigde een gebrek aan cel inkapseling door de afwezigheid van fluorescerende signalen, terwijl gating op de kraalpopulatie met cellen bleek het bestaan van meerdere subpopulaties indicatief voor de inkapseling van verschillend gelabelde Jurkat T cellen. Tijdens het werken met deze methode, is het belangrijk om te onthouden dat celconcentratie is een beperkende factor, en moet worden geoptimaliseerd om efficiënte cel inkapseling en cel pairing te verzekeren.

Na deze procedure kunnen niet alleen een of twee cellen worden ingekapseld in druppels met een hoge efficiëntie, maar meerdere cellen, of celtypen, kunnen worden ingekapseld voor een nauwkeurigere replicatie van cellulaire micro-omgeving. Deze techniek zal de weg vrijmaken voor onderzoekers op het gebied van immunologie en aanverwante disciplines voor een optimaal gebruik van littekencelpopulaties en hun efficiënte inkapseling in druppels, om cellulair gedrag te bestuderen in een ruisvrije omgeving.