Name: Het genereren van een lymfkliertest Orthotopic uitgezaaide borst kanker Model en het uitvoeren van lymfkliertest radicale mastectomie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Leer een orthotopisch borstkankermodel bij muizen met bioluminescentiebeeldvorming. Deze methode biedt hoge tumorgroei en lage recidiefkans na mastectomie voor behandelonderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dit werk werd gesteund door de NIH-subsidie R01CA160688 en Susan G. Komen Foundation onderzoeker geïnitieerd onderzoek subsidie (IIR12222224) met R.C. muizen bioluminescentie beelden werden verworven door gedeelde bron translationeel Imaging gedeelde Resource in Roswell Park Uitgebreide Cancer Center, dat werd gesteund door de kanker Center ondersteuning Grant (P30CA01656) en gedeelde Instrumentation grant (S10OD016450).

Goedkeuring van het Roswell Park uitgebreide kanker centrum institutionele Animal Care en gebruik Comité werd verkregen voor alle experimenten.
Opmerking: Negen tot twaalf weken oude vrouwelijke BALB/c muizen worden verkregen. 4T1-luc2 cellen, een muis borstklier adenocarcinoom cellijn afgeleid van BALB/c muizen die is ontworpen om uitdrukkelijke luciferase, worden gebruikt. Deze cellen worden gekweekt in Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium met 10% foetale runderserum (FBS).
1. voorbereiding van de instrumenten
<ol><li>Ontdooi een mengsel van bevroren gelatine-achtige eiwitten (bijvoorbeeld Matrigel) op het ijs in de kap van een weefselkweek.</li>
	<li>Schoon en autoclaaf twee sets van chirurgische instrumenten (microdissection-schaar, Adson pincet en de houder van een naald) voorafgaand aan de operatie. Bereiden van gesteriliseerde 5-0 zijde hechtingen en droog sterilant (als seriële chirurgie zijn gepland).</li>
	<li>Clip van de middelste borsthaar van de muizen met behulp van een klipper en mark de muizen voor identificatie door ponsen van het oor tijdens de operatie.</li>
	<li>
De tabel van de procedure, die onmiddellijk kan worden gebruikt voor de bewerking voorbereiden.
	<ol>
<li>Verspreid een absorberend stootkussen en de hoeken vast met tape, herstellen van anesthesie neus kegels met tape, sterilant en ontsmettingsmiddel (chloorhexidine, Jood, en 75% ethanol) naast de operationele ruimte plaatst van de muizen in volgorde van de operatie.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. voorbereiding van cellen (10 muizen)
Opmerking: De cellen moeten worden geënt binnen 1 uur na wordt losgekoppeld van de schotel te vermijden verminderde levensvatbaarheid. In het bijzonder moet de celsuspensie worden gemengd in het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten binnen 15 min na het loskoppelen van de cellen van de schotel te handhaven hun levensvatbaarheid.
<ol><li>Cultuur 4T1-luc2 cellen, een muis borstklier adenocarcinoom cellijn uiten luciferase, in RPMI 1640 media met 10% FBS in een bevochtigde incubator bij 37 ° C in 5% CO2.</li>
	<li>Wassen het aanhangend 4T1-luc2-cellen in een 10-cm schotel met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van serologische Pipetteer 10 mL. Voeg vervolgens 1 mL van 0,25% trypsine met behulp van een precisiepipet P1000 en, vervolgens, Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Voeg vervolgens 4 mL groei media (RPMI-1640 met 10% FBS) met behulp van een 5 mL serologische Pipetteer en de celsuspensie overbrengen in een conische buis van 15 mL in de kap van een weefselkweek. Centrifugeer de celsuspensie bij 180 x g gedurende 5 min.</li>
	<li>Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de cellen in 2 mL PBS; vervolgens met behulp van de hemocytometer cellen te tellen.</li>
	<li>2 x 106 4T1-luc2 cellen in 40 μL van koude PBS (pH 7.4, 4 ° C) in de weefselkweek kap opschorten.</li>
	<li>Meng de 40-μl celsuspensie met 360 μl van het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten in een 1,5 mL microcentrifuge buis op ijs in de weefselkweek kap. Opmerking: De eindconcentratie is 1 x 105/20 μL (1:9 PBS: mengsel van de gelatine-achtige eiwitten). Voor het orthotopic model (geen mastectomie), werd 1 x 104/20 μL van de uiteindelijke concentratie gebruikt, om te voorkomen dat het bereiken van euthanasie criteria (tumor grootte > 2 cm) binnen twee weken.</li>
</ol>3. kanker cel inoculatie
<ol><li>Zet de muizen in de anesthesie inductie kamer met 2-4% Isofluraan en 0.2 L/min zuurstof stroom totdat de muizen rustig ademen (2-3 min).</li>
	<li>Pak de muis en buprenorfine 0,05 mg/kg subcutaan te injecteren in zijn schouder.</li>
	<li>Bevestig voldoende verdoving door het ontbreken van een reactie op een snuifje teen. Plaats van de muis neus in het gat van het masker muis, waarmee respiratoire anesthesie met 2-4% Isofluraan en 2 L/min zuurstof stroom is aangesloten op een houtskool busje eenheid.</li>
	<li>Beperken van de muis ledematen met behulp van lab-tape en steriliseren van de huid met behulp van chloorhexidine, Jood, en 75% ethanol, met behulp van katoenen wissers.</li>
	<li>Maken van een incisie huid 5 mm in het midden van de voorste borstwand met behulp van steriele microdissection schaar, lift de rechterkant huid naast de incisie en loskoppelen van de huid van de borstwand met behulp van de schaar, en vervolgens het omkeren van de huid om te bloot het recht #2 borstklier vet pad.</li>
	<li>Zorgvuldig injecteren 20 μL van kanker celsuspensie met behulp van een insuline spuit van 1 mL met een 28.5 G naald in het vet pad onder direct zicht door middel van de wond. Opmerking: De naald gaat via de wond, niet de huid. Houd houden de naald in het vet pad voor 5 s voorafgaande aan te trekken, waardoor de tijd voor het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten te stollen.</li>
	<li>Sluit de huid insnijdingen door stiksels, met behulp van steriele 5-0 niet-absorbeerbare draadjes.</li>
	<li>Na de operatie, keren de dieren naar een schone kooi en volgen ze totdat ze zijn hersteld en vrij gaan (na ~ 1-2 min). Als een dier niet lijkt te zijn in goede gezondheid binnen de 24u van chirurgie, beheren buprenorfine (0,2 mg/kg).</li>
	<li>Verwijderen van de hechtingen onder verdoving (zie stap 3.1) 7 d na de operatie.</li>
</ol>4. mastectomie
Opmerking: De timing van de borstoperatie is zeer belangrijk. Als het is te vroeg gedaan, Long metastase treedt niet op. Als het te laat is gedaan, heeft de primaire tumor grote bloedvaten, waardoor een volledige oncologische resectie uitdagende binnengevallen. Dus werden meerdere tijdstippen getest voor mastectomie om te bepalen welk tijdstip de juiste balans in afwachting van metastase voordat resectie te uitdagend werd geproduceerd. Na te doen in meer dan 50 muis experimenten, blijkt dat mastectomie op 8 dagen na inoculatie van kanker cel (of wanneer de grootte van de tumor 5 mm bereikt) het ideale punt om te bereiken dat evenwicht13tijd.
<ol><li>Een muis met 2-4% ingeademd Isofluraan anesthetize en injecteren van buprenorfine (zie stap 3.1 en 3.2).</li>
	<li>Beperken van de muis en steriliseren van de huid (zie stap 3.4).</li>
	<li>Maak een 5 mm huid incisie 2 mm naar links van de chirurgische litteken dat werd gedaan op de eerste kanker cel inoculatie, met behulp van de microdissection-schaar. Uitbreiden van de incisie naar de hoofdmap van de voorpoot te verwijderen van de tumor, de huid, met inbegrip van het chirurgische litteken, en de laesie in contact met de tumor, evenals de axillaire lymfeklieren bekken waarin het merendeel van de tijd die geen zichtbare lymfeklier ten tijde van de mastect bestaat bevorderd13. Zorg ervoor dat niet te beschadigen de axillaire ader.</li>
	<li>Sluit de gebreken van de huid door de stiksels, met behulp van steriele 5-0 niet-absorbeerbare draadjes in de vorm van een "Y".</li>
	<li>Gelijk aan stap 3.8, keren de muis naar een schone kooi en de monitor totdat zij hebben teruggekregen.</li>
	<li>Verwijderen van de hechtingen onder verdoving (zie stap 3.1) 7 dagen na de operatie.</li>
</ol>5. bioluminescente kwantificering van de primaire Tumor (Orthotopic inoculatie zonder mastectomie) of longkanker metastase (mastectomie Model)
Opmerking: Voor primaire tumor last kwantificering is de Bioluminescentie gemeten 2 x per week vanaf de dag na de inoculatie van de orthotopic. Voor longkanker metastase kwantificering is de Bioluminescentie gemeten 2 x per week vanaf de dag na de borstoperatie.
<ol><li>D-luciferine ontbinden in Dulbecco van fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) om een eindconcentratie van 15 mg/mL in een weefselkweek kap. ALIQUOT in licht afgeschermd 1,5 mL microcentrifuge buizen. Opslaan van de verdunde oplossing bij-80 ° C. Opmerking: Voor een muis van 20 g is 200 µL van verdunde D-luciferine vereist.</li>
	<li>Open de denkbaar software en klik op initialiseren. Opmerking: Het duurt ongeveer 15 minuten afkoelen van de charge - coupled device (CCD). Wanneer de CCD de ingestelde temperatuur bereikt, verandert de kleur van de temperatuur bar van rood in groen.</li>
	<li>Anesthetize van de muizen met 2-4% Isofluraan in een speciale inductie-zaal voorafgaand aan de beeldvorming (zie stap 3.1).</li>
	<li>Weeg de muizen.</li>
	<li>Injecteren van 150 mg/kg D-luciferine intraperitoneally op het punt van de halverwege buik, met behulp van een naald 28.5 G.</li>
	<li>Past elke muis met een neus kegel binnen het imaging systeem in de liggende positie (plaats een maximum van vijf muizen tegelijk). Handhaven verdoving op 1-3% Isofluraan (in 100% zuurstof) via de neus kegels tijdens imaging.</li>
	<li>
Een opname elke 5 min voor het detecteren van de piek bioluminescentie gedurende 50 minuten (of tot de bevestigde piek bioluminescentie).
	<ol>
<li>Selecteer luminescentie als Auto, weggooien als Mediumen gezichtsveld als D.</li>
		<li>Klik op ophalen om de opname.</li>
	</ol>
</li>
	<li>De muizen terug naar hun cage(s) en volgen ze totdat ze hebben hersteld (zie stap 3.8).</li>
</ol>6. lung metastase Tumor last kwantificering door Ex Vivo Imaging
Opmerking: Long metastase kwantificering is van toepassing voor orthotopic inoculatie zowel met als zonder mastectomie modellen. In het model van de mastectomie, is ex vivo imaging of overleving observatie gekozen, afhankelijk van het doel. In het orthotopic inoculatie (zonder mastectomie) model produceren meestal primaire tumor groottecriteria euthanasie (> 2 cm) ongeveer 21 dagen na inoculatie.
<ol><li>Kwantificeren Long metastatische laesies 21 dagen na de inenting van de kanker-cel door ex vivo imaging.</li>
	<li>Anesthetize van de muizen met 2-4% Isofluraan in een speciale inductie-zaal (zie stap 3.1).</li>
	<li>Weeg de muizen.</li>
	<li>Injecteren van 150 mg/kg D-luciferine intraperitoneally (zie stap 5.6).</li>
	<li>Euthanaseren de muizen door cervicale dislocatie, 15 min na de injecties.</li>
	<li>Open de buik door het snijden van de huid en buikvlies op de halverwege buik, met behulp van gebogen Mayo schaar. De incisie aan zowel rechts als links uitbreiden Uitlichten van de lever met de pincet totdat het middenrif is gevisualiseerd; Vervolgens snijd het middenrif.</li>
	<li>Met behulp van de gebogen schaar Mayo, het delen van de bilaterale ribben van caudad (12e ribben) naar craniale (1ste ribben) de longen door de muur anterior thorax flipping bloot te stellen.</li>
	<li>Identificeren van de thoracale slokdarm, die eruit als een snoer aansluiten van de longen op de wervelkolom ziet, door het opheffen van de longen met behulp van Tang en knip de slokdarm met behulp van de microdissection-schaar.</li>
	<li>Til de bilaterale longen en hart met pincet (tractie trekken naar beneden, in de richting van craniale tot caudad toe te passen) en, knip de luchtpijp en de grote schepen aan de apex van de longen op de craniale, met behulp van microdissection-schaar. Opmerking: Dit zorgt voor de isolatie van de longen en het hart van het lichaam.</li>
	<li>Verwijder het hart uit de longen met behulp van microdissection-schaar.</li>
	<li>Zet de longen in een 10 cm petrischaal.</li>
	<li>De opname van de bioluminescentie (zie stap 5.7.1 en 5.7.2) 5 min na euthanasie (20 minuten na de injectie luciferine).</li>
</ol>

<ol><li>Rashid, O. M., Takabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+for+exploring+the+pharmacokinetics+of+breast+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+%26+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Animal models for exploring the pharmacokinetics of breast cancer therapies.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 11 (2), 221-230 (2015).</li>
<li>Schuh, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trials%2C+tribulations%2C+and+trends+in+tumor+modeling+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicologic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice.</a> Toxicologic Pathology. 32, 53-66 (2004).</li>
<li>Katsuta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+breast+cancer+model+for+preclinical+immunotherapy+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Modified breast cancer model for preclinical immunotherapy studies.</a> Journal of Surgical Research. 204 (2), 467-474 (2016).</li>
<li>Sidell, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+mandibulectomy%3A+a+novel+animal+model%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngology-Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Composite mandibulectomy: a novel animal model.</a> Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 146 (6), 932-937 (2012).</li>
<li>Ewens, A., Mihich, E., Ehrke, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distant+metastasis+from+subcutaneously+grown+E0771+medullary+breast+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Research%22%5BJournal%5D)">Distant metastasis from subcutaneously grown E0771 medullary breast adenocarcinoma.</a> Anticancer Research. 25, 3905-3915 (2005).</li>
<li>Kocaturk, B., Versteeg, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+injection+of+breast+cancer+cells+into+the+mammary+fat+pad+of+mice+to+study+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth.</a> Journal of Visualized Experiments. (96), e51967(2015).</li>
<li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+syngeneic+orthotopic+murine+model+of+human+breast+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">An improved syngeneic orthotopic murine model of human breast cancer progression.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 147 (3), 501-512 (2014).</li>
<li>Bertozzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence%2C+risk+factors%2C+and+prognosis+of+peritoneal+metastasis+from+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22SpringerPlus%22%5BJournal%5D)">Prevalence, risk factors, and prognosis of peritoneal metastasis from breast cancer.</a> SpringerPlus. 4, 688(2015).</li>
<li>Kennecke, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+behavior+of+breast+cancer+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Metastatic behavior of breast cancer subtypes.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (20), 3271-3277 (2010).</li>
<li>Valero, M. G., Golshan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+the+Axilla+in+Early+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+and+Research%22%5BJournal%5D)">Management of the Axilla in Early Breast Cancer.</a> Cancer Treatment and Research. 173, 39-52 (2018).</li>
<li>National Comprehensive Cancer Network. Breast Cancer, NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf ">https://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast.pdf </a> (2018).</li>
<li>Versteeg, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+tissue+factor+signaling+suppresses+tumor+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of tissue factor signaling suppresses tumor growth.</a> Blood. 111 (1), 190-199 (2008).</li>
<li>Katsuta, E., Rashid, O. M., Takabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+breast+cancer+mastectomy+model+that+predicts+patient+outcomes+for+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Murine breast cancer mastectomy model that predicts patient outcomes for drug development.</a> Journal of Surgical Research. 219, 310-318 (2017).</li>
<li>Veenhof, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+stress+response+and+postoperative+immune+function+after+laparoscopy+or+open+surgery+with+fast+track+or+standard+perioperative+care%3A+a+randomized+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Surgical stress response and postoperative immune function after laparoscopy or open surgery with fast track or standard perioperative care: a randomized trial.</a> Annals of Surgery. 255 (2), 216-221 (2012).</li>
<li>Wei, S., Siegal, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surviving+at+a+distant+site%3A+The+organotropism+of+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Diagnostic+Pathology%22%5BJournal%5D)">Surviving at a distant site: The organotropism of metastatic breast cancer.</a> Seminars in Diagnostic Pathology. 35 (2), 108-111 (2018).</li>
<li>Nagahashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingosine-1-phosphate+produced+by+sphingosine+kinase+1+promotes+breast+cancer+progression+by+stimulating+angiogenesis+and+lymphangiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Sphingosine-1-phosphate produced by sphingosine kinase 1 promotes breast cancer progression by stimulating angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Cancer Research. 72 (3), 726-735 (2012).</li>
<li>Jones, C., Lancaster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Operative+Technique+for+Mastectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Surgical+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Evolution of Operative Technique for Mastectomy.</a> Surgical Clinics of North America. 98 (4), 835-844 (2018).</li>
<li>Rashid, O. M., Maurente, D., Takabe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Systematic+Approach+to+Preclinical+Trials+in+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Chemotherapy+%28Los+Angeles%29%22%5BJournal%5D)">A Systematic Approach to Preclinical Trials in Metastatic Breast Cancer.</a> Chemotherapy (Los Angeles). 5 (3), (2016).</li>
<li>Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+molecular+signature+of+metastasis+in+primary+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A molecular signature of metastasis in primary solid tumors.</a> Nature Genetics. 33 (1), 49-54 (2003).</li>
<li>Aoki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+long-term+obstructive+jaundice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Murine model of long-term obstructive jaundice.</a> Journal of Surgical Research. 206 (1), 118-125 (2016).</li>
<li>Terracina, K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+metastatic+murine+colon+cancer+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Development of a metastatic murine colon cancer model.</a> Journal of Surgical Research. 199 (1), 106-114 (2015).</li>
<li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+tail+vein+injection+a+relevant+breast+cancer+lung+metastasis+model%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Thoracic+Disease%22%5BJournal%5D)">Is tail vein injection a relevant breast cancer lung metastasis model?</a> Journal of Thoracic Disease. 5 (4), 385-392 (2013).</li>
<li>Rashid, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resection+of+the+primary+tumor+improves+survival+in+metastatic+breast+cancer+by+reducing+overall+tumor+burden%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Resection of the primary tumor improves survival in metastatic breast cancer by reducing overall tumor burden.</a> Surgery. 153 (6), 771-778 (2013).</li>
<li>Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+the+sensitivity+of+detection+of+fluorescent+and+bioluminescent+reporters+in+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Imaging%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models.</a> Molecular Imaging. 3 (1), 9-23 (2004).</li>
<li>Adams, S. T. Jr, Miller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+D-luciferin%3A+expanding+the+scope+of+bioluminescence+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Beyond D-luciferin: expanding the scope of bioluminescence imaging in vivo.</a> Current Opinion in Chemical Biology. 21, 112-120 (2014).</li>
<li>Close, D. M., Xu, T., Sayler, G. S., Ripp, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+bioluminescent+imaging+%28BLI%29%3A+noninvasive+visualization+and+interrogation+of+biological+processes+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">In vivo bioluminescent imaging (BLI): noninvasive visualization and interrogation of biological processes in living animals.</a> Sensors (Basel). 11 (1), 180-206 (2011).</li>
<li>Chen, H., Thorne, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+Methods+for+Molecular+In+Vivo+Optical+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Practical Methods for Molecular In Vivo Optical Imaging.</a> Current Protocols in Cytometry. 59 (1224), (2012).</li>
<li>Wurdinger, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+luciferase+for+ex+vivo+monitoring+of+in+vivo+processes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A secreted luciferase for ex vivo monitoring of in vivo processes.</a> Nature Methods. 5 (2), 171-173 (2008).</li>
<li>Aoki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+sphingosine+kinase+1+worsens+pancreatic+cancer+peritoneal+carcinomatosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">Host sphingosine kinase 1 worsens pancreatic cancer peritoneal carcinomatosis.</a> Journal of Surgical Research. 205 (2), 510-517 (2016).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Voor het laatste decennium, hebben wij meerdere lymfkliertest kanker-modellen, met inbegrip van borst kanker modellen3,7,13,16,20,21oprichten. Eerder, we toonden aan dat borst kanker cel orthotopic inoculatie in het weefsel van de melkklier onder direct zicht een grotere tumor geproduceerd met minder variabiliteit van de groo...

Dierlijke modellen spelen een belangrijke rol in kankeronderzoek. Wanneer een hypothese is bewezen in vitro, moet deze in vivo te evalueren van de klinische relevantie worden getest. Progressie van kanker en metastase zijn vaak beter gevangen door dierlijke modellen ten opzichte van in vitro modellen, en het is essentieel voor het testen van een nieuwe drug in een dierlijk model als een preklinische studie voor1,2van de ontwikkeling van de drug. De technische details van dierproeven zijn echter vaak niet goed beschreven in gepubliceerde artikelen, maken het uitdagend om te reproduceren het model met succes. Inderdaad, de auteurs die deze orthotopic inoculatie en mastectomie modellen gevestigd ging door lange en strenge processen van trial and error. Het slagingspercentage van tumorvorming na kanker cel inoculatie is een van de belangrijkste factoren om te bepalen het succes en de efficiëntie van een dier studie3. De cellijn en het aantal cellen om te enten, de inoculatie-site en de stam van de muizen zijn allemaal belangrijke factoren. Het is algemeen bekend dat er enorme variaties in de resultaten van dierproeven als gevolg van individuele verschillen, ten opzichte van in vitro technieken zijn. Daarom is het belangrijk om stabiele resultaten, ter verbetering van de efficiëntie van dierproeven, en om te voorkomen dat misleidende resultaten te verkrijgen met behulp van een reeds lang gevestigde model met een standaard techniek.
Dit witboek biedt gevestigde technieken4 voor het genereren van borst-kanker orthotopic en mastectomie Muismodellen. De doelstellingen van deze methoden zijn 1) na te bootsen menselijke borst kanker progressie en behandeling cursussen, en 2) bij de uitvoering van in vivo experimenten met meer efficiëntie en hogere slagingspercentages in vergelijking met andere borst kanker inoculatie of mastectomie technieken. In orthotopic kanker cel inoculatie, om na te bootsen menselijke borst kanker progressie, kiezen we de #2 borstklier vet pad als een inenting site, die is gelegen in de borst. In de meeste van de studies, de borstkankercellen subcutaan worden geïnoculeerd5. Deze techniek vereist geen chirurgie en, dus, het is eenvoudig en ongecompliceerd. De subcutane communicatie is echter heel anders dan de melkklier communicatie, wat in verschillende kanker progressie en zelfs Moleculaire profielen6,7 resulteert. Sommige studies de melkklier #4, die zich in de buik bevindt, als een inenting site6gebruiken. Echter, aangezien #4 borstklieren bevinden zich in de buik, de meest voorkomende metastatische patroon is peritoneale carcinomatosis7, die met minder dan 10% van uitgezaaide borst kanker8 plaatsvindt. Kanker van de borst gegenereerd door de techniek hier, gepresenteerd in de melkklier #2 metastasizes aan de Long, die tot de meest voorkomende borst kanker metastatische sites9 behoort.
Met deze techniek is het doel ook om het bereiken van een hoger tarief van tumorvorming met minimale tumor grootte variabiliteit in vergelijking met andere borst kanker inoculatie technieken. Om dit te doen, worden de kankercellen opgeschort in een mengsel van de gelatine-achtige eiwitten onder direct zicht via een mediane voorste borst muur incisies geïnoculeerd. Deze techniek produceert een hoge tumorvorming tarief met minder variabiliteit in de tumor grootte en vorm ten opzichte van subcutane of niet-chirurgische injectie, zoals eerder gemeld3,7.
Ook introduceren we een muis radicale mastectomie techniek waarin de orthotopic borst tumor met de omringende weefsels en de oksellymfeklieren is gereseceerd. De standaard van zorg voor borstkankerpatiënten zonder verre metastase ziekte is in de klinische setting, mastectomie10,11. Voordat een borstamputatie, is axillaire lymfeklieren metastase gepolst door beeldvorming en sentinel biopsie van de lymfeklier. Als er geen bewijs van axillaire lymfeklieren metastase is, wordt de patiënt vervolgens behandeld met een totale of gedeeltelijke mastectomie, waarbij de axillaire lymfeklieren resectie is weggelaten. Totale mastectomie is een techniek om de resect van borstkanker met het hele borstweefsel en bloc, overwegende dat gedeeltelijke mastectomie resect kanker van de borst met een marge van omringende normale borstweefsel alleen, dus het behoud van het resterende normale borstweefsel in de patiënt. Patiënten die behouden normaal borstweefsel overblijft na een gedeeltelijke mastectomie echter postoperatieve radiotherapie om te voorkomen dat lokale herhaling10. Patiënten die axillaire lymfeklieren metastase ondernemen radicale mastectomie die de borstkanker met alle normale verwijdert weefsel en axillaire lymfeklieren borstkanker en vielen weefsels nl blok10,11. In het muismodel is toezicht voor axillaire lymfeklieren metastase en/of postoperatieve straling niet redelijk of haalbaar. Dus, we gebruik maken van de radicale mastectomie techniek om te voorkomen dat lokale of axillaire lymfeklieren metastase.
Kanker cel inoculatie via de ader van de staart is de meest voorkomende Long metastase muis model12, de zogenaamde "experimentele metastase". Dit model is eenvoudig te genereren en vereist geen chirurgie; echter is het niet na te bootsen menselijke borst kanker progressie die in andere gemetastaseerde ziekte gedrag resulteren kan. Om te bootsen de menselijke borst kanker behandeling cursus waar metastase treedt vaak op na borstamputatie, is de primaire tumor verwijderd na orthotopic kanker cel inoculatie. Deze techniek produceert minder lokale herhaling in vergelijking met eenvoudige tumor resectie, als eerder gemeld13, en is nuttig voor roman therapeutiek, preklinische studies, en voor uitgezaaide borst kanker onderzoeken. De technieken die hier worden beschreven zijn van toepassing voor de meeste borst kanker orthotopic model experimenten. Het is echter belangrijk om te bedenken dat het mengsel van de gelatine-achtige eiwitten kan invloed hebben op de communicatie en chirurgie kan invloed hebben op de stress/immuun reactie14. Onderzoekers bestuderen de communicatie en/of de stress/immuunrespons moet daarom rekening houden met potentieel verstorende factoren zijn.

<table><tbody><tr><td>Micro Dissection Scissors</td><td>Roboz</td><td>RS-5983</td><td>Voor kankercel inoculatie en mammectomie</td></tr><tr><td>Adson Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5233</td><td>Voor kankercel inoculatie en mammectomie</td></tr><tr><td>Needle Holder</td><td>Roboz</td><td>RS-7830</td><td>Voor kankercel inoculatie en mammectomie</td></tr><tr><td>Mayo</td><td>Roboz</td><td>RS-6873</td><td>Voor ex vivo</td></tr><tr><td>5-0 zijdedraden</td><td>Look</td><td>774B</td><td>Voor kankercel inoculatie en mammectomie</td></tr><tr><td>Droge sterilant (Germinator 500)</td><td>Braintree Scientific</td><td>GER 5287-120V</td><td>Voor kankercel inoculatie en mammectomie</td></tr><tr><td>Clipper</td><td>Wahl</td><td>9908-717</td><td>Voor kankercel inoculatie en mammectomie</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td>Voor kankercel inoculatie</td></tr><tr><td>D-Luciferin, kaliumzout</td><td>GOLD-Bio</td><td>LUCK-1K</td><td>Voor bioluminescentie kwantificering</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>Fetaal bovien serum</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td>Voor celcultuur</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Voor celcultuur</td></tr></tbody></table>

het genereren van een lymfkliertest orthotopic uitgezaaide borst kanker model en het uitvoeren van lymfkliertest radicale mastectomie

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

In vivo Muismodellen te beoordelen borst kanker progressie zijn essentieel voor kankeronderzoek, met inbegrip van preklinische drug ontwikkelingen. De meerderheid van de praktische en technische details worden echter vaak weggelaten in gepubliceerde manuscripten die daarom maakt het uitdagend om te reproduceren van de modellen, met name als het gaat om chirurgische technieken. Bioluminescentie technologie maakt het mogelijk voor de evaluatie van kleine hoeveelheden van kankercellen zelfs wanneer een tumor niet voelbaar is. Gebruik makend van kankercellen luciferase-uitdrukken, stellen wij een borst kanker orthotopic inoculatie techniek met een hoge tumorvorming tarief. Long metastase wordt beoordeeld met behulp van een ex vivo -techniek. Wij stellen vervolgens een mastectomie model met een lage lokale herhaling tarief voor het beoordelen van de last van uitgezaaide tumor. Hierin, beschrijven wij, in detail, de chirurgische technieken van orthotopic implantatie en mastectomie voor borstkanker met een hoge tumorigenesis rente en lage lokale herhaling tarieven, respectievelijk om borst kanker model efficiëntie te verbeteren.

Het doel van het orthotopic-model is om na te bootsen menselijke kanker progressie (dat wil zeggen, de groei van de primaire tumor gevolgd door lymfeklier metastase en vervolgens verre Long metastase)15. Na kanker cel inoculatie, de Bioluminescentie regelmatig wordt gekwantificeerd (twee tot drie keer / week) (figuur 1A). De bioluminescentie in de longen is dieper en kleiner dan de primaire laesie. De Bioluminescentie weerspie...

Wij introduceren een lymfkliertest orthotopic borst kanker en radicale mastectomie model met bioluminescentie technologie te kwantificeren van de last van de tumor om na te bootsen menselijke borst kanker progressie.

Het genereren van een lymfkliertest Orthotopic uitgezaaide borst kanker Model en het uitvoeren van lymfkliertest radicale mastectomie

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen in het gebied van borstkanker over hoe de menselijke borstkanker progressie en behandeling na te bootsen in een muis model. Het belangrijkste voordeel van dit muis borstkanker model is dat het een hoge tumorigenese tarief na orthotopische implantatie en een lage lokale recidief tarief na mastectomie. Begin met het bevestigen van een gebrek aan reactie op teen knijpen in een verdoofde vrouwelijke muis en het opnemen van het dier ledematen op een chirurgische raad.Met behulp van steriele wattenstaafjes steriliseren het chirurgische gebied met chloorhexidine, jodium en 75%ethanol. En maak een vijf millimeter huidincisie in het midden van de voorste borstwand. Til vervolgens de rechterkant van de huid naast de incisie en gebruik steriele microdissection schaar om de huid los te maken van de borstwand.Draai de huid om om de juiste nummer twee borstvetpad bloot te leggen en gebruik een insulinespuit van één milliliter die is uitgerust met een naald van 28,5 meter om zorgvuldig 20 microliters van kankercelsuspensie door de wond in het vetkussen te injecteren. Houd de naald in het vetpad gedurende vijf seconden om de gelatineachtige kanker cel eiwit mengsel te stollen voordat het verwijderen van de naald, en het sluiten van de incisie met steriele 5-0 niet-bevattende hechtingen. Plaats het dier vervolgens in een schone kooi met controle tot volledige recumbency.Om de borstamputatie acht dagen na kanker inenting de muis voor te bereiden op een operatie zoals net aangetoond, en maak een vijf-millimeter huid incisie twee millimeter aan de linkerkant van de chirurgische litteken van de kankercel inenting. Breid de incisie naar de wortel van de voorpoot om de tumor te verwijderen, en de huid, met inbegrip van de chirurgische litteken, en de laesie in contact met de tumor, en de okillaire lymfeklier bekken waarin meestal geen zichtbare lymfeklieren aanwezig zijn op het moment van de mastectomie. Sluit vervolgens de huidafwijkingen met steriele 5-0 niet-onabsorbare hechtingen in de vorm van een Y.And breng het dier terug naar zijn kooi met controle tot volledige incumbency.Voor longmetastase kwantificering 21 dagen na inenting injecteren 150 milligram per kilogram D-Luciferin IP 15 minuten voor euthanasie. En gebruik gebogen Mayo schaar om de huid en buikvlies te openen op de mid-buik. Druk op de lever totdat het middenrif kan worden gevisualiseerd, en snijd het middenrif en de bilaterale ribben van caudad tot cephalad.Draai de voorste thoraxwand om de longen bloot te leggen en til de longen op om de thoracale slokdarm te identificeren, die eruit ziet als een koord dat de longen verbindt met de wervelkolom. Snijd de slokdarm met microdissection schaar en gebruik tangen om de bilaterale longen en het hart te trekken naar de caudad. Snijd vervolgens de luchtpijp en de belangrijkste bloedvaten naar de longen top op de kop en plaats de longen in een 10-centimeter petrischaal voor bioluminescente beeldvorming.Gebruik de schaar om het hart te verwijderen uit het longweefsel. Beginnend bij ongeveer acht dagen na borstvetstootkussenkankercelinenting is de bioluminescentie in de longen dieper en kleiner dan in de primaire laesie die de primaire tumorlast in levende muizen weerspiegelt. Meting van de tumorgrootte met remklauwen maakt schatting van het tumorvolume in situ mogelijk.Dit mastectomiemodel maakt ook seriële gemetastaseerde tumorbelastingscontrole mogelijk zonder de dieren te euthanaseren. De tumorlast van de longmetastasen kan ook worden gekwantificeerd door ex vivo beeldvorming, maar de beperking is dat de muizen moeten worden geëuthanaseerd. Muis overleving na chirurgische behandeling kan ook worden gecontroleerd als een vertaalbare klinische eindpunt.Na de ontwikkeling van deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers op het gebied van borstkanker om niet alleen nieuwe geneesmiddelenontwikkeling te onderzoeken, maar ook borstkankeronderzoek in het algemeen.

generating-murine-orthotopic-metastatic-breast-cancer-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Geneeskunde

De video toont de orthotopische inentingstechniek voor borstkanker in een muismodel. Deze techniek produceert een hoge tumorigenesesnelheid met minder variabiliteit in tumorgrootte en vorm in vergelijking met subcutane of niet-chirurgische injectie.

Orthotopische injectie: weefselspecifieke kankercellen implanteren in een volwassen muis

Deze video beschrijft een techniek van radicale mastectomie, die wordt gebruikt voor de chirurgische verwijdering van de hele borstklier van een muis om de progressie van kanker te bestuderen.

Radicale mastectomie: chirurgische verwijdering van de hele borstklier van een muis om kankerprogressie te bestuderen

Kanker is een complexe ziekte die wordt beïnvloed door het weefsel rondom de tumor en lokale pro- en anti-inflammatoire mediatoren. Daarom kan orthotroop injectie modellen plaats subcutane modellen nuttig om de progressie van kanker te bestuderen op een wijze die beter nabootst humane pathologie.

Orthotopische Injectie van borstkankercellen in de uiervet Pad van Muizen tumorgroei te bestuderen.

Een orthotope borstkanker primaire tumor model en chirurgische verwijdering van de primaire tumor de muis het leven uit te breiden tot spontane metastase genereren beschreven. De tumorgroei en progressie worden gecontroleerd en gekwantificeerd luciferase fluorescentiebeeldvorming.

Een orthotope Muis Model van Spontane uitzaaiing van borstkanker

Het meerstaps proces van peritoneale verspreiding van ovariumcarcinoom verduidelijken de huidige studie beschrijft een murine experimenteel model van originele tumorontwikkeling en metastase via orthotope peritoneale inoculatie met deze tumorcellen.

Murine Experimental Model van de oorspronkelijke tumor Ontwikkeling en peritoneale metastase<em&gt; via</em&gt; Orthotope Inenting met ovariumcarcinoom Cells

Preklinische modellen die adjuvante therapie beoordelen die gericht zijn op metastase van borstkanker, ontbreken. Om dit aan te pakken, ontwikkelden we een muizenmodel van de novo pulmonale mammary adenocarcinoma metastase, waarbij therapieën toegediend in de adjuvante omgeving (post-chirurgische resectie van primaire tumoren) kunnen worden geëvalueerd voor werkzaamheid bij het beïnvloeden van eerder gecoede pulmonale metastasen.

Chirurgische Procedures en Methodologie voor een Preklinisch Murine Model van De Novo Maagkanker Metastase

Hier presenteren we een protocol om het implantaat van borstkankercellen in de borstklier vet pad in een eenvoudige, minder invasief, en gemakkelijk te bedienen manier, en deze orthotopic borst kanker muismodel met een juiste borstklier vet pad omgeving kan worden gebruikt voor het onderzoeken van verschillende aspecten van kanker.

Orthotopic injectie van borstkankercellen in de borstklier vet Pad muizen

Dit werk presets een geavanceerd protocol om nauwkeurig te beoordelen tumor laden door detectie van groene fluorescerende eiwitten en bioluminescentie signalen, alsmede de integratie van kwantitatieve moleculaire detectie techniek.

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

Patient-derived xenograft (PDX) modellen en transplanteerbare genetisch gemanipuleerde muismodellen getrouw de menselijke ziekte samenvatten en zijn voorkeursmodellen voor fundamenteel en translationeel borstkankeronderzoek. Hier wordt een methode beschreven om borsttumorfragmenten orthotopisch in het borstvetkussen te transplanteren om tumorbiologie te bestuderen en de respons van geneesmiddelen te evalueren.

Orthotopische transplantatie van borsttumoren als preklinische modellen voor borstkanker

Het huidige protocol beschrijft intratibia osteosarcoom celinjectie om muismodellen te genereren met orthotopisch osteosarcoom en pulmonale metastase laesies.

Intratibiale osteosarcoomcelinjectie om orthotopisch osteosarcoom en longmetastase muismodellen te genereren

Het manuscript beschrijft een methodologie voor het opzetten en longitudinaal monitoren van spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumoren, die vatbaar is voor interventie in alle stadia van de metastatische cascade.

In vivo Beeldvorming om spontane longmetastasen van orthotopisch geïnjecteerde borsttumorcellen te meten

Leer een orthotopisch borstkankermodel bij muizen met bioluminescentiebeeldvorming. Deze methode biedt hoge tumorgroei en lage recidiefkans na mastectomie voor behandelonderzoek.

Het genereren van een lymfkliertest Orthotopic uitgezaaide borst kanker Model en het uitvoeren van lymfkliertest radicale mastectomie (Video) | JoVE Journal

Het genereren van een lymfkliertest Orthotopic uitgezaaide borst kanker Model en het uitvoeren van lymfkliertest radicale mastectomie

Meer video's verkennen