Analyse van bèta-cel functie met behulp van de resolutie van de eencellige Calcium Imaging in Zebrafish eilandjes

Deze methode kan helpen bij het begrijpen van belangrijke vragen in het bètacellenveld. Zoals de heterogene functie onder individuele bètacellen binnen een eilandje. Het grote voordeel van deze techniek is de ruimtelijke en temporele resolutie die wordt geboden door live beeldvorming van de bètacellen.

We kunnen de calciumoscillaties binnen individuele bètacellen vastleggen. Na het doden van een vis volgens het tekstprotocol, breng het over naar een Petrischotel met HBSS-oplossing met calcium en magnesium. Gebruik vervolgens onder een stereomicroscoop uitgerust met een fluorescentielamp en een rode filtercube scherpe pincetten om de huid van de mond naar de anale vin te snijden.

Verwijder de gesneden huid aan de rechterkant om de buik bloot te leggen, wat de inwendige organen zal blootleggen. Gebruik vervolgens de rode fluorescentie om de mKO2-expressie in bètacellen te identificeren, lokaliseer de eilandjes. Reinig het primaire eilandje door voorzichtig het omliggende weefsel te verwijderen, zoals lever en adipocyten.

Neem voorzorgsmaatregelen om het eilandje niet te verwonden of te prikken. Pipetteer vervolgens een druppel van 30 microliter HBSS op het midden van een glazen schotel. Breng vervolgens het gedissekteerde eilandje over in de druppel.

Was het eilandje voorzichtig met HBSS en gebruik vervolgens 30 microliter van een werkoplossing van fibrinogeen om het eenmaal te wassen. Voorkom dat het eilandje tijdens de wasstappen uitdroogt, wat zou kunnen resulteren in celdood. Voeg langzaam en voorzichtig 10 microliter van 10 eenheden per milliliter trombine-oplossing toe aan het eilandje.

Laat het eilandje en de schotel 15 tot 20 minuten onaangeroerd. Observeer dat de druppel fibrinogeen-trombine viskeus en stabiel zal worden. Er moet voldoende tijd worden gegeven voor de trombine om te polymeriseren in de fibrinogeenoplossing.

Anders zal de mal geen stabiliteit bieden tijdens de beeldvormingssessie. Om ex vivo live beeldvorming van GCaMP-fluorescentie uit te voeren, voeg 200 microliter HBSS toe bovenop de mal en plaats de schotel voorzichtig op de plaathouder van de confocale microscoop. Lokaliseer vervolgens met een 20X 0.8 NA foutobjectief en de heldere veldoptie het eilandje.

Gebruik de filter voor rode fluorescentie om de nucleaire mKO2-fluorescentie in bètacellen te bekijken, focus op het eilandje. Individuele kernen moeten duidelijk zichtbaar zijn. Lokaliseer een duidelijk beeldvlak door handmatig door de dikte van het eilandje langs de Z-as te bewegen.

Zorg ervoor dat het beeldvlak 50 tot 100 bètacellen bevat voor beeldvorming en dat de helderheid van de nucleaire mKO2-fluorescentie uniform is, vooral in het midden van het eilandje. Volgend in het smart setup menu, stel een sequentiële acquisitie in voor GCaMP6 en mKO2-fluorescentie met behulp van de volgende instellingen. Kies voor GCaMP6 een excitatie van 488 nanometer en een geschatte emissie van 500 tot 555 nanometer.

Selecteer onder valse kleur GFP. Kies voor mKO2 een excitatie van 561 nanometer en een emissie van 570 tot 630 nanometer. Kies voor de valse kleur mCherry.

Stel in de verwervingsmodus de beeldresolutie in op 1.024 bij 1.024 pixels, de snelheid op 10 en gemiddeld op een. Start een continue opname door de optie voor Time Series te selecteren en de duur in te stellen op 500 cycli met een acquisitietijd van ongeveer twee seconden per frame. Houd het beeldvormingscyclus in de gaten.

Na de eerste 50 frames zonder het beeldverwervingsproces te verstoren, pipet gedurende vijf microliters van 200 millimolair D-glucose-oplossing bovenop de gel die het eilandje vasthoudt. Vervolgens verwerf 150 frames bij 10 millimolair glucose. De eerste 50 frames van de Time Series komen overeen met bètacellenactiviteit bij vijf millimolair glucose.

Dit is de basale activiteit. Een reagerende bètaceel zal wassen en verminderen van groen fluorescentie met de tijd vertonen. Bij 200 frames, verhoog de glucoseconcentratie tot 20 millimolair door voorzichtig 10 microliter van 200 millimolair D-glucose toe te voegen.

Verwerf vervolgens 150 frames bij de 20 millimolair concentratie. Om het afbeeldingsbestand in FIJI te openen, selecteer Plugin, LSM Toolbox, toon LSM Toolbox. Klik in de LSM Toolbox op Open LSM en selecteer het afbeeldingsbestand.

Open onder Tools in het Analyse menu de ROI Manager. Gebruik het polygoonselectiegereedschap in de werkbalk om handmatig de ROI te tekenen. Teken de ROI in het rode kanaal zodat deze een oppervlakte groter dan een kern bedekt om een deel van het cytoplasma van de cel te omvatten.

Zorg ervoor dat de ROI-positie consistent is tussen frames en pas de positie indien nodig aan. Voeg de geselecteerde ROI's toe aan de ROI Manager door op de toevoegen knop te klikken. Selecteer en voeg meerdere ROI's toe om gegevens over meerdere cellen te verkrijgen.

Selecteer vervolgens uit het Analyse menu Set Measurements. Selecteer vervolgens Integrated density voor het specificeren van de extractie van totale fluorescentie-intensiteit binnen het gebied. Schakel naar het groene kanaal met de GCaMP-fluorescentie en selecteer in de ROI Manager Multi Measure.

Dit geeft de intensiteitsmetingen voor de cellen gedurende de Time Series. Sla de FIJI-uitvoer op als een door komma's gescheiden tekstbestand. Haal uit de LSM Toolbox de tijdstempels van de afbeeldingsframes. Gebruik Apply Stamps, Apply t-stamps, File Name, Dump naar tekstbestand, om de tijdstempels te verkrijgen. Sla de tijdstempels op met de optie Opslaan als of kopieer ze naar de spreadsheet. Bij het samenstellen van de intensiteitswaarden voor alle cellen, voer de analyse uit een cel per keer of automatisch uit.

Raadpleeg het tekstprotocol voor aanvullende details. In dit experiment werden individuele primaire eilandje bètacellen van 45 DPF transgene lijn die nucleair mKO2 en GCaMP6 specifiek in bètacellen tot expressie brengt, gestimuleerd met een glucoseramp en vervolgens gedepolariseerd met kaliumchloride. De activiteit van de cellen werd geanalyseerd