Name: Analyse van bèta-cel functie met behulp van de resolutie van de eencellige Calcium Imaging in Zebrafish eilandjes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Leer bètacelfunctie analyseren met eencellige calciumbeeldvorming in zebrafis-eilandjes. Deze methode biedt hoge resolutie voor het bestuderen van glucose-respons en functionele heterogeniteit in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wij danken de leden van het Ninov lab voor opmerkingen op het manuscript, leden van centrum voor regeneratieve therapieën Dresden (CRTD) vis en microscopie faciliteit voor technische bijstand. N.N. wordt ondersteund door financiële middelen van de DFG-CRTD, Cluster van Excellence bij TU-Dresden, Duits onderzoek Stichting (DFG) en het Duitse Center voor Diabetes onderzoek (DZD).

Alle procedures met inbegrip van dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door de Animal Welfare Act en met toestemming van de Landesdirektion Sachsen, Duitsland (AZ 24-9168.11-1/2013-14, T12/2016).
1. voorbereiding
Opmerking: Dit protocol is voor ex vivo beeldvorming van de primaire islet zebrafish van dubbele transgene Tg (ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); GS (ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry) 19 zebrafish. In deze transgene lijn, de insuline-promotor (ins) rijdt de specifieke expressie bèta-cel van de twee transgenen: nls-Renilla-mKO2, die de kern van de beta-cellen met monomere Kusabira oranje 2 (mKO2) markeert fluorescentie; en GCaMP6s15, die stoot groene fluorescentie in reactie op de stijging van de intracellulaire calciumgehalte. De bèta-cel-specifieke uitdrukking van GCaMP6s kan bestuderen van het glucose-reactievermogen van de beta-cellen zonder inmenging van calcium veranderingen in het omringende celtypes.
<ol><li>Bereiden van verse fibrinogeen voorraad (10 mg/mL) door het oplossen van 10 mg van boviene fibrinogeen in 1 mL Ca2 +/Mg2 +-met Hanks evenwichtige zoutoplossing (HBSS) in een centrifugebuis 1,5 mL. Vortex krachtig tot het fibrinogeen poeder lost volledig. Bewaar deze oplossing bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 minuten meer. Opmerking: De voorraad kan worden bewaard bij kamertemperatuur voor 2 – 3 h. negeren de voorraad als de oplossing begint te polymeriseren en viskeuze wordt.</li>
	<li>Bereid de fibrinogeen werkende oplossing (3.3 mg/mL) door verdunning van de voorraad van fibrinogeen drieledig in HBSS. Bijvoorbeeld, Meng 300 µL van fibrinogeen voorraad in 600 µL van HBSS te bereiden 900 µL van fibrinogeen werkende oplossing.</li>
	<li>Bereid trombine-oplossing (10 U/mL) door ontbinding 10 eenheden van trombine in 1 mL HBSS of fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Opmerking: Deze oplossing kan worden voorbereid, aliquoted in 50 µL delen en bevroren bij-20 ° C.</li>
	<li>200 mM D-glucose oplossing voor te bereiden door het oplossen van 1,8 g van D-Glucose in 50 mL water. Houd in 4 ° C voor langdurige opslag.</li>
	<li>300 mM KCl oplossing voor te bereiden door het oplossen van 1.1 g van KCl in 50 mL water. Houd in 4 ° C voor langdurige opslag.</li>
	<li>Aanschaffen van 35 mm diameter glas-onderkant gerechten voor de montage van de eilandjes.</li>
	<li>Gebruik voor de dissectie en de montage van het eilandje, een stereomicroscoop uitgerust met fluorescentie lamp en rood filter kubus (TRITC: excitatie: 532 – 554 nm, emissie: 570 – 613 nm; of Texas-rood: excitatie: 540-580 nm, emissie: 592-667 nm).</li>
	<li>Voor de beeldvorming van de calcium instroom in bèta-cellen, gebruik een omgekeerde confocal microscoop (Zeiss LSM 780 of gelijkaardig) met 20 X (0.8 nvt) lucht doelstelling en uitgerust met een plaat houder voor de 35 mm diameter glas-onderkant gerechten.</li>
	<li>Voorbereiden op een 200 mg/L-oplossing van tricaïne methaan sulfonaat (MS222) euthanizing de zebravis.</li>
	<li>90 mm petrischalen aanschaffen voor de zebravis dissectie.</li>
</ol>2. de zebravis primaire Islet dissectie en montage
<ol><li>Euthanaseren een vis langdurige incubatie met MS222. Voor dit, zachtjes verwijderen de vissen uit de vissentank met behulp van een visnet en Incubeer het in een petrischaal met de oplossing van de MS222 totdat het dier toont geen beweging van de operculaire (kieuwen); typisch, dit duurt 5 min. overdracht de vis naar een petrischaal met de HBSS oplossing met Ca2 +/Mg2 +.</li>
	<li>
Ontleden onder een stereomicroscoop uitgerust met fluorescentie lamp en een rood filter kubus, de huid die betrekking hebben op de rechterkant van de buik van het dier te isoleren van de alvleesklier.
	<ol>
<li>Snijd de huid van de zebravis van mond naar anaalvin met scherpe pincet hiervoor. Schil weg de gesneden huid blootstellen van de buik; Deze snipping bloot de interne organen. Met behulp van de rode fluorescentie van mKO2 expressie in de beta-cellen, gaan de locatie van de eilandjes door visueel onderzoek onder de Microscoop. Verwijder zo nodig de lobben van de lever, zoals zij betrekking op het rotseilandje hebben kunnen, waardoor het moeilijk te vinden. Opmerking: De primaire eilandje ligt in de buurt van de voorste regio van de buik, meestal aan de rechterkant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Reinig de primaire islet door het zorgvuldig verwijderen van omliggende weefsel zoals lever en adipocytes. Het nemen van voorzorgsmaatregelen niet te verwonden of steken van het rotseilandje; na verrekening van het omringende weefsel, worden de afzonderlijke cellen op het oppervlak van het eilandje waarneembaar.</li>
	<li>Pipetteer een druppel van de 30 µL van HBSS in het midden van een glazen-bodem schotel. De ontleed islet overbrengen in deze daling.</li>
	<li>Grondig wassen het rotseilandje eenmaal met HBSS en eenmaal met 30 µL van de werkoplossing fibrinogeen (3.3 mg/mL). Zorg ervoor om te voorkomen dat het drogen van het eiland tijdens de stappen wassen omdat het niet te doen leidt tot celdood.</li>
	<li>Voeg toe 10 µL van de trombine oplossing (10 U/mL) langzaam en voorzichtig. Ongewijzigd te laten het eilandje en de schotel voor 15-20 min. Let op dat de daling van de fibrinogeen-trombine viskeuze en enigszins dekkend op dit punt zal worden.</li>
</ol>3. Ex Vivo wonen-imaging van GCaMP-intensiteit van de fluorescentie in Zebrafish primaire eilandjes
<ol><li>Voeg 200 µL van HBSS op de top van de schimmel en zet de schotel voorzichtig aan de houder van de plaat van de confocal microscoop. Gebruik een 20 X 0.8 nb, lucht doelstelling voor confocal imaging. Zoek het eilandje met behulp van de optie helderveld.</li>
	<li>Met behulp van het filter voor rode fluorescentie te bekijken van de nucleaire mKO2-fluorescentie in beta-cellen, richten op het eilandje. Individuele kernen moet duidelijk zichtbaar zijn.</li>
	<li>Zoek een duidelijke imaging vliegtuig door handmatig het brandvlak van de confocal microscoop zodat het doorlopen van de dikte van het eiland langs de z-as te wijzigen. Ervoor zorgen dat de beeldvorming vliegtuig voldoende (50-100) van beta-cellen voor imaging bevat, en de helderheid van de nucleaire mKO2-fluorescentie uniform, met name in het midden van het eilandje is.</li>
	<li>Instellen van een sequentiële aanwinst voor GCaMP6s en mKO2 fluorescentie met behulp van de volgende instellingen in het "Smart configuratiemenu": GCaMP6s, excitatie: 488 nm, emissie: 500 – 555 nm, onwaar-kleur: groen (Selecteer "GFP"); mKO2, excitatie: 561 nm (mCherry), emissie: 570 – 630 nm, onwaar-kleur: rood (Selecteer "mCherry"). Opmerking: Met deze instelling, het rode kanaal behaalt de positie van bèta-celkernen, terwijl het groene kanaal de intensiteit van de fluorescentie GCaMP behaalt.</li>
	<li>Resolutie van de afbeelding instellen op 1024 x 1024 pixels, snelheid op 10 en gemiddeld op 1 in de "overname Mode". Geïnitieerde een continu opnemen door de optie voor "Time-serie" en de "duur" voor 500 cycli, met ongeveer 2 s overname keer per frame in te stellen. Opmerking: De eerste 50 frames van de tijd-serie overeen met de activiteit van de beta-cellen met glucose gehalte van 5 mM. Dit is de reactie van de basislijn. Een reagerende bèta-cel zal tonen wassende en afnemende in de intensiteit van de groene fluorescentie met tijd. Wij hebben geconstateerd dat een paar (1-5%) van de beta-cellen op 5 mM glucose oscilleren.</li>
	<li>
Houd een oogje op de imaging cyclus. Na de eerste 50 frames, verhogen de concentratie glucose van de omringende oplossing tot 10 mM zonder het stoppen van de opname.
	<ol>
<li>Zonder storing veroorzaakt de Beeldacquisitie, zachtjes Pipetteer 5 µL van de 200 mM D-glucose oplossing op de top van de gel houden van het eilandje. Verwerven van 150 frames aan 10 mM glucose. Opmerking: De toename van de concentratie van glucose zal toenemen met het aantal bèta-cellen ondergaan GCaMP fluorescerende oscillaties in het groene kanaal.</li>
		<li>Erop toezien dat de kernen van de cellen stabiel tijdens het proces blijven. Als het eilandje te uitgebreid tijdens de overname schudden is en de kernen zijn verhuizen van het brandvlak, gooi het monster (indien nodig).</li>
		<li>Wacht een voldoende lange periode van polymerisatie van de schimmel fibrinogeen-trombine tijdig met het oog op de stabiliteit van de latere monsters.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bij 200 kaders, verdere verhoging de concentratie van de oplossing tot 20 mM door zachtjes pipetteren 10 µL van de 200 mM D-glucose-oplossing. Verwerven van 150 frames voor de concentratie van 20 mM.</li>
	<li>Depolarize na 350 frames, het eilandje met behulp van 30 mM van KCl. Voeg 20 µL van de 300 mM KCl stockoplossing hiervoor. In dit stadium, vaststellen dat de GCaMP6s fluorescentie oscillaties zal stoppen en met een hoge intensiteit repareren; beta-cellen die niet op glucose reageren kunnen ook een toename in groen-fluorescentie intensiteit op KCL toevoeging weergeven.</li>
</ol>4. kwantificering van GCaMP fluorescentie Trace voor afzonderlijke Beta-cellen
Opmerking: Als u wilt traceren en kwantificeren van de reacties van individuele beta-cellen op verschillende niveaus van de glucose, kwantificeren de intensiteit van de fluorescentie GCaMP voor de gehele periode van de beeldvorming. Kwantificering gebeurt in cellulaire resolutie. Hiervoor gebruik van FIJI20 om de intensiteitswaarden van de fluorescentie van de GCaMP uit de beelden (stappen 4.1-4.6), en de spreadsheet-software of de R21 voor het uitvoeren van de analyse (stappen 4.8 – 4,9).
<ol><li>Open het afbeeldingsbestand in FIJI met behulp van de "LSM gereedschapskist". Hiervoor selecteer "Plugin | LSM Toolbox | Toon van LSM toolbox". In de "LSM werkset", klik op "Open LSM" en selecteer het afbeeldingsbestand. Opmerking: Voor formaten niet ondersteund door de "LSM gereedschapskist", converteren ze eerst tiff voor analyse.</li>
	<li>Pak de reacties van cellen met behulp van het hulpprogramma (ROI) regio-of-interest in FIJI. Open de "ROI-Manager" in het menu "Analyseren" onder "Tools". Handmatig tekenen de ROI met behulp van de "selectiegereedschap veelhoek" gelegen in de werkbalk.</li>
	<li>Trekken de ROI in het rode kanaal waarin de kernen van de bèta-cel zichtbaar zijn. Selecteer de ROI zodanig dat het een oppervlakte groter is dan de kern van een cel om op te nemen sommige van het cytoplasma van de cel. Ervoor zorgen dat de positie van de ROI consistente tussen frames en de positie aanpassen indien nodig.</li>
	<li>De geselecteerde ROIs aan de "ROI-manager" toevoegen door te klikken op de knop "Add [t]". Selecteren en toevoegen van meerdere ROIs aan de ROI voor het verkrijgen van gegevens over meerdere cellen.</li>
	<li>Vervolgens het menu "Analyseren" Selecteer "Set metingen". Selecteer "Geïntegreerde dichtheid" voor het opgeven van de extractie van totale fluorescentie intensiteit binnen het gebied.</li>
	<li>Verschuiven naar het groene kanaal met de fluorescentie GCaMP en selecteer "Multi maatregel" in de "ROI-Manager". Opmerking: Dit zorgt voor de intensiteit-metingen voor de cellen gedurende de tijd-serie.</li>
	<li>In het geval dat de positie van de ROI moet worden aangepast als gevolg van beweging van het eiland, handmatig compileren de metingen van de intensiteit in verschillende frames. Kopieer en plak de waarden naar een apart werkblad.</li>
	<li>De tijdstempels van de afbeeldingsframes verkrijgen "LSM gereedschapskist". Gebruik "postzegels | T postzegels | Bestandsnaam | Dumpen naar tekstbestand' voor de tijdstempels. Opslaan van tijdstempels met behulp van de optie "Opslaan als" of kopieer ze naar het werkblad.</li>
	<li>Bij het samenstellen van de intensiteitswaarden voor alle cellen, de analyse één cel tegelijk of automatisch (bijvoorbeeldmet behulp van Excel-formules of R) uit te voeren.</li>
	<li>
Analyseren van afzonderlijke cellen in twee stappen.
	<ol>
<li>In de eerste stap, de intensiteit van de fluorescentie boven de basislijn worden berekend. Bereken de basislijn fluorescerende intensiteit (F0) als het gemiddelde van de fluorescentie intensiteiten voor de eerste 50 frames (5 mM glucose) te dien einde. Vervolgens aftrekken van de basislijn (F0) uit de hele tijd-serie (F-F0). Opmerking: een paar cellen prima overweg met duidelijke GCaMP oscillaties onder basale glucose, die meestal blijven na stimulatie met hogere concentraties. Voor dergelijke cellen is het alleen mogelijk om te schatten F0 door middel van de gemiddelde intensiteit van de initiële frames waarin de cellen een daling in de fluorescentie toonde.</li>
		<li>In de tweede stap van de analyse, de definitieve GCaMP fluorescentie intensiteit te verkrijgen door het normaliseren van de intensiteit van de fluorescentie. Opmerking: Dit is uitgevoerd om te verwijderen van de verschillen tussen eilandjes van verschillende dieren. Individuele eilandjes weer verschillende niveaus van fluorescentie emissie op glucose stimulatie.</li>
		<li>De intensiteit van de fluorescentie normaliseren door het onder te verdelen met de hoogste intensiteitswaarde. Hiervoor berekenen de piek intensiteit (Fmax -F0), en deelt u de basislijnwaarden afgetrokken door piek intensiteit aan het rendement van de uiteindelijke GCaMP fluorescentie intensiteit (F-F0) / (Fmax -F0).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gooi de cellen die niet een verandering in intensiteit na KCl stimulatie, vertonen als ze misschien wel ongezond of beschadigd.</li>
	<li>Voor het uitvoeren van de analyse (stappen 4.9-4.10) in R, het gebruik van het script van de R (plotcelltrace. R) voorzien van dit manuscript.</li>
</ol>

<ol><li>Kahn, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relative+contributions+of+insulin+resistance+and+beta-cell+dysfunction+to+the+pathophysiology+of+Type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">The relative contributions of insulin resistance and beta-cell dysfunction to the pathophysiology of Type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 46 (1), 3-19 (2003).</li>
<li>Ogurtsova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDF+Diabetes+Atlas%3A+Global+estimates+for+the+prevalence+of+diabetes+for+2015+and+2040%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Res+Clin+Pract%22%5BJournal%5D)">IDF Diabetes Atlas: Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040.</a> Diabetes Res Clin Pract. 128, 40-50 (2017).</li>
<li>Pipeleers, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+pancreatic+beta-cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in pancreatic beta-cell population.</a> Diabetes. 41 (7), 777-781 (1992).</li>
<li>MacDonald, P. E., Joseph, J. W., Rorsman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-sensing+mechanisms+in+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Glucose-sensing mechanisms in pancreatic beta-cells.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 360 (1464), 2211-2225 (2005).</li>
<li>Hellman, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+induces+oscillatory+Ca2%2B+signalling+and+insulin+release+in+human+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Glucose induces oscillatory Ca2+ signalling and insulin release in human pancreatic beta cells.</a> Diabetologia. 37, Suppl 2. S11-S20 (1994).</li>
<li>Bergsten, P., Grapengiesser, E., Gylfe, E., Tengholm, A., Hellman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synchronous+oscillations+of+cytoplasmic+Ca2%2B+and+insulin+release+in+glucose-stimulated+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Synchronous oscillations of cytoplasmic Ca2+ and insulin release in glucose-stimulated pancreatic islets.</a> J Biol Chem. 269 (12), 8749-8753 (1994).</li>
<li>Wollheim, C. B., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+cytosolic+free+Ca2%2B+and+insulin+release+in+an+insulin-secreting+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Correlation between cytosolic free Ca2+ and insulin release in an insulin-secreting cell line.</a> J Biol Chem. 259 (4), 2262-2267 (1984).</li>
<li>Pace, C. S., Price, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+responses+of+pancreatic+islet+cells+to+secretory+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Electrical responses of pancreatic islet cells to secretory stimuli.</a> Biochem Biophys Res Commun. 46 (4), 1557-1563 (1972).</li>
<li>Ohara-Imaizumi, M., Nakamichi, Y., Tanaka, T., Ishida, H., Nagamatsu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+exocytosis+of+single+insulin+secretory+granules+with+evanescent+wave+microscopy%3A+distinct+behavior+of+granule+motion+in+biphasic+insulin+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Imaging exocytosis of single insulin secretory granules with evanescent wave microscopy: distinct behavior of granule motion in biphasic insulin release.</a> J Biol Chem. 277 (6), 3805-3808 (2002).</li>
<li>Soria, B., Martin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+calcium+oscillations+and+insulin+release+in+pancreatic+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Metab%22%5BJournal%5D)">Cytosolic calcium oscillations and insulin release in pancreatic islets of Langerhans.</a> Diabetes Metab. 24 (1), 37-40 (1998).</li>
<li>Kenty, J. H. R., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+pancreatic+islet+function+at+the+single+cell+level+by+calcium+influx+with+associated+marker+expression%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Testing pancreatic islet function at the single cell level by calcium influx with associated marker expression.</a> PLoS One. 10 (4), e0122044(2015).</li>
<li>Speier, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+in+vivo+imaging+of+pancreatic+islet+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Noninvasive in vivo imaging of pancreatic islet cell biology.</a> Nat Med. 14 (5), 574-578 (2008).</li>
<li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2013 (2), 83-99 (2013).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).</li>
<li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+quiescent+and+proliferative+pancreatic+beta-cells+identified+by+HOTcre+mediated+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (35), 14896-14901 (2009).</li>
<li>Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+ablation+of+beta+cells+in+the+embryonic+zebrafish+pancreas+using+E.+coli+nitroreductase%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase.</a> Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).</li>
<li>Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitroreductase-mediated+cell%2Ftissue+ablation+in+zebrafish%3A+a+spatially+and+temporally+controlled+ablation+method+with+applications+in+developmental+and+regeneration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies.</a> Nat Protoc. 3 (6), 948-954 (2008).</li>
<li>Singh, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+developmental+histories+of+beta-cells+generate+functional+and+proliferative+heterogeneity+during+islet+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Different developmental histories of beta-cells generate functional and proliferative heterogeneity during islet growth.</a> Nat Commun. 8 (1), 664(2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676(2012).</li>
<li>R Core Team. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing%22">R: A Language and Environment for Statistical Computing</a>. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.r-project.org/">https://www.r-project.org/</a> (2016).</li>
<li>Friedman, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolving+autoimmune+microenvironment+regulates+the+quality+of+effector+T+cell+restimulation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">An evolving autoimmune microenvironment regulates the quality of effector T cell restimulation and function.</a> Proc Natl Acad Sci. 111 (25), 9223-9228 (2014).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+adult+zebrafish+as+a+tool+for+in+vivo+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Bader, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proliferative+and+mature+%CE%B2-cells+in+the+islets+of+Langerhans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of proliferative and mature β-cells in the islets of Langerhans.</a> Nature. 535 (7612), 430-434 (2016).</li>
<li>Dorrell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+islets+contain+four+distinct+subtypes+of+%CE%B2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Human islets contain four distinct subtypes of β cells.</a> Nat Commun. 7, 11756(2016).</li>
<li>Johnston, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta+Cell+Hubs+Dictate+Pancreatic+Islet+Responses+to+Glucose%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Beta Cell Hubs Dictate Pancreatic Islet Responses to Glucose.</a> Cell Metab. 24 (3), 389-401 (2016).</li>
</ol>

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Hier tonen we een techniek voor de kwantificering van bèta-cel glucose reactievermogen bij eencellige resolutie. Dit wordt mogelijk gemaakt door monitoring van intracellulair calcium concentratie met behulp van een genetisch-gecodeerde calcium-indicator, GCaMP6s. De activiteit van de bèta-cel is gevangen ex vivo door de montage van het eilandje in een mal van fibrinogeen-trombine. Een kritieke stap van het protocol is de stabiliteit van de schimmel. Voldoende tijd moet worden gegeven voor de fibrinogeen te ontbinden in de HBSS oplossing. Zonder dit doet de schimmel niet voldoende polymeriseren om te zorgen voor stabiliteit tijdens de imaging-sessie. Een eilandje gemonteerd in fibrinogeen-trombine schimmel en ondergedompeld in cel voedingsbodems kunt levensvatbaar blijven voor ten minste een week (gegevens niet worden weergegeven). Alternatieven voor de schimmel fibrinogeen-trombine, zoals lage-smelt agarose, kunnen worden gebruikt om het monteren van de eilandje-22. Een andere belangrijke parameter is de dissectie van het eiland. Tijdens deze stap moet het weefsel rondom het eilandje worden verwijderd zonder verwonden of prikken van het eilandje. Een bekwame dissectie wordt geleverd met de praktijk.
Een beperking van de imaging protocol is de beperking tot één van de confocal vlakken van het eiland. Dit wordt gedaan om het vastleggen van de dynamiek van calcium toestroom binnen afzonderlijke bèta-cellen. Een Z-stapel door de gehele dikte van het rotseilandje leidt tot lage imaging snelheden en verlies van oscillerende signaal van de afzonderlijke cellen. Deze beperking kan worden verbeterd door gebruik te maken van snellere vervoermiddelen zoals spinnen-schijf microscopie, confocal-imaging om het vastleggen van de dynamiek van de calcium in 3 dimensies. Een andere grens zou in vivo calcium imaging12. Het transparante karakter van de zebravis embryo of het gebruik van pigment-minder stammen van zebravis volwassenen23 kan de mogelijkheid voor in vivo imaging in de toekomst bieden.
De beeldvorming van bèta-cel activiteit met hoge ruimtelijke en temporele resolutie kan onderzoeken van de functionele heterogeniteit tussen individuele beta-cellen. Deze aanpak kan helpen licht werpen op het bestaan van de bèta-cel subpopulatie. Meerdere studies hebben onlangs, het bestaan van de subpopulatie aangetoond in de nominaal homogene beta-cellen24,25,26. Ex vivo imaging kan gecombineerd worden met genetische verslaggevers te karakteriseren van de sub-bevolking van reactie op glucose. Bovendien, kan het combineren van de beeldvorming setup met farmacologische stimulatie zorgen voor screening van verbindingen die bèta-cel functie zouden kunnen verbeteren.
Kortom kunt de techniek die hier gepresenteerd kwantificering en vergelijking van het reactievermogen van de glucose voor individuele beta-cellen. Het biedt een directe venster in bèta-cel functie, een belangrijke parameter in de ontwikkeling van diabetes.

Onze bloed-glucose wordt onderhouden in een smalle bandbreedte, voor een groot deel te wijten aan de functie van de endocriene alvleesklier. De endocriene functie van de alvleesklier wordt uitgevoerd door de eilandjes van Langerhans, die hormoon-afscheidende cellen bevatten. De insuline-afscheidende beta-cellen zijn verantwoordelijk voor het verminderen van de niveaus van de bloedglucose na een maaltijd van koolhydraten bevatten. Onvoldoende insuline secretie van bèta-cel kan leiden tot diabetes1, dat wordt gekenmerkt door aanhoudende hoge bloedglucose. Type 1 en Type 2 Diabetes, die momenteel meer dan 400 miljoen mensen wereldwijd treft, leidt tot de morbiditeit en mortaliteit2. Door onderzoek naar de moleculaire en ecologische factoren die aan bèta-cel dysfunctie bijdragen, zullen wij beter begrijpen hoe diabetes type 2 begint en vordert. Daarnaast bieden de mogelijkheid om te differentiëren van menselijke stamcellen in functionele beta-cellen in vitro een bron van nieuwe bèta-cellen voor cel-vervangende therapieën bij Type 1 Diabetes. Te dien einde is het belangrijk om te studeren van bèta-cel functie en rijping in genetische modelorganismen om te krijgen de nodige kennis voor het maken van functionele beta-cellen in een schotel.
Bèta-cel functie kan worden gecontroleerd op het niveau van de gehele-islet door het kwantificeren van de totale hoeveelheid insuline afgescheiden in reactie op glucose-stimulatie. Deze cumulatieve benadering bestudeert het rotseilandje als een enkele groep cellen zonder differentiatie van de afzonderlijke eigenschappen van een cel. Echter bleek de analyse van de glucose reacties van afzonderlijke bèta-cellen een diversiteit in de functionele eigenschappen van de beta-cellen en de aanwezigheid van heterogeniteit3. Om te beoordelen van de functie van individuele beta-cellen, is het mogelijk om te controleren de intracellulaire veranderingen die tot insuline secretie4 leiden. Insuline secretie wordt voorafgegaan door een vermelding van glucose in de beta-cellen. De glucose die in de beta-cellen invoert wordt snel gemetaboliseerd aan ATP. Hogere intracellulaire concentraties van ATP verkleinen de kans op open ATP-gevoelige kalium ionenkanalen leidt tot bèta-cel depolarisatie. Depolarisatie wordt geopend van de spanning-gevoelige calcium ionenkanalen en verhoogt van intracellulair calcium. Op zijn beurt activeert calcium exocytose van insuline, die is uitgebracht in het verkeer en verlaagt glucoseniveaus door het stimuleren van glucose-gebruik5,6,7.
Verschillende strategieën hebben toegepast voor het onderzoek naar de functie van de beta-cellen, met inbegrip van monitoring van het membraan potentiële8, de directe visualisatie van insuline-blaasjes exocytose9en kwantificering van intracellulaire Ca2 + toestroom als een proxy voor glucose-reactievermogen10. Onder hen biedt beeldvorming van intracellulaire Ca2 + het voordeel van opschalen de analyse op meerdere individuele cellen binnen de dezelfde islet11,12, waardoor directe vergelijking van de glucose-reactie tussen individuele beta-cellen. Intracellulaire Ca2 + concentratie kan met calcium-gevoelige fluorescente kleurstoffen13 of14indicatoren (GECIs) genetisch-gecodeerde calcium worden gecontroleerd. Overwegende dat de calcium-indicator kleurstoffen ontbreken celtype specificiteit, GECIs kan worden uitgedrukt in een bepaalde celtype door specifieke initiatiefnemers. Daarnaast biedt de nieuwe generatie van GECIs, zoals GCaMP6, beter signal-to-noise verhouding samen met sneller temporal dynamics15. Hier beschrijven we het nut van de nieuwe generatie van GECIs, in het bijzonder GCaMP6s, te visualiseren van calcium in de beta-cellen bij eencellige resolutie. We toepassen deze methode op de primaire eilandje van de zebravis als ons model van keuze. Tijdens de ontwikkeling van het embryo, beta-cellen in de primaire islet zijn afkomstig uit de dorsale en ventrale alvleesklier ontluikt16. Het primaire eilandje ligt op een stereotiepe anatomische positie binnen de zebravis alvleesklier, waardoor haar gemakkelijke identificatie en isolatie. Beta-cellen in de primaire islet zijn nodig om glucose-verordening, omdat hun genetische ablatie tot hyperglycemie17,18 leidt. Bovendien worden deze beta-cellen glucose-responsieve tijdens de vroege ontwikkeling van de zebravis19. Dit protocol kan ook worden toegepast op de secundaire eilandjes, die tijdens de post embryonale stadia vormen imaging. Het protocol kan beeld beta-cellen ex vivo, in latere stadia van ontwikkeling en onder gedefinieerde glucose concentraties.

<table><tbody><tr><td>Transgenic Zebrafish line: Tg(ins:nls-Renilla-mKO2; cryaa:CFP); Tg(ins:GCaMP6s; cryaa:mCherry)</td><td></td><td></td><td>Op verzoek van de auteurs</td></tr><tr><td>Stereo microscoop</td><td>ZEISS</td><td>495015-0001-000</td><td>SteREO Discovery.V8</td></tr><tr><td>Fluorescentielamp</td><td>ZEISS</td><td>423013-9010-000</td><td>Illuminator HXP 120 V</td></tr><tr><td>Rode Filter Cube</td><td>ZEISS</td><td>000000-1114-462&nbsp;</td><td>Filter set 45 HQ TexasRed</td></tr><tr><td>Confocale Microscoop</td><td>ZEISS</td><td>LSM 780</td><td></td></tr><tr><td>Bovine fibrinogeen</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (Hanks' Balanced Salt oplossing)</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Trombine</td><td>Sigma</td><td>T4648</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>35 mm diameter glazen bodem schotels</td><td>ThermoFisher</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>tricaine methaansulfonaat</td><td>Sigma</td><td>E10521&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Fijne pincetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>11445-12</td><td></td></tr><tr><td>FIJI, met behulp van ImageJ Versie: 2.0.0-rc-43/1.50e</td><td></td><td></td><td>https://fiji.sc/</td></tr><tr><td>R, versie 3.2.4</td><td></td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr><tr><td>RStudio</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/</td></tr><tr><td>plotcelltrace.R</td><td></td><td></td><td>Een aangepast script dat bij het manuscript is geleverd</td></tr></tbody></table>

analyse van bèta-cel functie met behulp van de resolutie van de eencellige calcium imaging in zebrafish eilandjes

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Alvleesklier beta-cellen reageren op de toenemende bloed glucose concentraties door afscheidende het hormoon insuline. De disfunctie van de beta-cellen leidt tot hyperglycemie en ernstige, levensbedreigende gevolgen. Inzicht in de werking van de beta-cellen onder fysiologische omstandigheden en welke factoren van genetische en omgevingsfactoren kunnen hun disfunctie kan leiden tot betere behandelingsopties voor diabetische patiënten. De mogelijkheid voor het meten van het calciumgehalte in beta-cellen fungeert als een belangrijke indicator voor bèta-cel functie, als de toestroom van calcium ionen triggers insuline. Hier beschrijven we een protocol voor het toezicht op de toestroom van de glucose-gestimuleerd calcium in zebrafish beta-cellen met behulp van GCaMP6s, een genetisch gecodeerde sensor van calcium. De methode zorgt voor de opvolging van de dynamiek van intracellulair calcium met eencellige resolutie in ex vivo gemonteerd eilandjes. Het glucose-reactievermogen van de beta-cellen binnen de dezelfde islet kan worden vastgelegd gelijktijdig onder verschillende glucose concentraties, die de aanwezigheid van functionele heterogeniteit onder zebrafish beta-cellen suggereert. Bovendien is de techniek biedt hoge temporele en ruimtelijke resolutie, die de oscillerende aard van de instroom van calcium op glucose stimulatie onthult. Onze benadering opent de deuren voor het gebruik van de zebravis als model te onderzoeken van de bijdrage van genetische en omgevingsfactoren factoren naar bèta-cel functie en dysfunctie.

Met behulp van het protocol zoals hierboven beschreven, werden de reacties van de glucose van de beta-cellen in een eilandje van een zebravis 45 dagen na bevruchting (dpf) geanalyseerd. Hiervoor was het primaire rotseilandje ontleed van een euthanized dier en gemonteerd in de fibrinogeen-trombine schimmel in een glazen-bodem schotel. Het eilandje werd ondergedompeld in HBSS met 5 mM glucose. De concentratie van glucose werd verhoogd op een stapsgewijze manier 10 mM en 20 mM. De reacties van beta-cellen op de stijgende glucose-concentraties werden geregistreerd. Ten slotte werden de beta-cellen depolarized met behulp van 30 mM KCl (Figuur 1). De depolarisatie met behulp van KCl induceert calcium vermelding in gezonde bèta-cellen.
Met behulp van FIJI en een data-analysesoftware, de intensiteit van de fluorescentie GCaMP6s van individuele beta-cellen is geëxtraheerd en genormaliseerd (Figuur 2). Zoals blijkt uit het spoor van de intensiteit van de fluorescentie, weergeven individuele beta-cellen oscillaties in GCaMP6s fluorescentie op glucose stimulatie, die op KCl stimulatie stopt. De techniek biedt een mobiele oplossing van bèta-van de cel glucose-reactievermogen en een raam in hun functionaliteit.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig1.jpg"> Figuur 1: Ex vivo wonen-imaging van calcium toestroom in zebrafish beta-cellen met behulp van GCaMP6s. Een primaire eilandje van Tg(ins:nls-Renilla-mKO2); TG(ins:GCaMP6s) zebrafish (45 dpf) was gemonteerd in fibrinogeen-trombine schimmel en geïncubeerd met 5 mM (basale) glucose. Beta-cellen waren gemarkeerd met een rode nucleaire marker, terwijl de GCaMP6s fluorescentie aanwezig in het groene kanaal is. Het eilandje werd gestimuleerd met een glucose-oprit bestaande uit opeenvolgende incubatie met 10 mM en 20 mM D-glucose en depolarized via de toevoeging van 30 mM die KCl. pijlpunten mark individuele beta-cellen waarvan de activiteit werd geanalyseerd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57851/57851fig2.jpg"> Figuur 2: genormaliseerde GCaMP6s fluorescentie intensiteit-trace voor individuele beta-cellen. Genormaliseerde GCaMP6s fluorescentie intensiteit-trace voor de beta-cellen gemarkeerd met pijlpunten in Figuur 1. De x-as geeft de tijd in seconden. Aan de top verbeelden bars de concentratie van glucose en KCl in de HBSS medium. De y-as geeft de genormaliseerde fluorescentie intensiteit tijdens de tijd-serie. Hiervoor wordt basislijn intensiteit (F0) berekend als de gemiddelde intensiteit tijdens de incubatie in 5 mM glucose. Dit wordt afgetrokken van de volledige gegevens van de tijd-serie (F - F0). De intensiteit-over basislijn is genormaliseerd door de maximale intensiteit, weergegeven door de cel (F - F0) / (Fmax- F0). De genormaliseerde trace toont een oscillerende reactie van beta-cellen om glucose, die gelijk wanneer de cellen zijn depolarized met 30 mM KCl. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57851/57851fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Bèta-cel functie is belangrijk voor de homeostase van de bloedglucose, die bij eencellige resolutie met behulp van een genetisch gecodeerde verslaggever voor calcium toestroom wordt geëvalueerd.

Analyse van bèta-cel functie met behulp van de resolutie van de eencellige Calcium Imaging in Zebrafish eilandjes

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Deze methode kan helpen bij het begrijpen van belangrijke vragen in het bètacellenveld. Zoals de heterogene functie onder individuele bètacellen binnen een eilandje. Het grote voordeel van deze techniek is de ruimtelijke en temporele resolutie die wordt geboden door live beeldvorming van de bètacellen.We kunnen de calciumoscillaties binnen individuele bètacellen vastleggen. Na het doden van een vis volgens het tekstprotocol, breng het over naar een Petrischotel met HBSS-oplossing met calcium en magnesium. Gebruik vervolgens onder een stereomicroscoop uitgerust met een fluorescentielamp en een rode filtercube scherpe pincetten om de huid van de mond naar de anale vin te snijden.Verwijder de gesneden huid aan de rechterkant om de buik bloot te leggen, wat de inwendige organen zal blootleggen. Gebruik vervolgens de rode fluorescentie om de mKO2-expressie in bètacellen te identificeren, lokaliseer de eilandjes. Reinig het primaire eilandje door voorzichtig het omliggende weefsel te verwijderen, zoals lever en adipocyten.Neem voorzorgsmaatregelen om het eilandje niet te verwonden of te prikken. Pipetteer vervolgens een druppel van 30 microliter HBSS op het midden van een glazen schotel. Breng vervolgens het gedissekteerde eilandje over in de druppel.Was het eilandje voorzichtig met HBSS en gebruik vervolgens 30 microliter van een werkoplossing van fibrinogeen om het eenmaal te wassen. Voorkom dat het eilandje tijdens de wasstappen uitdroogt, wat zou kunnen resulteren in celdood. Voeg langzaam en voorzichtig 10 microliter van 10 eenheden per milliliter trombine-oplossing toe aan het eilandje.Laat het eilandje en de schotel 15 tot 20 minuten onaangeroerd. Observeer dat de druppel fibrinogeen-trombine viskeus en stabiel zal worden. Er moet voldoende tijd worden gegeven voor de trombine om te polymeriseren in de fibrinogeenoplossing.Anders zal de mal geen stabiliteit bieden tijdens de beeldvormingssessie. Om ex vivo live beeldvorming van GCaMP-fluorescentie uit te voeren, voeg 200 microliter HBSS toe bovenop de mal en plaats de schotel voorzichtig op de plaathouder van de confocale microscoop. Lokaliseer vervolgens met een 20X 0.8 NA foutobjectief en de heldere veldoptie het eilandje.Gebruik de filter voor rode fluorescentie om de nucleaire mKO2-fluorescentie in bètacellen te bekijken, focus op het eilandje. Individuele kernen moeten duidelijk zichtbaar zijn. Lokaliseer een duidelijk beeldvlak door handmatig door de dikte van het eilandje langs de Z-as te bewegen.Zorg ervoor dat het beeldvlak 50 tot 100 bètacellen bevat voor beeldvorming en dat de helderheid van de nucleaire mKO2-fluorescentie uniform is, vooral in het midden van het eilandje. Volgend in het smart setup menu, stel een sequentiële acquisitie in voor GCaMP6 en mKO2-fluorescentie met behulp van de volgende instellingen. Kies voor GCaMP6 een excitatie van 488 nanometer en een geschatte emissie van 500 tot 555 nanometer.Selecteer onder valse kleur GFP. Kies voor mKO2 een excitatie van 561 nanometer en een emissie van 570 tot 630 nanometer. Kies voor de valse kleur mCherry.Stel in de verwervingsmodus de beeldresolutie in op 1.024 bij 1.024 pixels, de snelheid op 10 en gemiddeld op een. Start een continue opname door de optie voor Time Series te selecteren en de duur in te stellen op 500 cycli met een acquisitietijd van ongeveer twee seconden per frame. Houd het beeldvormingscyclus in de gaten.Na de eerste 50 frames zonder het beeldverwervingsproces te verstoren, pipet gedurende vijf microliters van 200 millimolair D-glucose-oplossing bovenop de gel die het eilandje vasthoudt. Vervolgens verwerf 150 frames bij 10 millimolair glucose. De eerste 50 frames van de Time Series komen overeen met bètacellenactiviteit bij vijf millimolair glucose.Dit is de basale activiteit. Een reagerende bètaceel zal wassen en verminderen van groen fluorescentie met de tijd vertonen. Bij 200 frames, verhoog de glucoseconcentratie tot 20 millimolair door voorzichtig 10 microliter van 200 millimolair D-glucose toe te voegen.Verwerf vervolgens 150 frames bij de 20 millimolair concentratie. Om het afbeeldingsbestand in FIJI te openen, selecteer Plugin, LSM Toolbox, toon LSM Toolbox. Klik in de LSM Toolbox op Open LSM en selecteer het afbeeldingsbestand.Open onder Tools in het Analyse menu de ROI Manager. Gebruik het polygoonselectiegereedschap in de werkbalk om handmatig de ROI te tekenen. Teken de ROI in het rode kanaal zodat deze een oppervlakte groter dan een kern bedekt om een deel van het cytoplasma van de cel te omvatten.Zorg ervoor dat de ROI-positie consistent is tussen frames en pas de positie indien nodig aan. Voeg de geselecteerde ROI's toe aan de ROI Manager door op de toevoegen knop te klikken. Selecteer en voeg meerdere ROI's toe om gegevens over meerdere cellen te verkrijgen.Selecteer vervolgens uit het Analyse menu Set Measurements. Selecteer vervolgens Integrated density voor het specificeren van de extractie van totale fluorescentie-intensiteit binnen het gebied. Schakel naar het groene kanaal met de GCaMP-fluorescentie en selecteer in de ROI Manager Multi Measure.Dit geeft de intensiteitsmetingen voor de cellen gedurende de Time Series. Sla de FIJI-uitvoer op als een door komma's gescheiden tekstbestand. Haal uit de LSM Toolbox de tijdstempels van de afbeeldingsframes. Gebruik Apply Stamps, Apply t-stamps, File Name, Dump naar tekstbestand, om de tijdstempels te verkrijgen. Sla de tijdstempels op met de optie Opslaan als of kopieer ze naar de spreadsheet. Bij het samenstellen van de intensiteitswaarden voor alle cellen, voer de analyse uit een cel per keer of automatisch uit.Raadpleeg het tekstprotocol voor aanvullende details. In dit experiment werden individuele primaire eilandje bètacellen van 45 DPF transgene lijn die nucleair mKO2 en GCaMP6 specifiek in bètacellen tot expressie brengt, gestimuleerd met een glucoseramp en vervolgens gedepolariseerd met kaliumchloride. De activiteit van de cellen werd geanalyseerd

analysis-beta-cell-function-using-single-cell-resolution-calcium

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

In deze video, demonstreren we een methode om de ontwikkeling van gewervelde hersenen te analyseren in levende zebravis embryo's bij enkele cel resolutie door confocale microscopie. Dit omvat de methode waarmee we injecteren van de single-cell zebravis embryo en vervolgens monteren en het imago van de zich ontwikkelende hersenen.

Live-Imaging van de zebravis embryonale Brain door confocale microscopie

This video describes the technique of imaging islet cells in real-time, to study the changes in cytosolic calcium concentration in the minor subpopulations of the pancreatic islet cells. Minor cell subpopulations can be identified using functional responses to marker compounds, such as adrenaline and ghrelin, that induce changes in cytosolic calcium in a specific populations of islet cells. This can provide an insight into the cross talk between the blood glucose and the islet secretory output.

Imaging Calcium Dynamics in Pancreatic Cells: A Technique to Study Real-time Changes in Cytosolic Calcium Concentration in Pancreatic Islet

Dit protocol beschrijft een methode voor het isoleren van enkele cellen uit zebravis-embryo's, het verrijken van cellen van belang, het vastleggen van zebraviscellen in microfluïdische gebaseerde enkelcellige multiplexsystemen en het beoordelen van genexpressie uit enkele cellen.

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

De zebravis is een modelsysteem dat heeft veel waardevolle eigenschappen met inbegrip van optische helderheid, snelle externe ontwikkeling, en, met name van belang op het gebied van gehoor en evenwicht extern gelegen zintuiglijke haarcellen. Dit artikel schetst hoe transgene zebrafish kan worden gebruikt voor de gehaltebepaling van zowel de Haarcel mechanosensation en de presynaptische functie in toto.

In Vivo Calcium beeldvorming van dwarslijn haarcellen in larvale zebravis

Hier presenteren we een protocol voorbeeld vorming en kwantificeren van de calcium dynamica in heterogene celpopulaties, zoals de eiland cellen van de alvleesklier. Fluorescerende verslaggevers worden geleverd in de perifere laag van cellen binnen het eilandje, die vervolgens wordt geïmmobiliseerd en imaged, en per-cel analyse van de dynamiek van de intensiteit van de fluorescentie wordt uitgevoerd.

Imaging calcium dynamica in subpopulaties van muizen pancreatic eilandje cellen

We presenteren de bereiding van acute pancreasweefselplakken en hun gebruik in confocale laserscanmicroscopie om calciumdynamica gelijktijdig te bestuderen in een groot aantal levende cellen, gedurende lange tijdsperioden en met een hoge spatiotemporale resolutie.

Confocale laserscanning microscopie van calciumdynamiek in acute pancreasweefselplakken van muizen

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor in vivo beeldvorming van de hele hersenen van larvale zebravissen met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie. De experimentele procedure omvat monstervoorbereiding, beeldacquisitie en visualisatie.

In Vivo Beeldvorming van de hele hersenen van zebravislarven met behulp van driedimensionale fluorescentiemicroscopie

Dit protocol beschrijft een methode voor de synchrone acquisitie en co-registratie van intracellulaire signaleringsgebeurtenissen en de secretie van insuline en glucagon door primaire menselijke pseudo-eilandjes met behulp van de adenovirale toediening van een cyclische adenosinemonofosfaat (cAMP) biosensor, een cAMP-verschildetector in situ (cADDis) en een microperifusiesysteem.

Menselijk pseudo-eilandsysteem voor synchrone beoordeling van fluorescerende biosensordynamica en hormoonsecretoire profielen

Hier presenteren we een protocol om twee-foton calciumbeeldvorming uit te voeren in de dorsale voorhersenen van volwassen zebravissen.

Calciumbeeldvorming met twee fotonen van de activiteit van de voorhersenen bij zich gedragende volwassen zebravissen

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om neurale activiteit te onderzoeken in hersengebieden van transgene zebravissen die GCaMP-calciumindicatoren tot expressie brengen met behulp van confocale microscopie.

In vivo Confocale fluorescentiebeeldvorming van neurale activiteit geïnduceerd door sensorische stimulatie bij gedeeltelijk ingeperkte larvale zebravissen

Leer bètacelfunctie analyseren met eencellige calciumbeeldvorming in zebrafis-eilandjes. Deze methode biedt hoge resolutie voor het bestuderen van glucose-respons en functionele heterogeniteit in vivo.

Analyse van bèta-cel functie met behulp van de resolutie van de eencellige Calcium Imaging in Zebrafish eilandjes

Meer video's verkennen