Name: Het combineren van de analyse van DNA in een ruwe Virion extractie met de analyse van RNA van besmette bladeren om te ontdekken van nieuwe Virus Genomes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: Leer een methode voor het identificeren van plantvirussen door DNA en RNA te extraheren uit besmette bladeren en next-generation sequencing toe te passen. Deze techniek verbetert de opbrengst en kwaliteit van virale DNA voor taxonomische classificatie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Onderzoek werd gefinancierd door Oklahoma Center voor de vooruitgang van wetenschap en technologie toegepast onderzoek programma fase II AR 132-053-2; en door het departement van de Oklahoma van landbouw Specialty gewassen onderzoek subsidie programma. Wij danken Dr. HongJin Hwang en de OSU Bioinformatics Core faciliteit die werd gesteund door subsidies van NSF (EOS-0132534) en NIH (2P20RR016478-04 en 1P20RR16478-02 5P20RR15564-03).

<ol><li>Dijkstra, J., Jager, C. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDijkstra%2C+J+%22Practical+Plant+Virology+%3A+Protocols+and+Exercises%22">Practical Plant Virology : Protocols and Exercises</a>. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. 1 edn (1998).</li>
<li>Roossinck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+virus+metagenomics%3A+biodiversity+and+ecology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Plant virus metagenomics: biodiversity and ecology.</a> Annu Rev Genet. 46, 359-369 (2012).</li>
<li>Melcher, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+novel+viruses+by+analysis+of+nucleic+acids+in+virus-like+particle+fractions+from+Ambrosia+psilostachya%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Evidence for novel viruses by analysis of nucleic acids in virus-like particle fractions from Ambrosia psilostachya.</a> J Virol Methods. 152 (1-2), 49-55 (2008).</li>
<li>Stobbe, A. H., Schneider, W. L., Hoyt, P. R., Melcher, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+metagenomic+data+for+viruses+using+the+e-probe+diagnostic+nucleic+Acid+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Screening metagenomic data for viruses using the e-probe diagnostic nucleic Acid assay.</a> Phytopathology. 104 (10), 1125-1129 (2014).</li>
<li>Borah, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacilliform+DNA-containing+plant+viruses+in+the+tropics%3A+commonalities+within+a+genetically+diverse+group%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Bacilliform DNA-containing plant viruses in the tropics: commonalities within a genetically diverse group.</a> Mol Plant Pathol. 14 (8), 759-771 (2013).</li>
<li>Bousalem, M., Douzery, E. J., Seal, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomy%2C+molecular+phylogeny+and+evolution+of+plant+reverse+transcribing+viruses+%28family+Caulimoviridae%29+inferred+from+full-length+genome+and+reverse+transcriptase+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Taxonomy, molecular phylogeny and evolution of plant reverse transcribing viruses (family Caulimoviridae) inferred from full-length genome and reverse transcriptase sequences.</a> Arch Virol. 153 (6), 1085-1102 (2008).</li>
<li>Geering, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Banana+contains+a+diverse+array+of+endogenous+badnaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Banana contains a diverse array of endogenous badnaviruses.</a> J Gen Virol. 86, Pt 2 511-520 (2005).</li>
<li>Kunii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+putative+DNA+virus+from+endogenous+rice+tungro+bacilliform+virus-like+sequences+in+the+rice+genome%3A+implications+for+integration+and+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of putative DNA virus from endogenous rice tungro bacilliform virus-like sequences in the rice genome: implications for integration and evolution.</a> BMC Genomics. 5, 80(2004).</li>
<li>Laney, A. G., Hassan, M., Tzanetakis, I. E. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PHYTO-12-11-0351">An integrated badnavirus is prevalent in Figure germplasm.</a> Phytopathology. 102 (12), 1182-1189 (2012).</li>
<li>Gambley, C. F., Geering, A. D., Steele, V., Thomas, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+viral+and+non-viral+reverse+transcribing+elements+in+pineapple+%28Ananas+comosus%29%2C+including+members+of+two+new+badnavirus+species%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Identification of viral and non-viral reverse transcribing elements in pineapple (Ananas comosus), including members of two new badnavirus species.</a> Arch Virol. 153 (8), 1599-1604 (2008).</li>
<li>Gayral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+Banana+streak+virus+integration+event+in+the+banana+genome+as+the+origin+of+infectious+endogenous+pararetrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">A single Banana streak virus integration event in the banana genome as the origin of infectious endogenous pararetrovirus.</a> J Virol. 82 (13), 6697-6710 (2008).</li>
<li>Lyttle, D. J., Orlovich, D. A., Guy, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+analysis+of+endogenous+badnaviruses+in+the+New+Zealand+flora%5BTitle%5D)+AND+%22AoB+Plants%22%5BJournal%5D)">Detection and analysis of endogenous badnaviruses in the New Zealand flora.</a> AoB Plants. 2011, 008(2011).</li>
<li>Le Provost, G., Iskra-Caruana, M. L., Acina, I., Teycheney, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+episomal+Banana+streak+viruses+by+multiplex+immunocapture+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Improved detection of episomal Banana streak viruses by multiplex immunocapture PCR.</a> J Virol Methods. 137 (1), 7-13 (2006).</li>
<li>Singh, K., Talla, A., Qiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+RNA+profiling+of+virus-infected+grapevines%3A+evidences+for+virus+infection-associated+and+variety-specific+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Integr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Small RNA profiling of virus-infected grapevines: evidences for virus infection-associated and variety-specific miRNAs.</a> Funct Integr Genomics. 12 (4), 659-669 (2012).</li>
<li>Alfson, K. J., Beadles, M. W., Griffiths, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+to+determining+whole+viral+genomic+sequences+including+termini+using+a+single+deep+sequencing+run%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">A new approach to determining whole viral genomic sequences including termini using a single deep sequencing run.</a> J Virol Methods. 208, 1-5 (2014).</li>
<li>Kreuze, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+viral+genome+sequence+and+discovery+of+novel+viruses+by+deep+sequencing+of+small+RNAs%3A+a+generic+method+for+diagnosis%2C+discovery+and+sequencing+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Complete viral genome sequence and discovery of novel viruses by deep sequencing of small RNAs: a generic method for diagnosis, discovery and sequencing of viruses.</a> Virology. 388 (1), 1-7 (2009).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VirusDetect%3A+An+automated+pipeline+for+efficient+virus+discovery+using+deep+sequencing+of+small+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">VirusDetect: An automated pipeline for efficient virus discovery using deep sequencing of small RNAs.</a> Virology. 500, 130-138 (2017).</li>
<li>James, A. P., Geijskes, R. J., Dale, J. L., Harding, R. M. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1744-7348.2011.00466.x">Molecular characterisation of six badnavirus species associated with leaf streak disease of banana in East Africa.</a> Annals of Applied Biology. 158 (3), 346-353 (2011).</li>
<li>Baranwal, V. K., Sharma, S. K., Khurana, D., Verma, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+analysis+of+shorter+than+genome+length+episomal+Banana+streak+OL+virus+like+sequences+isolated+from+banana+in+India%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Genes%22%5BJournal%5D)">Sequence analysis of shorter than genome length episomal Banana streak OL virus like sequences isolated from banana in India.</a> Virus Genes. 48 (1), 120-127 (2014).</li>
<li>Sukal, A., Kidanemariam, D., Dale, J., James, A., Harding, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+badnaviruses+infecting+Dioscorea+spp.+in+the+Pacific+reveals+two+putative+novel+species+and+the+first+report+of+dioscorea+bacilliform+RT+virus+2%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of badnaviruses infecting Dioscorea spp. in the Pacific reveals two putative novel species and the first report of dioscorea bacilliform RT virus 2.</a> Virus Res. 238, 29-34 (2017).</li>
<li>BÖmer, M., Turaki, A. A., Silva, G., Kumar, P. L., Seal, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequence-independent+strategy+for+amplification+and+characterisation+of+episomal+badnavirus+sequences+reveals+three+previously+uncharacterised+yam+badnaviruses%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">A sequence-independent strategy for amplification and characterisation of episomal badnavirus sequences reveals three previously uncharacterised yam badnaviruses.</a> Viruses. 8 (7), (2016).</li>
<li>Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. <a target="_blank" href="https://www.plantmanagementnetwork.org/pub/php/brief/2004/canna/">Canna yellow mottle virus detected in Canna in Florida.</a> Plant Health Progress. , August 2-4 (2004).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Canna+yellow+mottle+virus+in+a+new+host%2C+Alpinia+purpurata%2C+in+Hawaii%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Canna yellow mottle virus in a new host, Alpinia purpurata, in Hawaii.</a> Phytopathology. 107 (6), 791-799 (2017).</li>
<li>Wijayasekara, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+two+badnavirus+genomes+associated+with+Canna+yellow+mottle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Virus+Res%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of two badnavirus genomes associated with Canna yellow mottle disease.</a> Virus Res. 243, 19-24 (2018).</li>
<li>Covey, S. N., Noad, R. J., al-Kaff, N. S., Turner, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caulimovirus+isolation+and+DNA+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Caulimovirus isolation and DNA extraction.</a> Methods Mol Biol. 81, 53-63 (1998).</li>
<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual.+2nd+edn%22">Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd edn</a>. , Cold Spring Harbor Press. (1989).</li>
<li>Radford, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+next-generation+sequencing+technologies+in+virology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Application of next-generation sequencing technologies in virology.</a> J Gen Virol. 93, Pt 9 1853-1868 (2012).</li>
<li>Kanagal-Shamanna, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emulsion+PCR%3A+Techniques+and+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Emulsion PCR: Techniques and Applications.</a> Methods Mol Biol. 1392, 33-42 (2016).</li>
<li>Getts, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+blockade+in+lethal+West+Nile+virus+encephalitis+indicates+a+crucial+role+for+very+late+antigen+%28VLA%29-4-dependent+recruitment+of+nitric+oxide-producing+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Targeted blockade in lethal West Nile virus encephalitis indicates a crucial role for very late antigen (VLA)-4-dependent recruitment of nitric oxide-producing macrophages.</a> J Neuroinflammation. 9, 246(2012).</li>
<li>van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+preparation+methods+for+next-generation+sequencing%3A+tone+down+the+bias%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias.</a> Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).</li>
<li>Gel filtration principles and methods. <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma-Aldrich/General_Information/1/ge-gel-filtration.pdf">GE Healthcare</a>. , (2010).</li>
<li>Goff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+iPlant+Collaborative%3A+Cyberinfrastructure+for+Plant+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">The iPlant Collaborative: Cyberinfrastructure for Plant Biology.</a> Frontiers in Plant Science. 2, (2011).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+and+bioinformatic+approaches+to+detect+and+analyze+influenza+virus+in+ferrets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dev+Ctries%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing and bioinformatic approaches to detect and analyze influenza virus in ferrets.</a> J Infect Dev Ctries. 8 (4), 498-509 (2014).</li>
<li>Artimo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+SIB+bioinformatics+resource+portal%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: SIB bioinformatics resource portal.</a> Nucleic Acids Res. 40, Web Server issue 597-603 (2012).</li>
<li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MUSCLE%3A+a+multiple+sequence+alignment+method+with+reduced+time+and+space+complexity%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">MUSCLE: a multiple sequence alignment method with reduced time and space complexity.</a> BMC Bioinformatics. 5, 113(2004).</li>
<li>Hung, J. H., Weng, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+Alignment+and+Homology+Search+with+BLAST+and+ClustalW%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Sequence Alignment and Homology Search with BLAST and ClustalW.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2016 (11), (2016).</li>
<li>Sohpal, V. K., Dey, A., Singh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEGA+biocentric+software+for+sequence+and+phylogenetic+analysis%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Bioinform+Res+Appl%22%5BJournal%5D)">MEGA biocentric software for sequence and phylogenetic analysis: a review.</a> Int J Bioinform Res Appl. 6 (3), 230-240 (2010).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40 (15), 115(2012).</li>
<li>Dhaliwa, A. DNA extraction and purification. Mater Methods. 3, 191(2013).</li>
<li>Moeller, J. R., Moehn, N. R., Waller, D. M., Givnish, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+cellulose+DNA+isolation+improves+DNA+yield+and+quality+among+diverse+plant+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa.</a> Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).</li>
<li>Moeller, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paramagnetic+cellulose+DNA+isolation+improves+DNA+yield+and+quality+among+diverse+plant+taxa%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Paramagnetic cellulose DNA isolation improves DNA yield and quality among diverse plant taxa.</a> Appl. Plant Sci. 2 (10), (2014).</li>
<li>Grooms, K. <a target="_blank" href="https://www.semanticscholar.org/paper/Review%3A-Improved-DNA-Yield-and-Quality-from-Diverse-Grooms/b0a1299cacd7451cbbb9270caf72762379cd8e5d">Review: Improved DNA Yield and Quality from Diverse Plant Taxa</a>. , (2015).</li>
<li>Nishimori, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+antivirus+activity+of+an+anti-programmed+death-ligand+1+%28PD-L1%29+rat-bovine+chimeric+antibody+against+bovine+leukemia+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo antivirus activity of an anti-programmed death-ligand 1 (PD-L1) rat-bovine chimeric antibody against bovine leukemia virus infection.</a> PLoS One. 12 (4), 0174916(2017).</li>
<li>Rojas, M. R., Gilbertson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783540757627">Plant Virus Evolution</a>. Roossinck, M. J. 1, Springer-Verlag. 27-51 (2008).</li>
<li>Roossinck, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+big+unknown%3A+plant+virus+biodiversity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Virol%22%5BJournal%5D)">The big unknown: plant virus biodiversity.</a> Curr Opin Virol. 1 (1), 63-67 (2011).</li>
<li>Roossinck, M. J., Martin, D. P., Roumagnac, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+Virus+Metagenomics%3A+Advances+in+Virus+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Plant Virus Metagenomics: Advances in Virus Discovery.</a> Phytopathology. 105 (6), 716-727 (2015).</li>
<li>Momol, M. T., Lockhart, B. E. L., Dankers, H., Adkins, S. <a target="_blank" href="NULL">Plant Health Progress</a>. , Online (2004).</li>
<li>Eni, A., Hughes, J. D., Asiedu, R., Rey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+diversity+among+badnavirus+isolates+infecting+yam+%28Dioscorea+spp.%29%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Sequence diversity among badnavirus isolates infecting yam (Dioscorea spp.).</a> Archives of Virology. 153 (12), Ghana, Togo, Benin and Nigeria. 2263-2272 (2008).</li>
<li>Harper, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diversity+of+Banana+streak+virus+isolates+in+Uganda%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">The diversity of Banana streak virus isolates in Uganda.</a> Arch Virol. 150 (12), 2407-2420 (2005).</li>
<li>Muller, E., Sackey, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+variability+analysis+of+five+new+complete+cacao+swollen+shoot+virus+genomic+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Virol%22%5BJournal%5D)">Molecular variability analysis of five new complete cacao swollen shoot virus genomic sequences.</a> Arch Virol. 150 (1), 53-66 (2005).</li>
</ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

In de afgelopen jaren te studeren plant virus biodiversiteit in natuurgebieden waaronder verrijken voor virusachtige deeltjes (VLP) of virus specifieke RNA of DNA2,3,44, een verscheidenheid van methoden zijn tewerkgesteld 45,46 . Deze methoden worden gevolgd door NGS en bioinformatic analyse. Het doel van deze studie was om te vinden van het causaal agens van een gemeenschappelijk ziekte in een gecultiveerde plant. De ziekte werd gemeld dat het resultaat van een onbekend virus dat niet-gehuld bacilliform deeltjes heeft, en waarvoor is slechts een 565 bp fragment gekloonde47. Deze informatie was voldoende voor voorafgaande onderzoekers hypothetisch toewijzen van het virus aan het geslacht Badnavirus binnen de familie Caulimoviridae. Terwijl voorafgaande verslagen veronderstelde dat canna mottle ziekte in canna lelies het resultaat van een enkel badnavirus was, met behulp van de metagenomics-aanpak in deze studie, vastbesloten wij dat de ziekte werd veroorzaakt door de twee voorlopige badnavirus soorten24. De kracht van het gebruik van een metagenome aanpak om te ontdekken het oorzakelijke agens van een ziekte is dus dat we nu van situaties identificeren kunnen waar er mogelijk meer dan één oorzaak.
Onze benadering combineren van DNA en RNA sequencing gegevens is grondig en toont ook aan dat de resultaten met behulp van twee benaderingen consistente resultaten opgeleverd en bevestigd van de aanwezigheid van twee verwante virussen. We een gewijzigde procedure voor isolatie van de caulimoviruses in dienst en een monster dat voor virus geassocieerde nucleïnezuren werd verrijkt en die werden beschermd binnen het virus Eiwitmantel geproduceerd. Een servicelaboratorium werd gecontracteerd voor het verrichten van DNA sequencing. Het essentieel concept voor DOVO sequencing is dat DNA-polymerase bevat de TL label nucleotiden in een sjabloon bundel van DNA tijdens opeenvolgende cycli van DNA-synthese. De contigs gemonteerd gevolgd door NGS werden ingediend in een bioinformatic workflow produceren een paar contigs die werden geïdentificeerd als virus contigs. Nog een bevestiging van twee virus genomen10,24,48,49,50 werd verkregen door middel van bioinformatic analyse van RNA-seq gegevens verkregen uit RNA-preparaten ribo-uitgeput. Een interessante uitkomst was om te leren dat de bevolking van sequenties teruggevorderd met DNA en RNA sequencing voorzien soortgelijke distributies van niet-virale en virale nucleïnezuren. Voor DNA en RNA sequencing, < 0,5% van sequenties werden van oorsprong van het virus. Binnen de bevolking van virus sequenties 78-82% tot de familie Caulimoviridae behoorde. Door het vergelijken van de geassembleerde virus contigs van DNA en RNA sequencing, bevestigd we hebben dat het twee geassembleerde genoom in beide datasets plaatsgevonden.
Een punt van zorg van het gebruik van enige DNA rangschikkend om te identificeren van het nieuwe virus genoom is het genoom van de badnavirus een open circulaire DNA. Wij vermoedde dat sequenties overlappende discontinuïteiten in het genoom obstakels voor genoom montage van contigs zou kunnen voorstellen. Eerste onderzoek van het DNA rangschikkend resultaten bleek twee soortgelijke genoom van het virus. We veronderstelde dat deze genomen hetzij vertegenwoordigd genetische diversiteit van een soort die niet is onderzocht of vertegenwoordigde twee soorten mede het infecteren van dezelfde plant24. De analyse van de collectieve bioinformatic van datasets verkregen door NGS DNA en RNA sequencing, ingeschakeld dus de bevestiging van de aanwezigheid van twee volle lengte genomen.
Er is een ander verslag dat een alternatieve methode voor de extractie van VLP en nucleïnezuren van plant homogenates voor metagenomic studies, gebaseerd op procedures om te herstellen van DNA van bloemkool mosaic virus (CaMV; een caulimovirus)3ontwikkeld. Deze aanpak geïdentificeerd roman RNA en DNA-virus sequenties in niet-gekweekte planten. De stappen die zijn afgeleid van de caulimovirus isolatie procedure in deze studie gebruikt om te ontdekken het oorzakelijke agens van een ziekte van geteelde planten zijn anders dan de stappen voor het extraheren van de VLP van natuurlijk geïnfecteerde planten24afgeleid. Het succes van beide gemodificeerde methoden suggereert dat de procedure voor de isolatie van de caulimovirus kan een waardevol uitgangspunt voor metagenomic studies van plantenvirussen in het algemeen.

Opkomende plantenziektes rijden onderzoekers aan het ontwikkelen van nieuwe instrumenten voor het identificeren van de juiste causale agent(en). Eerste verslagen van nieuwe of terugkerende virusziekten zijn gebaseerd op algemeen voorkomende symptomen zoals mozaïek en misvormingen van het blad ader wissen, dwerggroei, verwelking, laesies, necrose of andere symptomen. De norm voor het melden van een nieuw virus, zoals het oorzakelijke agens voor een ziekte wil scheiden van andere contaminerende pathogenen, propageren het in geschikte host en reproduceren van de ziekte door het enten in gezonde planten van de oorspronkelijke host-soorten. De beperking in deze benadering is dat vele geslachten van plantenvirussen afhankelijk is van een insect of andere vectoren voor verzending naar een geschikte gastheer of terug naar de oorspronkelijke host-soorten. In dit geval, het zoeken naar de geschikte vector kan worden verlengd, kunnen er problemen om laboratorium kolonies van de vector en verdere inspanningen zijn nodig om het opstellen van een protocol voor experimentele transmissie. Als de voorwaarden voor succesvolle laboratoriumonderzoek naar de overdracht kunnen niet worden bereikt, dan achterblijft het werk bij de standaard voor het melden van een nieuwe virus van de ziekte. Voor virussen die zich in hun natuurlijke gastheren op zeer lage titers voordoen, moeten onderzoekers vaststellen alternatieve hosts teeltmateriaal te handhaven voldoende besmettelijke voorraden voor het uitvoeren van onderzoek. Voor soorten van het virus die alleen een paar planten infecteren kunnen dit ook een belemmering voor de teelt van voorraadculturen1.
In de afgelopen jaren wetenschappers zijn vaker in dienst van high-throughput NGS en metagenomic benaderingen te ontdekken virus sequenties die aanwezig zijn in de omgeving, die niets te maken met een bekende ziekte kan bestaan, maar kan worden toegewezen aan taxonomische soorten en geslachten 2 , 3 , 4. dergelijke benaderingen van de ontdekking en de categorisering van genetische materialen in een aparte omgeving bieden een manier om diversiteit van het virus in de natuur of hun aanwezigheid in een bepaalde ecosysteem te beschrijven, maar niet noodzakelijkerwijs bevestigt aan een kader voor het definiëren van causale agenten voor een schijnbare ziekte.
Het geslacht Badnavirus behoort tot de familie Caulimoviridae van pararetroviruses. Deze virussen zijn bacilliform in vorm met circulaire dubbele streng DNA-genoom van ongeveer 7 tot en met 9 kb. Alle pararetroviruses worden gerepliceerd via een RNA-intermediair. Pararetroviruses bestaan als episomes en onafhankelijk van de plant chromosomale DNA5,6repliceren. Veldstudies van virus bevolking erop wijzen dat deze virus populaties genetisch complex. Informatie verkregen in een heel scala van plant genomen door hoge doorvoer sequentiebepaling hebben bovendien talrijke voorbeelden van badnavirus genoom fragmenten ingevoegd plant genomen door onwettige integratie gebeurtenissen ontdekt. Deze endogene badnavirus sequenties zijn niet noodzakelijkerwijs geassocieerd met infectie7,8,9,10,11. Vervolgens het gebruik van NGS om nieuwe badnaviruses als het oorzakelijke agens van de ziekte wordt bemoeilijkt door de diversiteit van de populaties van episomal genomen, alsmede het voorkomen van endogene sequenties12,13.
Hoewel er niet een optimale pijpleiding voor de ontdekking van roman pararetrovirus genomen, zijn er twee gemeenschappelijke benaderingen om te identificeren deze virussen als causaal agenten voor ziekte. Een methode is om te verrijken voor kleine RNA-sequenties van besmette bladeren en vervolgens monteren deze sequenties te reconstrueren van het virus genome(s)14,15,16,17. Een andere benadering is de rollende cirkel versterking (RCA)-naar het versterken van de circulaire DNA-virus genoom18. Het succes van RCA, is afhankelijk van de leeftijd van het blad en de titer van het virus in het geselecteerde weefsel. De RCA-producten zijn onderworpen aan beperkingsspijsvertering en gekloond in plasmiden voor directe sequencing2120,19,.
Canna geel mottle virus (CaYMV) is een badnavirus en wordt beschreven als de etiologische oorzaak van gele mottle ziekte in canna, hoewel slechts een 565 bp fragment van het genoom eerder geïsoleerd zijn van besmette cannas22 is. Een hedendaagse studie is gebleken dat CaYMV in Alpinia purpurata (bloeiende gember; CaYMV-Ap)23. Het doel van deze studie was om te herstellen van volledige badnavirus genoom sequenties van besmette canna lelies. We beschrijven een protocol voor het zuiveren van virus vanuit plant verontreinigingen, en vervolgens isoleren viraal DNA van deze voorbereiding, en bereiden een DNA-bibliotheek voor gebruik in NGS. Deze benadering elimineert de noodzaak voor de tussenliggende moleculaire amplificatie stappen. Wij isoleren ook mRNA van geïnfecteerde planten voor RNA-seq. NGS, waarin RNA-seq werd uitgevoerd met behulp van elk preparaat van nucleic zuur. Geassembleerde contigs bleken te relateren aan het Badnavirus taxon in beide datasets met behulp van het nationaal centrum voor biotechnologie en informatie (NCBI) de zoekfunctie van fundamentele lokale uitlijning voor nucleic zuren (BLASTn). We geconstateerd dat het genoom van twee badnavirus soorten24.

<table><tbody><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich St. Louis MO</td><td>S5976</td><td>Slijpmengsel voor viruszuivering</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>S0751</td><td>Slijpmengsel voor viruszuivering</td></tr><tr><td>Na2SO3</td><td>Thermo-Fisher Waltham, MA</td><td>28790</td><td>Slijpmengsel voor viruszuivering</td></tr><tr><td>ureum</td><td>Thermo-Fisher</td><td>PB169-212</td><td>Homogenaatextractie&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>X-100</td><td>Homogenaatextractie&nbsp;</td></tr><tr><td>Kaasdoek</td><td>VWR Radnor, PA</td><td>21910-107</td><td>Homogenaat filteren&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>BP152-5</td><td>Pellet resuspenderen&amp; DNA resuspenderen buffers&nbsp;</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Spectrum, Gardena, CA</td><td>M1035</td><td>Pellet resuspenderen buffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Spectrum</td><td>E1045</td><td>Stopt enzymreacties</td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Thermo-Fisher</td><td>25530</td><td>DNA resuspenderen buffer</td></tr><tr><td>fenol:chloroform:isoamylalcohol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2069</td><td>Virion eiwitten oplossen</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Promega</td><td>M6101</td><td>Cellulair DNA uit extracten degraderen</td></tr><tr><td>95% ethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6B-100</td><td>Virus DNA precipitatie</td></tr><tr><td>Laboratoriumblender</td><td>VWR</td><td>58984-030</td><td>Bladmonsters malen</td></tr><tr><td>Vloermodel ultracentrifuge&nbsp; &amp;Ti70 rotor</td><td>Beckman Coulter, Irving TX&nbsp;</td><td>A94471</td><td>Separatie van cellulaire extracten</td></tr><tr><td>Vloermodel centrifuge en JA-14 rotor</td><td>Beckman Coulter&nbsp;</td><td>369001</td><td>Separatie van cellulaire extracten</td></tr><tr><td>Magneet roerplaat</td><td>VWR</td><td>75876-022</td><td>Ureum overnacht in monsters mengen</td></tr><tr><td>Rubber palefrenier</td><td>VWR</td><td>470104-462</td><td>Virus pellet oplossen</td></tr><tr><td>&nbsp;2100 bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent Genomics, Santa Clare, CA</td><td>G2939BA</td><td>Gevoelige detectie van DNA- en RNA-kwaliteit en -hoeveelheid</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer RNA-Picochip</td><td></td><td>5067-1513</td><td>Microfluidica chip gebruikt om RNA-kwaliteit te verplaatsen, vlekken en meten in een 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>2100 Bioanalyzer DNA-High Sensitive chip</td><td></td><td>5067-4626</td><td>Microfluidica chip gebruikt om DNA-kwaliteit te verplaatsen, vlekken en meten in een 2100 Bioanalyzer</td></tr><tr><td>Nanodrop spectrofotometer</td><td>Thermo-Fisher</td><td>ND-2000</td><td>Analyse van DNA/RNA-kwaliteit bij tussenstappen van procedures</td></tr><tr><td>Plant totale RNA isolatiekit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>STRN50-1KT</td><td>RNA isoleren voor RNA-seq</td></tr><tr><td>RNase-vrij water&nbsp;</td><td>VWR</td><td>10128-514</td><td>DNA en RNA resuspenderen voor NGS</td></tr><tr><td>RNA concentrator spinkolom</td><td>Zymo Research, Irvine, CA</td><td>R1013</td><td>RNA voorbereiden voor RNA-seq</td></tr><tr><td>rRNA verwijderingskit</td><td>Illumina, San Diego, CA</td><td>MRZPL116</td><td>RNA voorbereiden voor RNA-seq</td></tr><tr><td>DynaMag-2 Magneet</td><td>ThermoFisher</td><td>12321D</td><td>RNA voorbereiden voor RNA-seq</td></tr><tr><td>&nbsp;RNA&nbsp; verrijkingssysteem</td><td>Roche</td><td>7277300001</td><td>RNA voorbereiden voor RNA-seq</td></tr><tr><td>Agarose&nbsp;</td><td>Thermo-Fisher</td><td>16500100</td><td>Gelanalyse van DNA/RNA-kwaliteit bij tussenstappen van procedures</td></tr><tr><td>Ethidiumbromide</td><td>Thermo-Fisher</td><td>15585011</td><td>Agarose gel kleuren</td></tr><tr><td>pGEM-T +JM109 competente cellen</td><td>Promega, Madison, WI</td><td>A3610</td><td>Genoomfragmenten klonen</td></tr><tr><td>pFU Taq polymerase</td><td>Promega</td><td>M7741</td><td>Virusgenoom via PCR versterken</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Promega</td><td>U1511</td><td>Virusgenoom via PCR versterken</td></tr><tr><td>PCR oligonucleotiden</td><td>IDT, Coralvill, IA</td><td>Aangepaste bestelling</td><td>Virusgenoom via PCR versterken</td></tr><tr><td>Miniprep DNA zuiveringskit</td><td>Promega</td><td>A1330</td><td>Plasmiid DNA zuivering voorafgaand aan sequencing</td></tr><tr><td>PCR clean-up kit</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td>PCR producten voorbereiden voor cloning</td></tr><tr><td>pDRAW32 software</td><td>ACAClone</td><td></td><td>Computer analyse van circulair DNA en motieven</td></tr><tr><td>MEGA6.0 software</td><td>MEGA</td><td></td><td>Moleculair evolutionair genetica onderzoek</td></tr><tr><td>Primer 3.0</td><td>Simgene.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT&trade; RiboGreen&trade; RNA Assay Kit</td><td>Thermo-Fisher</td><td>R11490</td><td>Fluorometrische bepaling van RNA-hoeveelheid</td></tr><tr><td>GS Junior&trade; pyrosequencing Systeem</td><td>Roche</td><td>5526337001</td><td>Sequencing platform</td></tr><tr><td>GS Junior Titanium EmPCR Kit (Lib-A)</td><td>Roche</td><td>5996520001</td><td>Reagentia voor emulsie PCR</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR Bead Recovery Reagents</td><td>Roche</td><td>5996490001</td><td>Reagentia voor emulsie PCR</td></tr><tr><td>GS Junior EmPCR Reagents (Lib-A)</td><td>Roche</td><td>5996538001</td><td>Reagentia voor emulsie PCR</td></tr><tr><td>GS Jr EmPCR Olie &amp; Breaking Kit</td><td>Roche</td><td>5996511001</td><td>Reagentia voor emulsie PCR</td></tr><tr><td>GS Jr Titanium Sequenicing kit*</td><td>Roche</td><td>5996554001</td><td>Bevat sequencing reagentia, enzymen, buffers en verpakkingsbeadjes</td></tr><tr><td>GS Jr. Titanium Picotiter Plate Kit</td><td>Roche</td><td>5996619001</td><td>Sequencing plaat met bijbehorende reagentia en pakkingen</td></tr><tr><td>IKA Turrax mixer</td><td></td><td>3646000</td><td>Speciale mixer gebruikt met Turrax Tubes</td></tr><tr><td>IKA Turrax Tube (speciale mixer)</td><td></td><td>20003213</td><td>Speciale mengbuizen met interne rotor voor het maken van emulsies</td></tr><tr><td>GS Nebulizers Kit</td><td>Roche</td><td>5160570001</td><td>Nucleïnezuur grootte fractionator voor gebruik tijdens bibliotheekvoorbereidingen</td></tr><tr><td>GS Junior emPCR Bead Counter</td><td>Roche</td><td>05 996 635 001</td><td>Bibliotheek beadteller</td></tr><tr><td>GS Junior Bead Deposition Device</td><td>Roche</td><td>05 996 473 001</td><td>Houder

het combineren van de analyse van dna in een ruwe virion extractie met de analyse van rna van besmette bladeren om te ontdekken van nieuwe virus genomes

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

Deze benadering van de metagenome wordt gebruikt om plantenvirussen met circulaire DNA-genoom en hun afschriften te identificeren. Vaak plant DNA virussen die zich voordoen in lage titers in hun gastheer of niet mechanisch naar een andere host kunnen niet worden geënt zijn moeilijk te propageren om te bereiken van een grotere titer van besmettelijk materiaal. Besmette bladeren zijn grond in een milde buffer met een optimale pH en Ionische samenstelling aanbevolen voor het zuiveren van de meeste bacilliform Para retrovirussen. Ureum wordt gebruikt te breken integratie-organen die val virionen en te ontbinden van cellulaire componenten. Differentiële centrifugeren biedt verdere scheiding van virionen van verontreinigingen van de plant. Proteïnase K behandeling verwijdert vervolgens de capsids. Dan is de virale DNA geconcentreerd en gebruikt voor het rangschikken van de volgende generatie (NGS). De NGS-gegevens worden gebruikt voor het monteren van contigs die zijn voorgelegd aan NCBI-BLASTn te identificeren van een subset van virus sequenties in de gegenereerde dataset. In een parallelle pijpleiding is RNA geïsoleerd van besmette bladeren met behulp van een standaard kolom gebaseerde RNA extractiemethode. Vervolgens wordt ribosoom uitputting uitgevoerd om te verrijken voor een subset van mRNA en virus afschriften. Geassembleerde sequenties afgeleid van RNA sequencing (RNA-seq) werden voorgelegd aan NCBI-BLASTn te identificeren van een subset van virus sequenties in deze dataset. In onze studie vastgesteld we twee verwante full-length badnavirus genomen in de twee datasets. Deze methode verdient de voorkeur aan een andere gemeenschappelijke benadering die extracten van de totale bevolking van kleine RNA opeenvolgingen te reconstrueren plant virus genomic opeenvolgingen. Dit laatste metagenomic pijpleiding herstelt virus gerelateerde sequenties die zijn retro-transcriberen elementen ingevoegd in het genoom van de plant. Dit is gekoppeld aan biochemische of moleculaire testen verder onderscheiden de actief infectieuze agentia. De aanpak die is beschreven in deze studie, herstelt sequenties die representatief is voor het repliceren van virussen die waarschijnlijk actieve virusinfectie geven.

Deze gewijzigde virus zuivering methode verstrekt een verrijking van virus ANI's nuttig zijn voor de identificatie van de twee soorten van het virus door NGS en bio-informatica. Na het homogenaat was gecentrifugeerd bij 40.000 x g gedurende 2,5 h, was er een groene pellet aan de onderkant van de buis en een witte pellet over de lengte. De groene pellet was geresuspendeerde in één buis van de microcentrifuge en de witte pellet was geresuspendeerde in twee microcentrifuge-buizen. PCR werd uitgevoerd met behulp van standaard CaYMV PCR diagnostische primers en producten werden ontdekt in de ontbindend witte pellet en niet de groene pellet(Figuur 1). Een monster van het ruwe preparaat werd onderzocht door transmissie-elektronenmicroscopie en we waargenomen bacilliform deeltjes meten 124-133 nm lengte (Figuur 1B). Dit is de voorspelde modale lengte van de meeste badnaviruses. DNA werd gewonnen uit de witte en groene korrels en geresuspendeerde afzonderlijk. In Figuur 1C, hebben we geladen 5 µL van DNA geëxtraheerd uit de groene en witte pellet monster (1.6 µg van DNA voor de groene fractie) en 3.1 µg van DNA voor de witte breuk naar 0,8% agarose gel elektroforese en geanalyseerd het DNA na ethidiumbromide kleuring. De groene fractie bevatte laag molecuulgewicht DNA, overwegende dat de witte breuk geproduceerd twee bands van hoger molecuulgewicht DNA, evenals het lager molecuulgewicht DNA (Figuur 1C). De gel gepresenteerd in Figuur 1C was 40 min lopen bij 100 V en de uitstrijkjes in lane 3 suggereert dat de gel spanning moet worden verlaagd tot duidelijker bands. Deze gegevens duiden erop dat de witte pellet voor virionen werd verrijkt. De DNA (0,6 µg/mL) concentratie uit het witte monster geëxtraheerd was laag, maar geschikt voor NGS, waarvoor een minimum van 10 ng van DNA om verder te gaan. De ANI van de gefragmenteerde werden gebruikt voor het bereiden van een bibliotheek voor NGS.
Parallel, werd RNA gewonnen uit planten van de besmette canna (Figuur 1D) voor high-throughput RNA-seq. Een standaard workflow werd uitgevoerd voor de voorbereiding van de bibliotheek, NGS, contigs maken, en het identificeren van virale genoom sequenties (Figuur 1E). De uitvoerresultaten van het gebruik van DNA en RNA als grondstof werden vergeleken.
Wij verkregen 188,626 ruwe DNA leest door NGS met behulp van DNA van ruwe virus voorbereiding werd geïsoleerd. Leest werden geassembleerd in 13,269 contigs en BLASTn werd gebruikt om te zoeken van de NCBI dataset van nucleotidesequenties (met behulp van Viridplantae TaxID: 33090 en TaxID van het Virus: 10239 als de beperkende organismen) (Figuur 1E). De resultaten van de NCBI-BLASTn bleek dat 93% van DOVO gemonteerd contigs cellulaire sequenties, 22% onbekend waren, en 0,3% virus contigs(Figuur 2). De meerderheid van de contigs die zijn gecategoriseerd als cellulaire sequenties werden geïdentificeerd als mitochondriale of chloroplast DNA. Binnen de dataset van virus contigs, 32% van de contigs virus verwant waren voor leden van Caulimoviridae (die waren niet Badnavirus sequenties) en 58% van deze hadden betrekking op Badnavirus. Van de contigs van het virus, 29% waren zeer soortgelijk e < 1 x 10-30CaYMV isoleren V17 ORF3 gen (EF189148.1), suikerriet bacilliform virus isoleren Batavia D, compleet genoom (FJ439817.1), en Banana streak CA virus een compleet genoom ( KJ013511). Binnen deze populatie waren er lange contigs die leek op twee volle lengte genomen.
High-throughput RNA-seq geproduceerd 153,488 schoongemaakte individuele volgorde leest met een gemiddelde lengte van < 500 bp. aanliggend vergadering lees verminderd dit tot 8,243 contigs. Deze zijn voorgelegd aan NCBI-BLASTn (met behulp van Viridplantae TaxID: 33090 en TaxID van het Virus: 10239 als de beperkende organismen) en de uitgangen 76% van de contigs in een categorie van plant cellulaire sequenties, 23% geplaatst waren onbekend en 0,1% werden gecategoriseerd als (contigs) virus Figuur 2 B). nader onderzoek van de bevolking van de 0,1% van de bevolking van virus contigs bepaald dat 68% van deze werden toegewezen aan Caulimoviridae (Figuur 2B). Drie grote contigs binnen deze populatie werden geïdentificeerd met hoge gelijkenis (e < 1 X 10-30) te CaYMV isoleren V17 ORF3 gen (EF189148.1), suikerriet bacilliform virus isoleren Batavia D, compleet genoom (FJ439817.1) en banaan streep CA virus compleet genoom (KJ013511). Behandeling van de drie contigs, wij handmatig sloot zich aan bij twee van deze voor de productie van een full-length virusgenoom.
We vergeleken de virus genoom lengte contigs geproduceerd door DNA en RNA sequencing als een wederzijdse steiger ter bevestiging van de aanwezigheid van twee full-length virus genomen. Een full-length virusgenoom voor 6,966 bp heette voorlopig Canna geel mottle associated virus 1 (CaYMAV-1) (Figuur 3A). Het tweede genoom was 7,385 bp en een variant van CaYMV infecteren Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01) (Figuur 3A).
Ten slotte, PCR inleidingen die werden ontworpen om kloon ~ 1000 bp fragment van elk virus, werden gebruikt om het differentieel detecteren beide genomen in een populatie van 227 canna planten negen commerciële rassen vertegenwoordigen. In veel gevallen waren afzonderlijke fabrieken geïnfecteerd met beide virussen. Wij bieden een voorbeeld van de RT-PCR detectie van CaYMAV-1 en CaYMV-Ap01 in de 12 planten. Drie van deze waren positief alleen voor CaYMV-Ap01 en negen waren positief voor beide virussen (Figuur 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig1.jpg"> Figuur 1 : Virus nucleïnezuur preparaten en NGS workflow. (A) Agarose (1,0%) gel elektroforese van 565 bp PCR fragmenten van CaYMV genomen. Twee PCR producten werden ontdekt in de monsters die zijn bereid uit de witte pellet (banen 1, 2) maar niet in het groene pellet monster (lane 3). Positieve controle (+) vertegenwoordigt een PCR product versterkt uit besmette plant DNA dat werd geïsoleerd met behulp van een geautomatiseerde methode waarbij standaard paramagnetisch cellulose deeltjes. Lane L bevat de DNA-ladder gebruikt als een standaard voor het meten van de omvang van lineaire DNA bands in monster rijstroken. (B) voorbeeld van virus deeltje bekeken door Transmissie Electronenmicroscopie in de witte pellet hersteld door ruwe fractionering van besmette canna bladeren. (C) Agarose (0,8%) gel elektroforese van DNA hersteld van de green (lane 1) en wit (lane 2) pellets dat getest positief met PCR in deelvenster A. De rode en gele stippen naast lane 2 identificeren twee ultrahoog moleculair gewicht DNA bands die in de witte breuk optreden. (D) Agarose (1%) gel elektroforese van totale RNA hersteld door kolom gebaseerde RNA zuivering. Lane L bevat de DNA-ladder gebruikt als een standaard voor het meten van de omvang van lineaire bands in monster rijstroken. Lane 1-6 bevat RNA van besmette canna blaadjes die werden samengevoegd tot één sample voor ribo-uitputting en RNA-seq. (E) Schematische pijpleiding van nucleïnezuur isolatie, bibliotheek voorbereiding sequencing, aanliggend vergadering en virusgenoom geïsoleerd ontdekking. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig2.jpg"> Figuur 2 : Kroon grafieken visualiseren van de taxonomische categorieën contigs. (A) de grafiek op de linkerkant toont de overvloed en taxonomische distributie van contigs samengesteld uit de ruwe virus voorbereiding. De juiste grafiek ziet u de verhoudingen van virus contigs gekoppeld aan de Caulimoviridae familie, Badnavirus geslacht en drie nauw verwante soorten. (B) het paneel aan de linkerkant toont de overvloed van contigs afgeleid van RNA-seq gebaseerd op hun taxonomische distributie. Aan de rechterkant is de beeltenis van de overvloed van contigs binnen de bevolking van virus contigs gekoppeld aan de Caulimoviridae familie, Badnavirus geslacht en drie nauwverwante soorten grafiek. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57855/57855fig3.jpg"> Figuur 3 . Karakterisering van CaYMAV-1 en CaYMV-Ap01 genomen. (A) schetsmatig vertegenwoordiging van Canna geel mottle virus 1 koppelen (CaYMAV) en Canna geel mottle virus soortgelijk aan het genoom van geïsoleerd Alpinia purpurata (CaYMV-Ap01). Nucleotide posities 1-10 is aangemerkt als het begin van het genoom en bevat een tRNAontmoette anticodon site typisch van de meeste badnavirus genomen. De stop- en start posities voor vertaling van open leesraam (ORF) 1 en 2 zijn naast. Deze proteïnen hebben onbekende functies. ORF3 is een polyprotein met zink vinger (ZnF), protease (Pro), reverse-transcriptase (RT) en RNAse H domeinen. Een 3' poly(A) signaal reeks wordt bewaard voor beide genoom van het virus. (B) RT-PCR analyse werd uitgevoerd met behulp van RNA geïsoleerd van virus besmette bladeren en inleidingen die detecteren van CaYMAV en CaYMV-Ap01. In dezelfde populatie van 12 planten, werden drie besmet met CaYMV-Ap01, terwijl de resterende besmet waren met zowel CaYMAV als CaYMV-Ap01. (+) geeft aan positieve controle en (-) geeft aan negatieve controle. Dit cijfer is gereproduceerd/gewijzigd van Wijayasekara et al. 24 met toestemming. <a href="/files/ftp_upload/57855/57855fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.</a>

Hier presenteren we een nieuwe aanpak om te identificeren plantenvirussen met dubbele streng DNA genomen. Wij gebruiken standaard methoden uittreksel DNA en RNA van besmette bladeren en uitvoeren van de volgende generatie sequencing. Bioinformatic hulpmiddelen assembleren sequenties in contigs, identificeren van contigs vertegenwoordigen virus genomen en genomen aan taxonomische groepen toewijzen.

Het combineren van de analyse van DNA in een ruwe Virion extractie met de analyse van RNA van besmette bladeren om te ontdekken van nieuwe Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van kernvragen over de milieuvirologie, zoals het ontstaan van nieuwe ziekten. Het belangrijkste voordeel van deze methode is dat varianten worden gezuiverd van cellulaire componenten en dat deze varianten worden gebruikt om DNA te extraheren voor sequencing. Ik kwam voor het eerst op dit idee toen we ontdekten dat de planten in onze kassen geïnfecteerd waren met één of meer onbekende Badnavirussen. Personen die nieuw zijn met deze methode zullen voor drie redenen moeite hebben. Ten eerste is homogenisatie een kritische stap om kwalitatieve opbrengsten te garanderen. Ten tweede kan differentiële centrifugatie meerdere pellets produceren, waarbij men moet weten hoe deze pellets geïdentificeerd en gescheiden kunnen worden. Ten derde kan de bio-analyzer ook moeilijk te interpreteren zijn.Draag bij alle stappen van deze procedure een laboratoriumjas en handschoenen. Begin met het afknippen van 80 tot 100 gram bladeren van zieke planten die vooraf zijn ingevroren bij -20 °C. Maal de bladeren vervolgens in een Waring-blender met 200 milliliters maalbuffer en 0,5% natriumsulfiet. Overbreng het homogenaat naar een bekerglas van één liter.Voeg, terwijl u nog steeds de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt, 18 gram ureum en 25 milliliter 10% niet-ionisch detergent toe aan het homogenizaat en dek het bekerglas af met folie. Roer dit een nacht lang met een magnetische roerder. Breng het homogenizaat de volgende dag over in centrifugeflessen van 250 milliliter en centrifugeer in een vaste-hoekrotor bij 4000 ×g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten. Verzamel het supernatant en filter dit door vier lagen kaasdoek. Meet het volume van het verkregen vloeibare homogenizaat en verdeel het homogenizaat vervolgens over polypropyleen centrifugebuizen van 38,5 milliliter. Centrifugeer het homogenizaat bij 40 000 ×g bij vier graden Celsius gedurende 2,5 uur. Controleer na afloop van het centrifugeren op de aanwezigheid van een groen pellet onderaan de buis en een wit pellet langs de wand van de buis. Giet het supernatant af, waarbij beide pellets behouden blijven, en plaats de monsters op ijs.Het scheiden van het witte en het groene pellet is een van de meest uitdagende stappen in de procedure. Dit vereist geduld en vaardigheid.Gebruik in een zuurkast een rubberen politieman om de pellets te scheiden. Schraap de pellets en breng deze over naar verschillende rotorflessen. Plaats de rotorflessen met de witte pellets op ijs. Voeg één milliliter water toe aan elke fles en pipetteer dit op en neer. Pipetteer het mengsel gedurende één tot twee uur elke vijf minuten op en neer om het pellet opnieuw te suspenderen. Nadat de witte pellets zijn geresuspendeerd, worden de suspensies gedurende de nacht bewaard bij vier graden Celsius.Centrifugeer de suspensie de volgende dag bij 6000 ×g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten om het resterende debris te verwijderen. Draag de geconcentreerde suspensies over naar nieuwe buizen en centrifugeer bij 136.000 ×g bij vier graden Celsius gedurende twee uur om de virionen te pelletteren. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in één milliliter buffer.Begin deze procedure door de virionen te lyseren. Voeg 40 µL van een proteinase K-oplossing van 2 µg/µL toe aan de pellet-suspensies en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C. Voeg één volume fenol-chloroform-isoamylalcohol toe aan elk monster en schud dit 20 seconden lang handmatig.Centrifugeer bij kamertemperatuur bij 16 000 ×g gedurende vijf minuten. Verwijder de bovenste waterige fase en breng deze over naar een nieuwe buis. Herhaal deze extractie twee of meer keer.Concentreer het DNA middels ethanolprecipitatie. Gebruik 0,3 molar natriumacetaat pH 5,2 en 2,5 volumes 95% ethanol. Bewaar de monsters bij -20 °C gedurende 30 tot 60 minuten. Centrifugeer vervolgens bij 13.000 ×g gedurende 10 tot 20 minuten om het DNA te pelletteren.Resuspendeer het DNA-pellet op een laboratoriumbank in één milliliter 0,1 millimolaire TE-buffer. Filtreer de suspensie via centrifugatie door een commerciële gelfiltratiekolom. Analyseer de monsters via 1% agarosegelelektroforese met ethidiumbromide-kleuring om de preparaten te visualiseren en de kwaliteit van het DNA te beoordelen, zoals beschreven in de tekst.Bij onderzoek met transmissie-elektronenmicroscopie waren virusdeeltjes aanwezig in het witte pellet dat werd verkregen door ruwe fractionering van geïnfecteerde canna-bladeren. Agarosegelelektroforese van DNA dat werd teruggewonnen uit de groene en witte pellets identificeerde twee DNA-banden met een hoog molecuulgewicht in de witte fractie, aangegeven door de rode en gele stippen.De integriteit van het RNA dat uit geïnfecteerde bladeren was geïsoleerd, werd tevens geverifieerd via agarosegelelektroforese. Deze grafiek toont de abundantie en taxonomische distributie van contigs die zijn geassembleerd uit de ruwe viruspreparatie. En deze grafiek geeft de proporties weer van viruscontigs geassocieerd met de familie Caulimoviridae, het genus Badnavirus en contigs geassocieerd met drie nauw verwante soorten.De volgende twee grafieken tonen de abundantie van contigs afgeleid van RNA-sequencing op basis van hun taxonomische distributie. De grafiek rechts beeldt de abundantie van contigs uit binnen de populatie van viruscontigs geassocieerd met de familie Caulimoviridae, het genus Badnavirus en drie nauw verwante soorten. De vergelijking van de contigs van de virusgenoomlengte, geproduceerd door DNA- en RNA-sequencing als wederzijds scaffold, bevestigt de aanwezigheid van twee volledige virusgenomen.Ten slotte detecteerde RT-PCR-analyse met RNA dat was geïsoleerd uit virusgeïnfecteerde bladeren beide virusgenomen.Zodra deze techniek onder de knie is, kan deze twee dagen in beslag nemen, terwijl een beginner er drie dagen over kan doen. Bij het voor het eerst uitvoeren van deze procedure is het belangrijk om het volume homogenaat in elk van de supernatanten bij te houden, zodat u aan het einde van de procedure de uiteindelijke DNA-opbrengst kunt vergelijken met het initiële startmateriaal.Na de ontdekking ervan heeft deze methode in het veld van de plantvirologie de weg vrijgemaakt voor onderzoekers om nieuwe DNA-virussen in het milieu te identificeren. Na het bekijken van deze video zou u een goed begrip moeten hebben van hoe plantmateriaal gehomogeniseerd kan worden, varianten geconcentreerd kunnen worden en hoe een goede opbrengst van DNA verkregen kan worden die gebruikt kan worden voor next generation sequencing. Vergeet niet dat het werken met ureum en fenol-chloroform uiterst gevaarlijk is en dat er altijd voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen, zoals het dragen van een veiligheidsbril, handschoenen, een laboratoriumjas en een masker, wanneer u met deze chemicaliën werkt. Voor een veilige ultracentrifugatie is het belangrijk om de buisjes correct te balanceren; u dient ze daarom te wegen en tegenover elkaar in de rotor te plaatsen, waarbij het gewichtsverschil tussen de buisjes niet groter mag zijn dan 0,01 g.

combining-analysis-dna-crude-virion-extraction-with-analysis-rna-from

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie en Infectie

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 1 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 1

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 2 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 2

Protocol voor Vaccinia infectie van HeLa cellen en analyse van de gastheer en virale gen-expressie. Deel 3 beschrijft het proces van fluorescent labelen van de versterkte RNA uit zowel de gastheer en virale monsters door amino-allyl koppeling van kleurstoffen. Deel 3 van 3.

Vaccinia virus infectie en Temporele Analyse van de Virus Gene Expression: Deel 3

We beschrijven het proces van het isoleren van hoge zuiverheid herpesvirus nucleocapside DNA van geïnfecteerde cellen. De uiteindelijke DNA veroverd op oplossing is van de hoge concentratie en zuiverheid, waardoor het bij uitstek geschikt voor high-throughput sequencing, high fidelity PCR-reacties, en transfecties om nieuwe virale recombinanten te produceren.

De voorbereiding van Virale DNA van nucleocapsiden

Een eenvoudige, efficiënte en robuuste manier om de levering van meerdere virale componenten synchroniseren met plantencellen...

Eenvoudige en robuuste In vivo En In vitro Aanpak voor het bestuderen van Virus Vergadering

Single Virus Genomics (SVG) is een methode om te isoleren en versterken de genomen van enkele vironen. Virale suspensies van een gemengde assemblage worden naargelang het gebruik van flowcytometrie op een objectglaasje met discrete putjes die agarose, waardoor het vastleggen van het virion en het verminderen van het genoom afschuiving bij opwerking. Whole genome amplificatie wordt bereikt door verschillende verplaatsing amplificatie (MDA) resulterend in genomisch materiaal dat geschikt is voor...

Isolatie en Genoomanalyse van Single Virionen gebruik &#39;Single Virus Genomics&#39;

Hier wordt een protocol gepresenteerd voor het creëren van een infectieus bacterieel kunstchromosoom dat een volledige cDNA bevat van de positieve-streng genomische RNA van het Japanse encefalitisvirus. Dit protocol kan worden gebruikt om een functionele cDNA van andere positieve-streng RNA-virussen te construeren, waardoor het een krachtig genomisch hulpmiddel wordt voor het bestuderen van virusbiologie.

Bacteriële kunstmatige chromosomen: Een Functional Genomics Tool voor de Studie van Positive-streng RNA-virussen

We bieden een nieuwe strategie om virale replicatiecompartimenten (RC) te isoleren van adenovirus (Ad)-geïnfecteerde menselijke cellen. Deze aanpak vertegenwoordigt een celvrij systeem dat kan helpen om de moleculaire mechanismen die virale genoomreplicatie en -expressie reguleren, evenals de regulatie van virale-gastheerinteracties die in het RC worden gevestigd, te verduidelijken.

Isolatie van virale replicatie compartiment verrijkt Sub-nucleaire fracties uit adenovirus-geïnfecteerde normale menselijke cellen

Het doel van dit protocol is te specifiek tag en selectief isoleren viraal DNA van geïnfecteerde cellen voor de karakterisatie van het virale genoom geassocieerde eiwitten.

Zuivering van viraal DNA voor de identificatie van geassocieerde virale en cellulaire eiwitten

Hier presenteren we een diepe rangschikken benadering waarmee een onbevooroordeelde bepaling van ontluikende 3'-termini en vogelgriepvirus profielen van single-stranded DNA moleculen. De belangrijkste toepassing is de karakterisatie van ontluikende retrovirale complementaire Ani (cDNAs), de tussenproducten die tijdens het proces van retrovirale omgekeerde transcriptie gegenereerd.

Bepalende 3'-Termini en sequenties van ontluikende Single-Stranded virale DNA moleculen tijdens HIV-1 Reverse transcriptie in geïnfecteerde cellen

Dit protocol wordt beschreven hoe om virale infectie in vivo bij Drosophila melanogaster met behulp van de methode van de nano-injectie en de basistechnieken voor het analyseren van virus-gastheer interactie.

Oprichting van virale infectie en analyse van Host-Virus interactie bij Drosophila Melanogaster

Leer een methode voor het identificeren van plantvirussen door DNA en RNA te extraheren uit besmette bladeren en next-generation sequencing toe te passen. Deze techniek verbetert de opbrengst en kwaliteit van virale DNA voor taxonomische classificatie.

Het combineren van de analyse van DNA in een ruwe Virion extractie met de analyse van RNA van besmette bladeren om te ontdekken van nieuwe Virus Genomes (Video) | JoVE Journal

Het combineren van de analyse van DNA in een ruwe Virion extractie met de analyse van RNA van besmette bladeren om te ontdekken van nieuwe Virus Genomes

Meer video's verkennen