Een invasieve methode voor de activatie van de muis getand Gyrus door hoogfrequente stimulatie
2 juni 2018
Dit protocol laat zien hoe u een betrouwbare HFS-methode in muizen. Neuronen in de hippocampal getand gyrus zijn elektrisch gestimuleerd door HFS direct en niet indirect in vivo. Neuronale activiteit en moleculaire signalering zijn onderzocht door c-fos en Notch1 immunefluorescentie kleuring, respectievelijk; neurogenese wordt gekwantificeerd door bromodeoxyuridine labeling assay.
Het algemene doel van dit experiment is om het effect van hoogfrequente stimulatie op neuronale activiteit in neurogenese te observeren. Deze methode kan helpen bij het beantwoorden van belangrijke vragen over de gealigneerde cellulaire en moleculaire mechanismen van hoogfrequente diepe hersenstimulatie, zoals de inductie van neuronactiviteit en neurogenese in de hippocampus. Het voordeel van deze techniek is dat het het krachtige effect van hoogfrequente TBS op neuronactiviteit en neurogenese in de volwassen hersenen aantoont.
Hoewel deze methode inzicht kan geven in de effecten van hoogfrequente TBS op de muizen-dentate gyrus, kan het ook worden toegepast op andere systemen zoals de basale ganglia en de subthalamische regio's voor hersenaandoeningen in de kliniek. Om deze procedure te starten, plaatst u een verdoofde muis op het stereotactische frame. Lijn de oorbanden uit met het hoofd en trek ze voorzichtig aan om het gecentreerde hoofd te ondersteunen.
Pak de huid voor de oren en verwijder ongeveer een vierkante centimeter ervan over de schedel. Verwijder vervolgens het spierweefsel en andere bevestigingen boven de schedel met een wattenstaafje om het schedeloppervlak bloot te leggen. Breng vervolgens waterstofperoxide-oplossing aan om de schedel te drogen om de sagittale en lambda-naadlijnen te identificeren.
Identificeer vervolgens de bregma en lambda. Het bregma-punt zal worden gebruikt als het oorspronkelijke punt om de kernpositie in te stellen. Daarna, niveau de schedel op het horizontale vlak met behulp van deze twee punten.
Zorg ervoor dat de hoogten van deze twee punten bijna hetzelfde zijn in het dorsale ventrale vlak. Zorg er bovendien voor dat de schedel is genivelleerd in het mediale laterale vlak. Monteer vervolgens een zelfgemaakte tweedkanaals koperen microdraadelektrode in de roterende elektrodehouder op het stereotactische chirurgische frame.
Plaats de elektrode direct boven de bregma en stel deze in als oorspronkelijke site. Beweeg vervolgens de elektrode voorzichtig naar de juiste positie boven de schedel, zonder deze aan te raken. Gebruik de digitale weergave op het stereotactische chirurgische frame om de anterieure posterieure, mediale laterale en dorso-ventrale posities aan te geven.
Wanneer de gewenste site is geïdentificeerd voor de elektrode-inbreng, markeert u de positie met een zwarte stift. Gebruik vervolgens de dorso-ventrale stereotactische aanpassingen om de elektrodehouder omhoog te brengen. Steriliseer vervolgens de boortje met 70% ethanol.
Gebruik een handbediende micromanipulator-geassisteerde boor om precies op de gemarkeerde positie een boorgat te maken. Gebruik een steriele wattenstaafje om eventuele bloedingen tijdens de operatie te stoppen. Blijf boren tot de duura is blootgelegd.
Gebruik een gebogen naald om eventuele botresten die tijdens het boren zijn gegenereerd, te verwijderen en maak een pinprik op de duura zonder het onderliggende zachte hersenweefsel te beschadigen. Om te bevestigen dat het boorgat op de gewenste positie is gemaakt, laat de elektrode zakken om ervoor te zorgen dat deze soepel door het boorgat wordt ingebracht zonder enig obstakel aan te raken. Als er geen weerstand wordt gedetecteerd, brengt u de elektrode langzaam naar de doeldiepte vanaf het schedeloppervlak.
Breng vervolgens tandcement aan met behulp van een kleine spatel om de elektrode op zijn plaats te houden. Terwijl het cement dikker wordt, vorm het rond de ingebrachte elektrode en andere botschroeven om een mooie, gladde dop te vormen. Ontkoppel vervolgens de elektrode van de elektrodehouder.
Verwijder de muis van het stereotactische frame en plaats hem terug in een warme kooi. Laat de muis vrij bewegen en laat hem twee dagen in de kooi herstellen. Om stimulatie te leveren, sluit u de geïmplanteerde elektrode aan op een programmeerbare stimulator via leidingen.
Stel de software-interface in. Stel vervolgens de HFS-parameters in als zes reeksen van zes treinen van zes pulsen bij 400 Hertz en de stimulatie-intensiteit van 200 milliamps. Lever HFS gedurende de gewenste periode zoals ingesteld.
Voor de controlegroep, implanteer elektroden in de muizen zonder enige stimulatie te leveren. Voor CFAS-kleuring, stimuleer de experimentele muizen twee keer gedurende één dag. Voor BrdU-labeling, breng geschikte stimulaties toe aan zowel de acute stimulatiegroep als de chronische stimulatiegroep.
Zorg tijdens de stimulatie dat de muis wakker is. Denk eraan om ervoor te zorgen dat de leidingen niet zijn gedraaid. Wanneer de stimulatie is voltooid, koppelt u voorzichtig de elektrodepinning los van de elektrodehouder in de connector van het opnamesysteem.
Voor de CFAS en notch één kleuring, anesthetiseer de muizen ongeveer drie uur na de laatste HFDBS door pentobarbital te injecteren om een chirurgisch niveau van anesthesie te bereiken. Voor BrdU-labeling, geeft u ongeveer 12 uur na de laatste HFDBS-stimulatie zes injecties van BrdU aan de controle- en gestimuleerde muizen met tussenpozen van twee uur. 36 uur na de laatste injectie, anesthetiseer de muizen diep met pentobarbital en profuseer het transcardiaal met 50 milliliter koud PBS gevolgd door 50 milliliter koud 4% paraformaldehyde.
Verwijder het hoofd en maak een incisie in de huid om de schedel bloot te leggen. Gebruik een pincet om de schedel lichtjes af te schrapen en verwijder voorzichtig de hele hersenen. Bevestig vervolgens de hersenen in 4% paraformaldehyde gedurende een extra twee dagen en breng het over in 30% sucrose-oplossing bij vier graden Celsius voor een nacht.
Gebruik een cryostaat om de hersenen in 20 micron coronale secties te snijden. Breng en monteer de secties over naar het glazen plaatje met een borstel en bewaar ze bij min 20 graden Celsius. Breng vervolgens de dia's over in normale PBS zonder fixatiemiddel.
Was de secties drie tot vier keer gedurende vijf minuten elk met PBS om eventueel overtollig fixatiemiddel te verwijderen. Voor de BrdU-gelabelde groep, incubeer de secties in twee molaar HCL gedurende 30 minuten bij 37 graden Celsius en spo
Bekijk het volledige transcript en krijg toegang tot duizenden wetenschappelijke video's
Overzicht
Deze studie beschrijft een protocol om de effecten van hoogfrequente stimulatie (HFS) op de neuronale activiteit en neurogenese in de hippocampus van muizen te onderzoeken. Er wordt belicht hoe HFS de moleculaire signalering en neuronale activiteit beïnvloedt middels specifieke kleuringsmethoden.
Belangrijkste componenten van de studie
Wetenschappelijk vakgebied
- Neurowetenschappen
- Neurogenese
- Elektrofysiologie
Achtergrond
- Hoogfrequente stimulatie (HFS) kan de neuronale activiteit en neurogenese beïnvloeden.
- De gyrus dentatus van de hippocampus is essentieel voor het begrijpen van deze processen.
- Moleculaire signaleringsmechanismen kunnen worden beoordeeld met behulp van specifieke immunofluorescente kleuringstechnieken.
- Deze methode kan worden uitgebreid naar andere hersensystemen die relevant zijn voor klinische aandoeningen.
Doel van de studie
- Om de effecten van HFS op neuronale activatie en neurogenese in een muismodel te beoordelen.
- Om de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen geassocieerd met hoogfrequente diepe hersenstimulatie te onderzoeken.
- Om inzichten te verschaffen die niet alleen van toepassing zijn op neurogenese, maar ook op andere regio's die betrokken zijn bij hersenstoornissen.
Gebruikte methoden
- In vivo HFS-protocol bij geanestheseerde muizen.
- Elektroden worden geïmplanteerd in de gyrus dentatus van de hippocampus.
- Gebruik van immunofluorescentiekleuring voor c-fos en Notch1 om neuronale activiteit te beoordelen.
- Bromodeoxyuridine (BrdU)-labelingsassay om neurogenese te kwantificeren.
- De tijdlijn omvat meerdere fasen, waaronder herstel, stimulatie en post-stimulatieanalyse van hersenweefsels.
Belangrijkste resultaten
- Elektrische stimulatie resulteerde in significante veranderingen in de neuronale activiteit, zoals aangetoond door c-fos-expressie.
- Notch1-signalering werd gelinkt aan neurogenese als reactie op HFS.
- BrdU-labeling leverde kwantificeerbaar bewijs voor neurogenese onder gedefinieerde stimulatiecondities.
- De vastgestelde methodologie biedt een kader voor verdere exploratie van de effecten van hersenstimulatie in neurologisch onderzoek.
Conclusies
- Deze studie demonstreert het nut van HFS voor het onderzoeken van neuronale mechanismen in de hippocampus.
- Inzicht in de relatie tussen neuronale activiteit en neurogenese kan implicaties hebben voor de behandeling van neurologische aandoeningen.
- De resultaten ondersteunen de ontwikkeling van HFS-toepassingen in diverse hersenmodellen, wat onze kennis over neuronale plasticiteit vergroot.
Veelgestelde vragen
Industriële relevantie voor directie
Deze methode maakt een mechanistische risicoreductie van hoogfrequente diepe hersenstimulatie (HF-DBS) mogelijk door stimulatieparameters te koppelen aan kwantificeerbare neurogene en neuronale activiteitsuitkomsten in een ziekte-relevant systeem. Het ondersteunt de validatie van targets en de ontwikkeling van assays voor neuropsychiatrische indicaties, zoals een majeure depressieve stoornis en obsessieve-compulsieve stoornis, door voorspellende zekerheid te bieden voor downstream translationele trajecten. De aanpak vestigt een preklinisch model voor het evalueren van biologische effecten van neuromodulatie voorafgaand aan de identificatie van leads of het verder brengen van klinische kandidaten.
Strategische Toepassingen in Biofarmaceutisch R&D
Vroege Ontdekking & Targetvalidatie
- Wetenschappelijke waarde: Onderzoekt therapeutische hypothesen door c-fos- en Notch1-signalering te meten als indicatoren voor neuronale activatie en padmodulatie.
- Operationele waarde: Maakt functionele target-validatie mogelijk door kwantificering van BrdU-gelabelde neurogenese in de gyrus dentatus, een ziekterelevant systeem voor hippocampale stoornissen.
- Voorspellende waarde: Ondersteunt het voorspellend vertrouwen door dosis-responsrelaties vast te stellen tussen stimulatiefrequentie, duur en neurogene output.
Screening & Assayontwikkeling
- Klaarheid voor assay: Bereidt gestandaardiseerde hersensnede-preparaten voor voor immunofluorescentiekleuring, wat reproduceerbare kwantificering van c-fos, Notch1 en BrdU als gemultiplexte read-outs mogelijk maakt.
- Kwantitatieve output: Levert meetbare afhankelijke variabelen (celgetallen, fluorescentie-intensiteit) die assay-standaardisatie en vergelijkingen tussen groepen ondersteunen.
- Schaalbaarheid van screening: Faciliteert de voorbereiding van gevalideerde biologische systemen voor downstream screening van verbindingen of modulatoren in chronische stimulatieparadigma's.
Translationeel & Preklinisch Onderzoek
- Relevantie voor ziektebeeld: Modelleert veranderingen in de hippocampale neurogenese die relevant zijn voor majeure depressieve stoornis en cognitieve comorbiditeiten bij neuropsychiatrische indicaties.
- Translationele continuïteit: Slaat een brug tussen acute en chronische stimulatieparadigma's om vertraagde neurogene reacties te beoordelen, wat een weerspiegeling is van klinische tijdlijnen van therapeutisch begin.
- Mechanische risicoreductie: Verduidelijkt of waargenomen gedragseffecten voortkomen uit neurogenese versus acute neuronale activatie, waardoor ambiguïteit in target engagement wordt verminderd.
Integratie van Pipeline & Workflow
De methode past binnen het ontdekkingscontinuüm, van het testen van doelwithypothesen tot preklinische validatie, in het bijzonder voor neuromodulatiestrategieën die zich richten op hippocampale circuits bij stemmings- en cognitieve stoornissen.
- Ontdekkingsbiologie: Ondersteunt hypothese-testen door de gyrus dentatus te isoleren als een locatie van stimulatie-geïnduceerde neurogene en transcriptionele respons.
- Screening: Maakt assay-ontwikkeling mogelijk voor verbindingen die HF-DBS-geïnduceerde neurogenese kunnen potentiëren of nabootsen via BrdU- en Notch1-readouts.
- Analytica: Levert kwantitatieve afhankelijke variabelen (BrdU+ celdichtheid, c-fos+ neuronpercentage) voor statistische vergelijking tussen stimulatiegroepen.
- Translationeel onderzoek: Verbindt stimulatieprotocollen met ziekterelevante neurogene uitkomsten, ter ondersteuning van risico-gecorrigeerde beslissingen voor verdere ontwikkeling.
- Bedrijfsbrede herbruikbaarheid: Vestigt een herbruikbaar chirurgisch en kleuringsplatform dat toepasbaar is op andere hersengebieden (bijv. basale ganglia, nucleus subthalamicus) voor indicatie-uitbreiding.
Operationele & Bedrijfsimpact
- Wetenschappelijke waarde: Vermindert mechanische ambiguïteit door stimulatie te koppelen aan gedefinieerde moleculaire (Notch1) en cellulaire (BrdU, c-fos) eindpunten.
- Operationele waarde: Standaardiseert de implantatie van elektroden, de toediening van stimulatie en de weefselverwerking voor een reproduceerbare neurogene beoordeling tussen verschillende laboratoria.
- Strategische waarde: Verbetert go/no-go-beslissingen door vroegtijdig bewijs te leveren van target engagement en de omvang van het biologische effect.
- Impact op portfolio: Maakt risico-gecorrigeerde prioritering van neuromodulatiebenaderingen mogelijk op basis van gevalideerde neurogene en signaleringsresultaten.
Overwegingen voor implementatie
- Vereist expertise in stereotactische chirurgie, elektrofysiologie en histologische verwerking voor immunofluorescentiekleuring.
- Afhankelijk van instrumentatie, waaronder stereotactische frames, programmeerbare stimulatoren, cryostaten en fluorescentiemicroscopiesystemen.
- Noodzaak tot standaardisatie tussen teams van stimulatieparameters, BrdU-doseringsschema's en antilichaamvalidatie voor consistente resultaten.
- Omvat overwegingen voor aanpassingen bij het targeten van niet-hippocampale regio's vanwege anatomische variabiliteit in elektrodeplaatsing en weefseltoegankelijkheid.
- Praktische beperkingen omvatten variabiliteit in overlevingschirurgie, subjectiviteit bij de kwantificering van kleuringen en de noodzaak van sham-gestimuleerde controles om stimulatiespecifieke effecten te isoleren.
